全 文 ：华 南 理工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 )
第 36卷 第 12期 JournalofSouthChinaUniversityofTechnology Vol.36 No.12
2008年 12月 (NaturalScienceEdition) December 2008
文章编号:1000-565X(2008)12-0097-05
收稿日期:2008-03-28
＊基金项目:国家自然科学基金 -广东省自然科学基金联合基金重点项目(U0633009);国家科技部 “十一五”科技支撑计划
项目(2006BAD27B03);广东省科技攻关项目(20052050166);广州市科技计划项目(2005Z3-E0331)
作者简介:黄冠华(1981-), 女 ,博士生 , 主要从事微藻生理及其应用研究.E-mail:huangghcLara@yahoo.com.cn
通讯作者:陈峰 ,教授 、博士生导师.E-mail:sfchen@hku.hk
两步培养法提高蛋白核小球藻的油脂含量＊
黄冠华 陈峰 魏东
(华南理工大学 轻工与食品学院 , 广东 广州 510640)
摘 要:基于 Chlorelapyrenoidosa的生长规律和在缺氮条件下培养可提高其细胞内的油
脂积累的特性 ,进行了两步培养法提高小球藻油脂产量的研究.结果显示:小球藻高密度
生长的最适葡萄糖和硝酸钾质量浓度分别为 20g/L和 1.50g/L;单步培养法中氮源 KNO3
初始质量浓度为 1.50g/L时的小球藻生物量为(7.55 ±0.23)g/L,两步培养法中的小球
藻生物量提高至(9.23 ±0.11)g/L;与单步培养法相比 ,两步培养法中小球藻细胞的油脂
含量和总脂肪酸含量分别提高了 5.8%和 5.2%,藻的热值由(23.58 ±0.02)kJ/g提高到
(25.52 ±0.03)kJ/g.这说明 ,两步培养法不仅可保证藻细胞的高密度生长 ,而且能有效
增加藻细胞的油脂含量.
关键词:小球藻;油脂;氮缺失;热值;两步培养法
中图分类号:Q175;Q949.21 文献标识码:A
可再生能源制备的原料可来源于陆生油料作
物 [ 1] 、酵母 、真菌 [ 2]和藻类 [ 3] .某些藻 ,如:小球藻 、
硅藻的油脂含量很高.小球藻作为一类可再生能源
生物质可以在光自养和异养的培养条件下积累油
脂 ,能有效利用太阳能和有机能进行快速生长和积
累油脂.培养基的初始碳氮比对小球藻生物合成油
脂有显著的影响.陈峰等[ 4]报道了 C/N比对 Chlo-
relasorokiniana中脂肪酸组成和含量的影响.通过
在培养基中添加葡萄糖作为碳源和大幅度降低氮源
甘氨酸用量的方式异养化培养 Chlorelaprotothe-
coides,可以使其藻油脂含量提高至自养培养条件下
的 3.4倍 [ 5] .Ilman等 [ 6]研究发现 ,在低氮培养基中
培养的 Chlorelaemersoni可以达到的最高热值为
29kJ/g,但生物产率却只能达到 25mg/(L· d).正
常生长条件下微藻的油脂含量为 5% ～ 35%[ 7] ,还
远远不能满足微藻作为生物柴油原料的要求.虽然
以前的一些研究都关注于一种说法 ,所谓的 “油脂
诱导学说”,它是指在环境压力条件下 ,如氮缺失培
养下许多微藻所表现出的油脂积累的特性.但是 ,氮
缺失的培养条件在诱导藻生物合成油脂的同时也抑
制了藻细胞的生长 ,在营养缺失的培养阶段总的油
脂收率是很低的.对于以获得高产油脂为目的的小
球藻培养来说 ,提高生物量和提高细胞内油脂含量
是同等重要的.兼顾以上两方面的要求 ,设计出两步
