全 文 ：收稿　2001-01-09　　　　修定　2001-05-15
　 1　国家自然科学基金资助项目。
新疆紫草的无性繁殖及其再生植株的遗传稳定性初探1
计巧灵　王卫国(新疆大学生命科学与技术学院 ,乌鲁木齐 830046)
Asexual Propagation of Arnebia euchroma Johnston and Exploration of Heredit-
ary Stability in Regenerated Plantlets
JI Qiao-Ling , WANG Wei-Guo(Department of Biology , Xinjiang University , Urumqi 830046)
　　提要　诱导新疆紫草多种外植体脱分化均已成功 , 嫩
芽切段最快 , 胚轴切段次之。 培养期间 , 2 , 4-D 不可缺少 ,
KT的作用优于 6-BA。降低 2 , 4-D浓度利于愈伤组织扩增
和再分化。 KT 或 6-BA 都可诱导出不定芽 , 前者还有利于
球形胚的形成。适当的昼夜温差(10 ～ 28℃)和自然光照有
利于壮苗的形成和移栽成活。新疆紫草种子萌发苗根尖细
胞染色体为 14 条 , 再生试管苗根尖细胞染色体为 14 条的
占 97.1%。
　　关键词　新疆紫草　组织培养　植株再生　染色体数
目
　　紫草根中的萘醌类混合物(称紫草素)不仅具
有抗菌消炎 、解毒透疹 、治疗烧伤的作用 ,而且具有
抗近 10种肿瘤细胞的作用[ 1 ～ 3] 。经国内外临床应
用 ,认为新疆紫草质量最好[ 1 ,4 , 5] 。它主要分布于新
疆境内。过去 ,新疆每年有近百吨干紫草远销内地
及出口国外 ,但近 10 几年来 ,随着紫草市价的升
高 ,人为的挖掘屡禁不止 ,加之紫草自然繁殖缓慢
(生长 5年才开花 、结果 ,以种子繁殖),资源匮乏日
益严重 。80年代日本就开始利用细胞悬浮培养技
术生产紫草素。90年代以来 ,国内学者对此也进
行了大量的研究 , 如以氯化铜[ 6 , 7] 、表面活性剂
Tween20 、多糖 、γ-射线[ 8] 、油菜素内酯[ 9] 、真菌诱导
物等 ,可以提高新疆紫草或滇紫草悬浮培养细胞中
的紫草素含量;用紫草细胞固定化培养法建立了基
质消耗与紫草素合成的动力学模型;用豆蔻酸甲
酯 、正十六烷离析 ,树脂 XAD-2 、R-A 、聚氨酯泡沫吸
附等方法可提高紫草素的提取率等。但细胞悬浮
培养技术生产紫草素对生产条件要求很高 ,工艺复
杂 ,流程较长 ,生产成本很高 ,极大地限制了该技术
的应用。
新疆的很多山地都适于新疆紫草的生长 。为
了促进新疆紫草的人工栽培 ,有计划而合理地利用
资源 ,研究新疆紫草的快速无性繁殖很有意义 。本
文在以前工作[ 10 ,11] 的基础上 ,就新疆紫草无性繁殖
系的建立和遗传稳定性进行了探讨。
材料与方法
　　实验用植物采自新疆伊犁地区海拔 2 300 m
左右的高山砾石坡 ,经鉴定为新疆紫草[ Arnebia eu-
chroma (Royle)Johnston] 。
组织和细胞培养时 ,取自然生长的新疆紫草的
白色嫩芽和幼叶(叶长 0.5 cm),水洗数次后 ,转入
0.1%升汞溶液(加入 Tween80 2滴)中灭菌 5 min ,
再以无菌水反复洗涤 ,切除原伤口后 ,接种到不同
的诱导培养基上 ,诱导其脱分化。另取新疆紫草种
子去壳 ,经5%次氯酸钠灭菌处理 2 min ,以无菌水
洗涤数次后 , 接种在 1 2MS(无激素)培养基上 ,
27℃下培养 6 ～ 7 d ,待种胚萌发长高近 1 cm 时 ,切
下子叶和胚轴段 ,接种到不同的诱导培养基上 ,诱
导其脱分化。另取部分子叶块直接接种到再分化
培养基上 ,诱导其分化不定芽 。
愈伤组织经 4个月继代扩增后大部分转入再
分化固体培养基上 ,诱导其再分化 ,结合石蜡切片
和形态观察检查再分化情况 。少部分松散愈伤组
织经过悬浮 ,过100目筛后 ,取过滤液的沉淀 ,进行
细胞悬浮培养 ,诱导其胚性化 ,并定期取样在倒置
显微镜下观察 ,了解细胞的分裂 、分化情况。分化
出的芽生长到一定高度时切离 ,经扶壮 ,芽高 3 cm
以上时诱导生根 ,形成试管苗 。经悬浮培养形成的
球形胚转入固体培养基 ,使其发育为各期胚状体 ,
