全 文 ：海洋科学/2008年/第 32卷/第 3 期
蛋白核小球藻核酮糖-1 ,5-二磷酸羧化/加氧酶小亚基部分基因
序列的克隆与分析
孙　雪 , 马　斌 , 周成旭
(宁波大学 海洋生物工程重点实验室 ,浙江 宁波 315211)
摘要:以单细胞绿藻蛋白核小球藻(Chlorel la py renoidosa)(藻株编号为 NMBluh015-1)为实验材料 ,利用几
种绿藻中的核酮糖-1 , 5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)的小亚基(r bcS)的保守序列 , 设计简并引物 , 克隆到
rbcS 的一条 cDNA(245 bp)和 3 条 DNA 序列(其编号为 CP1、CP2 和 CP3 , 长度依次为 1 425 bp、810 bp 、
705 bp)。序列比较结果表明 ,该蛋白核小球藻 rbcS cDNA 核苷酸序列与普通小球藻(C.vulgaris)、杜氏藻
(Dunalie lla tertiolecta)(rbcS1和 rbcS2)及蛋白核小球藻“太阳小球藻”株的相似性依次为 93%、92%(91%)
和 90%,而其编码的氨基酸序列与杜氏藻相似性最高(80%);3 条 rbcS DNA 序列与绿藻及高等植物 r bcS 部
分序列表现了较高的同源性 ,其中 2 条 DNA(CP2和 CP3)部分区段同源性很高。实验结果表明扩增得到的
cDNA 和 DNA 序列为蛋白核小球藻 rbcS 基因。
关键词:蛋白核小球藻(Chlorella py renoidosa);小亚基(r bcS);克隆;同源性
中图分类号:Q781　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1000-3096(2008)03-0040-04
　　核酮糖-1 , 5-二磷酸羧化/加氧酶(ribulose-1 , 5-
bisphosphate carboxy lase/oxylase ,简写为 Rubisco)
广泛存在于绿色植物 、藻类和某些光合细菌中 ,是重
要的光合作用限速酶 。该酶具有催化 CO 2的固定和
二磷酸核酮糖加氧反应的双重功能 ,是自然界中丰
度最大 、植物体内含量最高的可溶性蛋白之一。常
见的 Rubisco全酶由 8个大亚基(rbcL)和 8个小亚
基(rbcS)组成 ,其中大亚基主要起固定 CO 2的催化
作用 ,而小亚基则起着影响酶的催化效率 , 以及
CO 2/O 2的专一性结构区域的作用[ 1] 。近年来 , rbcS
基因的结构 、功能 、基因表达和启动子活性等方面的
研究报道很多[ 2 ～ 4] ,已经成为植物光合作用和基因工
程研究的热点。在单细胞绿藻中 ,杜氏藻(Dunaliel-
la tertiolecta)、微绿球藻(Nannochloris bacil laris)
和莱茵衣藻(Chlammydomonas reinhard ti i)已有关
于 rbcS 的种类 、cDNA 和 DNA 全序列的研究报
道[ 5 ～ 7] 。而小球藻的相关报道极少 , GenBank 数据
库中仅收录了 2条 rbcS 的 cDNA序列。
小球藻是一种具有重要经济价值的单细胞绿
藻 ,已广泛应用于保健食品 、水产养殖饵料和医药 、
食品等领域。小球藻光合效率高 ,在光合作用机理 、
跨膜转运机理等研究方面已成为一种很好的模式
藻[ 8] 。对小球藻光合作用酶 Rubisco 的基因序列进
行研究 ,有利于从分子水平了解绿藻的光合代谢途
径和机理 ,以及光合作用进化规律 、叶绿体发育等理
论问题。已有研究表明小亚基可能是基因工程改进
Rubisco 催化效率的具有成效的靶点[ 9] 。因此 ,本研
究以小球藻属的蛋白核小球藻(Chlorel la py renoid-
osa)为实验材料 ,根据相关绿藻 rbcS 核苷酸保守序
列设计引物 , 克隆了该小球藻 rbcS 的 cDNA 和
DNA部分序列 ,以期为 rbcS 基因全序列的获得 ,进
而为蛋白核小球藻 rbcS 结构的阐明和功能的解释
提供资料。
1　材料与方法
1.1　蛋白核小球藻
蛋白核小球藻来自宁波大学海洋生物工程实验
室 ,编号为 NMBluh015-1。培养条件为 MAV3号海
水培养基 ,温度为 25℃,光强为 2 000 lx ,光暗周期为
12L ∶12D 。
1.2　试剂与引物
UNIQ-10柱式细菌 RNA 抽提试剂盒 、UNIQ-
10柱式细菌基因组 DNA抽提试剂盒 、AMV 第一链
cDNA 合成试剂盒 、PCR试剂等均购自上海生工生