培养方案 ,分步分别提高藻的生物量和油脂含量;即
通过研究蛋白核小球藻 Chlorelapyrenoidosa在摇瓶
水平上不同起始碳源和氮源浓度对小球藻兼养培养
条件下的细胞生长速率的影响 ,制定出最适宜的高
密度细胞培养条件;然后在氮缺失培养条件下诱导
油脂的积累;最后 ,分别比较了兼养条件下单步培养
体系和两步培养体系中小球藻的生物量 、油脂含量
和热值等.本研究制定的两步法培养体系将为进一
步放大 C.pyrenoidosa生产油脂提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 小球藻藻种及培养方法
蛋白核小球藻(Chlorelapyrenoidosa)来自于澳
大利亚联邦科学工业研究机构(CSIRO).取自淡水
的蛋白核小球藻 C.pyrenoidosa以兼养模式进行培
养.采用 Watanabe培养基 [ 8]的基本成分 ,其营养成
分为:KH2PO4 1.25 g/L, MgSO4 · 7H2O1.25 g/L,
FeSO4· 7H2O20mg/L, A5微量元素液 1mg/L.在氮
源充足的培养条件下 ,依据实验设计往 Watanabe培
养基中加入适量浓度的葡萄糖和 KNO3.在氮源缺
失培养条件下 ,依据实验设计只改变培养基中的
KNO3含量.在进行高压灭菌前 ,将 pH值调到 6.0,
并在 120℃下灭菌 20min.在超净台上将种子液接种
于新鲜培养液中 ,于(23 ±1)℃、4 000lx、150r/min
的条件下进行摇瓶培养.
1.2 蛋白核小球藻的两步培养法
氮源充足条件下小球藻的生长速率明显高于缺
氮条件下小球藻的生长速率 ,但是 ,缺氮条件下的藻
细胞内的油脂含量却高于氮源充足条件下小球藻的
油脂含量;所以 ,依据小球藻缺氮条件下的油脂积累
特性 ,采用不同的培养阶段来分别提高藻生物量和
油脂含量的两步法方案.第一步是在氮源充足的培
养条件下以提高藻的生物量 ,以高密度的培养为目
的.第二步是在第一步中当藻细胞生长达到对数生
长末期时 ,收获藻细胞并转入氮缺失的培养基中进
行再培养 ,在缺氮培养条件下提高藻的油脂含量 ,利
用血球技术法每天监测细胞生长状况 ,并在藻细胞
生长下滑的初期收集藻细胞 ,离心 、干燥后进行油脂
含量和脂肪酸含量及成分的测定.
1.3 蛋白核小球藻生长曲线的测定
在氮缺失培养条件下 ,藻细胞内油脂的含量和其
他化学成分会发生变化 ,采用光密度法不能准确测定
生物量.所以藻细胞在氮充足和氮缺失条件下的细胞
的生长曲线都将采用血球板记数法进行测定.
1.4 培养基中残糖和残氮的测定
将收获的 1mL藻液在 13000r/min下离心 3min
后 ,吸取上清液 ,于测试管中采用如下分析方法进行
测定.并通过回归方程进行残糖和残氮量的计算.
培养基中的残糖浓度用 3, 5-二硝基水杨酸
法 [ 9]进行测定 ,葡萄糖的残糖质量浓度 ρ与 520nm
处的吸光度 D(520)的线性回归方程为:D(520)=
20.803ρ, r=0.9988.
培养基中的残氮浓度测定采用浓硫酸 -水杨酸
法 [ 10]进行测定 ,培养基中硝酸钾的残留质量浓度 ρ′
与 410nm处的样品吸光度 D(410)的线性回归方程
为:D(410)=98.78ρ′, r=0.9976.
1.5 小球藻生物量 、油脂 、脂肪酸含量及成
分的测定
取 8mL收获的小球藻液离心后弃上清液 ,用蒸
馏水洗涤藻细胞 ,离心 ,重复 3次.将收获的湿藻细胞
冷冻干燥 32h后置于干燥器中过夜 ,用于下一步生物
量的测定.油脂的测定采用 Ben-Amota和 Tornabene
等[ 11]的方法 ,油脂中脂肪酸含量和成分的测定采用
Bligh等 [ 12]的方法.