物工程有限公司;大肠杆菌(Escherichia coli)JM109
菌株购自北京微生物研究所;载体 pMD18-T 购自大
连宝生物工程有限公司;PCR产物回收试剂盒BioSpin
收稿日期:2007-06-18;修回日期:2007-09-22
基金项目:国家自然科学基金项目(30700610);浙江省教育厅项目
(20040899);宁波市自然科学基金项目(2006A610084)
作者简介:孙雪(1974-),女 , 山东烟台人 , 副研究员 ,博士 , 研究方向:
藻类分子生物学 ,电话:0574-87600170 , E-mai l:sun xue@nbu.edu.cn
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Marine Sciences/ Vol.32 , No.3/ 2008
Gel Ex traction ki t 购自杭州昊天生物技术有限公
司;引物 RF:5′-G T(G/C/T)TGG N(A/C/G)(G/
C/T)CC(C/G)(G/A/T)T(G/C/ T)(A/G)AC
AAC AAG-3′, RR:5′-G TG CA(G/T/A)CC(G/A)
AAC A T(G/T)GG(C/G)AG(C/T)T T-3′,均由
上海生工生物工程有限公司合成。
1.3　RNA 的提取 、第 1 链 cDNA 的合成和
PCR扩增
取 15 mL 对数生长期的藻细胞 , 6 000 r/min离
心 8 min 收集藻体 。按试剂盒操作提取藻细胞总
RNA 。电泳检测 RNA 质量后立即进行反转录反
应 ,然后以此 cDNA 作为模板进行 PCR扩增(Perkin
Elmer 9600 PCR仪)。PCR总反应体积为 20 μL ,其
中模板为 1 μL , MgCl2为 1.5 mmol/L , dNTP 为
0.2 mmol/ L ,引物为 0.2 μmo l/L , Taq 酶 1 单位。
PCR扩增程序为 94℃预变性 5 min ,接着按 94℃变
性50 s ,48℃复性1 min , 72℃延伸1 min的程序进行
30个循环。循环结束后 , 72℃延伸 8 min。将 PCR
产物在质量分数为 1.2%琼脂糖凝胶上电泳 ,紫外透
射分析仪上测定结果 。
1.4　DNA 的提取与 PCR扩增
取 1.0 mL 对数生长期的藻细胞 , 6 000 r/min
离心 8 min ,收集藻体。按试剂盒说明提取藻细胞
DNA ,用 30 μL缓冲液洗脱 DNA 。PCR扩增反应总
体积为 20 μL ,其中模板 DNA 为 2 μL , MgCl2为 1.5
mmol/ L ,dNTP 为 0.2 mmol/L ,引物为 0.2 μmol/ L ,
Taq 酶1单位。PCR扩增程序为 94℃预变性 5 min ,
然后按 94℃变性 50 s , 52℃复性 1 min , 72℃延伸
1 min的程序进行 30 个循环 ,循环结束后 72℃延伸
8 min。然后 ,将 PCR产物在 1.0%琼脂糖凝胶上电
泳 ,在紫外透射分析仪上测定结果 。
1.5　PCR产物的回收与克隆
先用 PCR产物回收试剂盒进行PCR产物回收 ,
再将回收后片段与 pMD18-T 载体连接 ,最后转化感
受态 E.coli JM 109细菌。挑选菌落进行 PCR扩增
检测重组子。
1.6　测序与序列分析
将扩增培养后的含插入片段的重组菌落送上海
生工生物工程有限公司测序 。序列分析软件有
ClustalW 和 BioEdi t。
2　结果
2.1　rbcS cDNA 序列比较
以蛋白核小球藻总 RNA 经反转录合成的第 1
链 cDNA 为模板 ,扩增得到长度约 250 bp 的 rbcS
cDNA 部分片段(图 1)。克隆测序后确定其准确长度
为 245 bp ,该序列的 GenBank登录号为 EU121232。在
GenBank数据库中进行 blastn查询 ,发现该 rbcS 序
列与杜氏藻的 2条 rbcS 部分序列(约 100 bp)相似
性分别为 92%和 91%;而与同属的普通小球藻
(C.vulgaris)及同种的蛋白核小球藻“太阳小球藻”
株部分序列(约 50 bp)的相似性分别为 93%和
90%。将 rbcS的 cDNA 序列翻译成氨基酸序列(图
2), 在 GenBank 数据库中进行了 blastx 查询 。
Blastx 比较结果显示最相似的几种绿藻的登录号和
相似性依次为杜氏藻 80%,卡尔团藻(Volvox cart-
eri)80%,莱茵衣藻 79%,雨生红球藻(Haematococ-