油脂的测定方法:在螺纹管中加入约 20mg干藻
粉 ,依次加入不同体积的甲醇 -氯仿(体积比为 2∶1)
试剂 、氯仿 、5% NaCl溶液 ,使甲醇 、氯仿 、NaCl溶液
的体积比为 2∶2∶1.振荡 2min后 ,离心 ,收集氯仿层 ,
重复提取油脂 3次后 ,将收集的氯仿层在氮气中吹
干并在真空干燥器中干燥称量至恒重 ,进行称量
计算.
脂肪酸含量及成分的测定:在以上油脂残留物
中加入 2g/L的 C19脂肪酸二氯甲烷溶液作为内
标 ,用氮气吹干后在油脂残留物中随后加入 2mL
0.5moL/LNaOH-CH3OH溶液 ,置于 75℃水浴中皂
化 15min,冷却后加入 2 mL三氟化硼 -甲醇溶液
(体积比为 1∶2),振荡混匀后 ,在 75℃水浴中加热
15min,冷却至室温 ,再加入 1mL饱和食盐水 、2mL
正己烷振荡混匀后 ,静置 2min,取上层油层 ,并用气
相质谱分析法(GC-MS)[ 13]检测油脂中脂肪酸的成
分 ,通过图谱的峰面积归一化得到各脂肪酸的相对
含量和总脂肪酸的含量.
1.6 热值的测量
将在不同培养条件下收集的小球藻冷冻干燥
后 ,研磨成粉状放入 YX-ZR型自动量热仪中进行热
值的测定.
2 结果与讨论
2.1 氮源充足培养条件下的最适葡萄糖浓度
在培养基中添加质量浓度为 0、5、 10、20、 40、
60、80g/L的葡萄糖 ,小球藻的兼养生长动力学曲线
如图 1所示.在兼养条件下 ,没有葡萄糖 ,小球藻藻
含量在平衡生长期为 1.76 ×107个 /mL;而高质量浓
图 1 葡萄糖对蛋白核小球藻兼养生长的影响
Fig.1 EfectofglucoseonthemixtrophicgrowthofC.pyre-
noidosa
98 华 南 理 工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 第 36卷
度的葡萄糖(80g/L)则抑制小球藻的兼养生长 ,说明
葡萄糖是小球藻 C.pyrenoidosa生长的一种限制性营
养物质.添加 5, 10, 20g/L葡萄糖的小球藻分别在
10、11、12天后进入生长平衡期 , 藻含量分别达到
1.60×108、1.52×108 、1.80 ×108个 /mL.
图 2中的结果表明 ,葡萄糖在初始质量浓度为
5 ～ 20g/L时几乎全部被小球藻利用 ,而添加葡萄糖
质量浓度不低于 40g/L的培养基中还含有剩余的葡
萄糖未被吸收利用.葡萄糖初始质量浓度为 40g/L的
培养基中最终的葡萄糖质量浓度为 28g/L,说明两周
内在此培养条件下小球藻最多利用 20g/L的葡萄糖.
综合考虑图 1和图 2的结果以及考虑到时间的影响因
素 ,以 20g/L的葡萄糖质量浓度兼养培养小球藻最
适宜.