cus pluv ial is)76%,盐生杜氏藻(D.salina)75%,微
绿球藻 70%,伞藻(Acetabularia cl i f toni i)70%及蛋
白核小球藻“太阳小球藻”株 68%。
图 1　蛋白核小球藻 rbcS cDNA 片段
Fig.1　Par tial cDNA fragment of rbcS from Chlorella p y re-
noidosa
M.DL2000 marker;1.rbcS cDNA
图 2　蛋白核小球藻 rbcS cDNA 部分核苷酸序列及推断的氨基酸序列
Fig.2　The par tial nucleo tide and deduced amino acid sequences of rbcS cDNA from Chlorella py renoidosa
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海洋科学/2008年/第 32卷/第 3 期
2.2　rbcS DNA 序列分析
以蛋白核小球藻基因组 DNA 为模板 ,用上述设
计的简并引物进行 PCR扩增 ,结果在琼脂糖凝胶上
可见 3条亮带(图3),其中最长一条带接近 1 500 bp ,
图 3　蛋白核小球藻 r bcS DNA 片段
Fig.3　Pa rtial DNA f ragments of rbcS fr om Chlorella
M.DL2000 marker;1.rbcS DNA
而较短的两条带长度分别在 700 bp和 800 bp左右 。
将这 3条带按照长度从大到小 ,依次编号为 CP1 、
CP2和 CP3 , 测序后确定其长度分别为 1 425 bp 、
810 bp和 705 bp。
经 blastn 查询 ,扩增得到的 3 条 rbcS DNA 与
高等植物和绿藻 rbcS 同源 ,但同源性片段都比较
短 ,不超过 70 bp。其中 CP1与蛋白核小球藻“太阳
小球藻”株及莱茵衣藻的相似性最高 , 均为 97%;
CP2与杜氏藻和蛋白核小球藻“太阳小球藻”株的相
似性分别为 95%和 93%;CP3 与杜氏藻 、衣藻
(Chlamydomonas sp.)及微绿球藻的相似性分别为
95%、91%和 90%。
由于最长的 CP1序列与 CP2 、CP3 比较后同源
性很低 ,只将 CP2和 CP3两条带进行了比较。将相
差 105 bp的 CP2和CP3进行对齐 ,发现这两条序列
的同源性很高 ,在高保守区段相似性高达 98.0%
(459个碱基中仅有 9个不同),见图 4。
图 4　蛋白核小球藻 2条 rbcS DNA 序列(CP2 和 CP3)的对齐
Fig.4　The alignment of two rbcS DNA sequences of CP2 and CP3 from Chlorella py renoidosa
3　讨论
3.1　引物的设计
柴玉荣等[ 10] 根据莱茵衣藻 、团藻 、玉米等真核生
物 Rubisco 的 rbcS 氨基酸高度保守序列:ETR-
SYLPP 和 MNKLPMFG ,设计了一对简并引物 ,并
克隆得到盐生杜氏藻 rbcS 部分 209 bp的 cDNA 片
段 。而在本研究中 ,将几种绿藻 rbcS 的氨基酸序列
进行对齐 ,以寻找其保守序列进行引物设计 ,这几种
绿藻包括杜氏藻(2 条)、盐生杜氏藻 、卡尔团藻(3
条)、微绿球藻和地中海伞藻 ,可以找到几段保守性
区域。但如果再把普通小球藻加上去 ,其保守性降
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Marine Sciences/ Vol.32 , No.3/ 2008
低 ,很难找到 2 段可用于引物设计的氨基酸保守序
列。于是 ,又将包括普通小球藻在内的几种绿藻
rbcS的核苷酸序列进行了对齐 ,找到了可用于引物
设计的区段。
本实验利用上述设计的简并引物扩增得到了
rbcS cDNA 部分序列 。并且由于这 2条引物序列间
未被内含子隔开 ,因此也扩增得到了 3条 rbcS DNA
部分序列 。
3.2　小球藻 rbcS 的特性
小球藻 rbcS 编码氨基酸序列与其它单细胞绿
藻相比 ,其同源性很低 。从 rbcS 序列长度上来比
较 ,GenBank收录的唯一 1条普通小球藻 rbcS(其编
码氨基酸数目为 214),比其它单细胞绿藻都要长 ,如
杜氏藻 、微绿球藻等的开放读码框在 180 ～ 190 aa ,
而衣藻 rbcS编码 140 aa 。由此可推断 ,小球藻 rbcS