图 2 蛋白核小球藻兼养培养过程中培养基中葡萄糖浓度
的变化
Fig.2 Changeofglucoseconcentrationinthemediumwiththe
mixtrophiccultivationofC.pyrenoidosa
2.2 氮源充足培养条件下的最适 NO-3 浓度
在最适葡萄糖初始质量浓度 (20g/L)的条件
下 ,改变培养基中的初始 NO-3 浓度 ,即 KNO3初始
质量浓度分别为 1.25、1.50、2.00、3.00、4.00、5.00、
6.00g/L,得到图 3中兼养小球藻的生长曲线.由图3
图 3 硝酸盐对蛋白核小球藻兼养生长的影响
Fig.3 EfectofnitrateonthemixtrophicgrowthofC.pyrenoidosa
可知 , KNO3初始质量浓度不高于 1.50g/L时 , 随
NO-3 的浓度增加 ,小球藻生长加快 ,在 KNO3初始
质量浓度为 1.50g/L时藻含量在第 10天达到最高
为 1.90 ×108个 /mL,之后 , NO-3 浓度再增加 ,则小球
藻生长速率有所下降 ,说明氮源也是小球藻生长
的限制性基质.图 4中硝酸盐的消耗曲线表明 ,在
20g/L的葡萄糖初始质量浓度下 ,小球藻在 KNO3
初始质量浓度为 1.25 ～ 1.50g/L时 , 11天内基本消
耗完 NO-3 ,而 KNO3初始质量浓度为 2.00g/L时培
养基中还剩余相当于 0.61g/L的 KNO3未被吸收 ,
这说明小球藻能吸收的 NO-3 的量有一定范围.依据
图 4,在葡萄糖初始质量浓度为 20g/L时 ,小球藻能
吸收 1.50g/L的 KNO3.
图 4 蛋白核小球藻兼养培养过程中培养基中硝酸盐浓度
的变化
Fig.4 Changeofnitrateconcentrationinthemediumwiththe
mixtrophiccultivationofC.pyrenoidosa
2.3 单步培养法和两步培养法对蛋白核小
球藻的影响
2.3.1 藻细胞的高密度培养(单步培养)
将 C.pyrenoidosa在以上优化的 Watanabe培养
基中培养 ,其营养成分为:KNO3 1.50g/L、KH2PO4
1.25g/L、MgSO4·7H2O1.25g/L、FeSO4·7H2O20mg/L、
A5微量元素液 1mg/L、葡萄糖 20g/L.在(23 ±1)℃、
4000lx、150r/min的培养条件下进行培养.对藻细胞
的生长状况每天进行监测 ,并在藻细胞对数生长末
期即大约 11 ～ 12天后收集一部分新鲜藻细胞 ,冷冻
离心后进行生物量 、油脂含量 、总脂肪酸含量及热值
的测定 , 相应的结果依次为 (7.55 ±0.23)g/L、
(38.60 ±2.10)%、(14.20 ±0.24)%、 (23.58 ±
0.02)kJ/g.而收集另一部分的新鲜藻细胞用于下一
步缺氮条件下的培养 ,细胞的收集 、离心和转移需在
无菌操作条件下进行.
99 第 12期 黄冠华 等:两步培养法提高蛋白核小球藻的油脂含量
2.3.2 藻细胞内油脂的积累(两步培养法)
将单步法中离心后的新鲜藻细胞团打散后立即
转入氮缺失的培养基中进行培养 ,各培养基中 KNO3
的初始质量浓度分别为 0.00、 0.20、 0.40、 0.60、
0.80g/L,培养基的其他成分和培养条件与以上优
化的氮充足培养条件相同 ,氮缺失培养下的小球藻
生长变化曲线如图 5所示.由图 5可见 ,不同氮缺失
培养基中的小球藻细胞数在培养过程中都有一定程
度的增加.其中在 KNO3 初始质量浓度为 0.00和
0.20g/L的培养基中的小球藻在第 7、8天时有一个
生长高峰期 ,之后 ,小球藻细胞衰减迅速;而其他培
养基中的细胞生长较为平缓 ,藻含量基本保持初始
状态.在藻细胞生长的第 12天各培养基中的藻液的
色泽有不同程度的变黄 ,收集不同氮源浓度条件下
培养的藻细胞 ,离心 ,干燥后进行小球藻油脂和脂肪
酸含量及成分的测定 ,结果如表 1所示.