可能比其它单细胞绿藻更复杂些。
由本实验结果推断 ,小球藻中可能存在 3 条不
同的 rbcS 基因 ,这一点与其它绿藻中 rbcS 有 2 ～ 3
个拷贝数相类似。如微绿球藻中有 3条 rbcS 序列:
NbrbcS1-1 、NbrbcS1-2和 NbrbcS2 ,其中前 2条的相
似性大 ,且与 NBrbcS2相差较远[ 5] ;卡尔团藻中也有
3条 rbcS序列:V c1 、V c2和 Vc3;而杜氏藻中有 2条
rbcS序列[ 6] ;莱茵衣藻中也有 2条 rbcS 序列[ 7] 。要
进一步确定小球藻中 rbcS 序列的确切数目 ,可以用
本实验克隆到的部分 DNA 或 cDNA序列 ,做探针进
行 Southern杂交 。
要阐明小球藻的光合作用关键酶 Rubisco 的作
用机理和代谢途径等理论问题 ,需要从分子水平对
其基因序列和结构有清晰地认识 。本研究利用 rbcS
序列的保守性 ,设计了一对简并引物 ,得到了 rbcS
部分 cDNA 和 DNA 序列 , 下一步的工作是进行
cDNA和 DNA的更长序列 ,一直到 rbcS 完整的编码
序列和全长 DNA 序列的获得 。然后 ,用这些全序列
进行比较和分析 ,确定小球藻 rbcS 内含子的数目 、
内含子/外显子的结构 、编码氨基酸序列信息等。目
前 ,本课题组已经开始通过基因组步移的方法 ,来进
行 2条 rbcS(CP2 和 CP3)上下游未知序列的克隆 ,
同时 cDNA完整编码序列的克隆工作也在进行中 。
参考文献:
[ 1] 　Spreitzer R J.Role o f the small subunit in ribulo se-1 ,
5-bisphosphate carboxylase/ oxygena se[ J] .Archives of
Biochemistry and Biophysics , 2003 , 414(2):141-149.
[ 2] 　Chai Y R, Wang Y F , Wang T Y , et al .Cloning and
prokar yo tic expr ession o f rbcS gene f rom Dunaliella
salina[ J] .Journal of Sichuan University , 2005 , 42(4):
818-821.
[ 3] 　Kanevski I , Maliga P , Rhoades D F , et al .P lastome
eng ineering of ribulose-1 , 5-bisphospha te carboxy lase/
oxygenase in tobacco to form a sunflow er lar ge subunit
and tobacco small subunit hybrid[ J] .Plant Physiol ,
1999 , 119(1):133-141.
[ 4] 　Kovar J L , Zhang J , Funke R P , et al.Molecular analysis
of the acetolactate synthase gene of Chlamydomonas rein-
hardtii and development of a genetically eng ineered gene as
a dominant selectable marker fo r genetic transformation
[ J] .Plant J , 2002 , 29(1):109-117.
[ 5] 　Yamazaki T , Yamamo to M , Sakamoto W , et al .Isola-
tio n and molecular char acte rization of rbcS in the unicel-
lula r g reen alga Nannochloris bacillaris[ J] .Phycologi-
cal Research, 2005 , 53(1):67-76.
[ 6] 　Walker T L , Becker D K , Collet C.Characterisation of the
Dunaliella tertiolecta RbcS genes and their promo ter
activity in Chlamydomonas reinhardtii[ J] .Plant Cell
Rep, 2005 , 23(10-11):727-735.