图 5 蛋白核小球藻缺氮条件下的生长曲线
Fig.5 GrowthcurvesofC.pyrenoidosaundertheconditionof
nitratedepletion
由表 1可知 ,两步法中小球藻油脂含量比单步
法中培养的小球藻的油脂含量(38.60 ±2.10)%有
明显的增加 ,在氮源缺失培养条件下及 KNO3初始
质量浓度为 0时小球藻的油脂含量达到(44.40 ±
4.00)%,总脂肪酸含量为(19.4 ±0.13)%,藻粉热
值为(25.52 ±0.03)kJ/g.而在 KNO3初始质量浓度
为 0.2、0.4、0.6、0.8g/L等氮限制条件时小球藻粉油
脂含量为(36.80 ±4.55)% ～ (40.70 ±1.55)%,热值
为(22.65±0.01)～ (23.98 ±0.08)kJ/g,与氮源充
足条件下培养的藻细胞的油脂含量 (38.60 ±
2.10)%和热值(23.58 ±0.02)kJ/g相比没有明显
的提高.而且在氮源限制条件下培养的藻细胞的热
值的大小与油脂含量并无明显相关性 ,这可能是由
于油脂含量相接近使得热值变化不明显 ,只有当藻内
油脂含量大幅提高时其热值才能明显地提高.
表 1 两步法中不同氮源浓度条件下小球藻的油脂含量 、脂
肪酸成分及含量 、生物量和热值 1)
Table1 Lipidcontent, totalfattyacidscontentandcomposi-
tions, biomassandcalorificvaluesofC.pyrenoidasa
celsunderthediferentcontentsofnitrogensourcein
thetwo-stepcultivationmodel
KNO3初始
质量浓度 /
(g·L-1)
生物量
(g·L-1)
热值 /
(kJ·g-1)
油脂
含量 /%
总脂肪酸
含量 /%
0.00 (9.23±0.11)(25.52±0.03)(44.40±4.00)(19.40±0.13)
0.20 (9.14±0.20)(22.65±0.01)(37.50±3.20)(16.40±0.22)
0.40 (9.12±0.12)(23.79±0.10)(38.70±2.44)(13.50±0.12)
0.60 (8.65±0.22)(23.98±0.08)(36.80±4.55)(14.30±0.14)
0.80 (9.10±0.16)(23.65±0.03)(40.70±1.55)(12.50±0.11)
KNO3初始质量
浓度 /(g·L-1) 脂肪酸成分及其相对含量
0.00
C14∶0(0.93±0.02) C15∶0(0.22 ±0.02)
X(0.77±0.04) C16∶0(21.52 ±1.50)
C16∶1(1.12±0.20) C16∶2(1.43 ±0.21)
C
16∶3(1.21±0.11) C17∶0(0.25 ±0.02)
C18∶0(15.67±2.50) C18∶1(14.00 ±2.10)
C18∶2(17.17±3.00) C18∶3(20.94 ±3.50)
C20∶0(0.36±0.02)
0.20
C
14∶0(0.82±0.01) C15∶0(0.18 ±0.05)
X(0.74±0.02) C16∶0(21.34 ±2.00)
C16∶1(1.29±0.53) C16∶2(1.43 ±0.15)
C16∶3(1.28±0.22) C17∶0(0.17 ±0.12)
C18∶0(13.69±3.70) C18∶1(16.11 ±3.40)
C18∶2(16.40±2.60) C18∶3(20.96 ±4.70)
C20∶0(0.37±0.01)
0.40
C14∶0(0.77±0.06) C15∶0(0.20 ±0.08)
X(0.92±0.05) C16∶0(21.15 ±2.50)
C16∶1(1.71±0.32) C16∶2(1.87 ±0.32)
C16∶3(1.23±0.34) C17∶0(0.19 ±0.04)
C18∶0(15.05±3.60) C18∶1(14.15 ±1.30)
C18∶2(15.02±3.30) C18∶3(21.38 ±7.50)
C20∶0(0.39±0.04)
0.60
C14∶0(0.69±0.02) C15∶0(0.17 ±0.10)
X(0.84±0.07) C16∶0(20.85 ±2.60)
C16∶1(1.69±0.25) C16∶2(1.84 ±0.61)
C16∶3(1.31±0.03) C17∶0(0.19 ±0.07)
C18∶0(14.41±5.80) C18∶1(13.99 ±1.50)
C18∶2(16.04±5.60) C18∶3(21.64 ±4.20)
C20∶0(0.40±0.02)
0.80
C14∶0(0.69±0.03) C15∶0(0.17 ±0.07)
X(0.86±0.03) C16∶0(21.24 ±4.60)
C16∶1(1.72±0.54) C16∶2(1.73 ±0.11)
C16∶3(1.51±0.07) C17∶0(0.22 ±0.17)
C
18∶0(11.88±6.70) C18∶1(15.30 ±3.60)
C18∶2(14.89±4.30) C18∶3(23.22 ±7.40)
C20∶0(0.34±0.06)
1)数据和标准偏差运算结果经过 3次测定求算;X表示未鉴定出
的脂肪酸类.
100 华 南 理 工 大 学 学 报 (自 然 科 学 版) 第 36卷
3 结论
通过对小球藻培养条件的优化研究 ,可达到藻
细胞的高密度培养.在实验条件下 ,小球藻培养的最
适葡萄糖初始质量浓度和最适氮源 KNO3初始质量
浓度分别为 20g/L和 1.50g/L,在此最适条件下藻
含量在平衡生长期可达到 1.90 ×108个 /mL.基于
小球藻生长和缺氮条件下油脂积累的特性 ,采用先
高密度培养再缺氮胁迫培养的分步培养法可提高小
球藻的生物量和油脂含量.本研究可为培养小球藻
生产生物柴油提供一条新途径.两步法培养中氮缺失
培养条件下 ,小球藻积累的油脂含量可达(44.40 ±
4.00)%,总脂肪酸含量可达(19.4 ±0.13)%,藻细
胞的热值比单步培养约提高了 1.9kJ/g.
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ImprovementofLipidContentofChlorelapyrenoidosaby
Two-StepCultivation
HuangGuan-hua ChenFeng WeiDong
(SchoolofLightIndustryandFoodSciences, SouthChinaUniversityofTechnology, Guangzhou510640, Guangdong, China)
Abstract:BasedonthegrowthrulesofChlorelapyrenoidosa(C.pyrenoidosa)andthecharacteristicsofintracel-
lularlipidaccumulationinnitrogen-deficientcondition, theimprovementoflipidcontentofC.pyrenoidosausinga
two-stepcultivationmethodwasinvestigated.Theresultsshowthat(1)theoptimalmasconcentrationsofglucose
andKNO3 forthehigh-densitycultivationofC.pyrenoidosaarerespectively20 and1.50g/L;(2)with1.50g/L
KNO3 asthenitrogensource, thebiomassofC.pyrenoidosaincreasesfrom(7.55 ±0.23)g/Linthesingle-step
cultivationto(9.23 ±0.11)g/Linthetwo-stepcultivation;(3)thecontentsofintracelularlipidandtotalfaty
acidsinthetwo-stepcultivationrespectivelyincreaseby5.8% and5.2%;and(4)thecalorificvaluesimproves
from(23.58 ±0.02)kJ/gto(25.52 ±0.03)kJ/g.Itisthusconcludedthatthetwo-stepcultivationnotonlyre-
sultsinahigh-densitycultivationofC.pyrenoidosabutalsoefectivelyincreasesthecelularlipidcontent.
Keywords:Chlorelapyrenoidosa;lipid;nitrogendeficiency;calorificvalue;two-stepcultivation
101 第 12期 黄冠华 等:两步培养法提高蛋白核小球藻的油脂含量