[ 7] 　Go ldschmidt-Clermont M , Rahire M.Sequence , evolu-
tio n and differential e xpression of the two genes enco-
ding variant small subunits o f ribulose bisphosphate
carboxylase/ oxygenase in Chlamydomonas reinhard ti i
[ J] .J Mol Biol , 1986 , 191(3):421-432.
[ 8] 　王义琴 , 尹良宏 , 王鹏 , 等.小球藻的分子生物学研究
进展[ J] .遗传 , 2004 , 26(3):399-402.
[ 9] 　Du Y C , H ong S , Spreitzer R J.RbcS suppressor mu-
tations improve the the rmal stability and CO2/ O2 speci-
ficity of rbcL-mutant ribulose-1 , 5-bispho sphate ca rbox-
ylase/ oxygena se[ J] .Proc Natl Acad Sci USA , 2000 , 97
(26):14 206-14 211.
[ 10] 　柴玉荣 , 陈华艳 , 王天云 , 等.杜氏盐藻 rbcS 基因
cDNA 片段的克隆与序列分析[ J] .郑州大学学报 ,
2005 , 40(2):248-250.
(下转第 48页)
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海洋科学/2008年/第 32卷/第 3 期
The sources and deposition of three trace nutritional elements
Fe , Mn and Cu in the atmospheric particulate
YU Xin-an , WENG Huan-xin , ZHANG Xing-mao , CHEN Li-hong , CHEN Xiang-hua
(Insti tute of Environment &Biogeochemist ry , Zhejiang U niversi ty , Hangzhou 310027 , China)
Received:Sep., 18 , 2005
Key words:a tmospheric pa rticulate;Fe;M n;Cu;source;particle size;atmosphe ric depo sition
Abstract:That atmospheric depo sitio ns of the three t race nutri tional elements are regarded as an impor tant
source of the w ater body is o f ten neg lected.In this study the concentrations of the TSP and the three trace
elements Fe , Mn and Cu were detected , and the dist ribution of the particle size w as analyzed by scanning
elect ron microscope , then the sources and the deposi tions o f the three t race elements w ere analyzed.The
results show ed that Fe and M n mainly o rig inated f rom the earth s crust , but Cu mainly originated f rom
man-made pollution , and the significant cor relation w as determined between Fe and M n.Most of the
part icle sizes were less than 9 μm , The w et deposit ions of Fe and M n were higher than the dry deposi tion ,
but for Cu , it w as opposi te.
(本文编辑:张培新)
(上接第 43页)
Cloning and analysis of rbcS partial gene sequences from Chlo-
rella pyrenoidosa
SUN Xue , MA Bin , ZHOUCheng-xu
(Marine Bio technolog y Laboratory of Ningbo University , Ningbo 315211 , China)
Received:Jun., 18 , 2007
Key words:Chlorella py renoidosa ;r bcS;cloning;homology
Abstract:In this paper , the rbcS genes f rom the unicellular g reen alga Chlorel la p yrenoidosa NMBluh015-
1 we re cloned and analyzed.Methods:One pair of degenerate primers specific fo r rbcS w as designed acco rd-
ing to the conserved rbcS nucleo tide sequences f rom other unicellula r green alg ae.Then , one rbcS cDNA
(245bp)and three DNA (named as CP1 , CP2 and CP3 wi th leng th of 1425bp , 810 bp and 705bp , respec-
tively)sequences were PCR amplified , cloned and sequenced from C.py renoidosa NMBluh015-1.Results:
The nucleotide sequence of rbcS cDNA was similar to tho se of C.vulgaris , Dunaliella tertiolecta and
“SUN CHLORELLA” st rain of C.py renoidosa with ident ities of 93%, 92%(91%)and 90%, respective-
ly .Howeve r , the deduced amino acid o f rbcS cDNA had the highest ident ity of 80% to D.tertiolecta.The
three rbcS DNA sequences showed high homology wi th those of o ther g reen alg ae and higher plants , o f
w hich CP2 sequence shared mo re similar to CP3 than to CP1.Conclusion:The par tial rbcS sequences f rom
C.py renoidosa NMBluh015-1 w ere obtained.
(本文编辑:康亦兼)
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