进而发育成苗 。试管苗经炼苗 、移栽 ,土培成活。
诱导新疆紫草外植体脱分化的培养基列于表
1 ,每种激素组合重复 4 ～ 5次;再分化培养基见表
2 ,每种不同的培养基重复 4次;芽扶壮以 LS 为基
本培养基 ,附加 NAA 0.3 mg·L-1+6-BA 0.4 、0.6
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DOI :10.13592/j.cnki.ppj.2001.06.003
表 1　诱导新疆紫草外植体脱分化的培养基
mg·L-1 　
培养基编号 NAA 2 , 4-D 6-BA KT
1 0.4 0.2 0.2
2 0.4 0.2 0.4
3 0.4 0.2 0.6
4 0.4 0.2 0.8
5 0.4 0.2 1.0
6 0.4 0.2 0.5
7 0.4 0.2 1.0
8 0.4 0.2 1.5
9 0.4 0.2 2.0
　　以上均以MSB为基本培养基。
表 2　诱导新疆紫草愈伤组织再分化的培养基
mg·L-1 　
培养基编号 NAA 6-BA KT
10 0.4 1.0
11 0.4 1.2
12 0.4 1.5
13 0.4 2.0
14 0.4 2.5
15 0.4 1.0
16 0.4 1.2
17 0.4 1.5
18 0.4 2.0
19 0.4 2.5
20 0.4 1.0
21 0.4 1.2
22 0.4 1.5
23 0.4 2.0
24 0.4 2.5
　　10～ 14号 、15～ 19号 、20 ～ 24号分别以 MSB 、MS 、LS 为基本培
养基。
mg·L-1;生根培养基为 LS+IBA 2.0 mg·L-1+活性
碳200 mg·L-1 。固体培养基均以 0.7%琼脂固化 ,
含3%蔗糖(生根培养基减半), pH 5.8 ～ 6.0 ,置于
22 ～ 28℃下培养(芽扶壮和诱导不定芽生根阶段 ,
昼夜温差在 10 ～ 28℃之间浮动),脱分化 、再分化
诱导初期均在暗处进行 ,其余过程在光照下进行 ,
培养架上的光照度为 1 500 ～ 2 000 lx ,光照 14 h·
d
-1 。细胞悬浮培养用MSB+IAA 0.6 mg·L-1+KT
1.0 mg·L-1或加入 Gln 100 mg·L-1或 Phe 100 mg·
L
-1或 0.1%琼脂 , 置 THZ-03 型恒温振荡器上
(27℃、80 r·min-1),黑暗中培养 ,每隔 5 d 换液 1
次。
石蜡切片时 ,用纳瓦兴固定液 Ⅲ固定材料 ,按
常规脱水 、包埋 、制片 ,切片厚 5 ～ 7 μm ,以番红-固
绿对染 ,用Olympus摄影显微镜观察并拍照。
　　遗传稳定性分析按孙敬三等[ 12] 的方法。新疆
紫草种子萌发苗的根尖和再生试管苗根尖以
0.05%、0.10%秋水仙素溶液或对二氯苯饱和液作
预处理 ,洗涤后 , 进一步切小 ,仅保留 2 mm 的尖
端。以 0.075 mol·L-1 KCl 液作前低渗 ,再以2.5%
纤维素酶和果胶酶的混合液酶解去壁;以重蒸水作
后低渗 ,最后用卡诺固定液固定 ,以悬液滴片法制
备染色体标本 。经 Giemsa染色后 ,在 Olympus摄影
显微镜下拍照 ,进行染色体计数。
结果与讨论
1　外植体的脱分化
　　不同来源的外植体在诱导脱分化培养基上均
能产生愈伤组织 ,但愈伤组织产生的快慢及质地有
很大差异。嫩芽切段在 7号培养基上产生愈伤组
织最快 ,产量高 ,愈伤组织乳白色 、较疏松 、半透明;
其次是胚轴段在 8号培养基产生愈伤组织较快 ,产
量较高 ,愈伤组织质地 、色泽较好 。在含6-BA的培
养基上愈伤组织生长也较快 ,但疏松 、透明呈水浸
状。在愈伤组织继代培养中如果仍用原培养基 ,愈
伤组织生长快 ,但较透明 、疏松 ,若将2 ,4-D降至0.
1mg·L-1 ,这样经过 4至 5次继代 ,可得到大量高
质量的愈伤组织。在继代培养过程中 ,有些乳白色
的愈伤组织可逐渐变红 ,因而使整块愈伤组织出现
半边红和半边白的现象 。红的愈伤组织扩增很慢 ,
在转瓶时将其切除有利于乳白色愈伤组织的生长 。
2　愈伤组织的再分化
　　将继代产生的愈伤组织大部分转入再分化培
养基上 ,经3个月的培养 ,在 24号 、21号培养基上
可看到大量的不定芽产生 ,起初有些愈伤组织团块
表面变得光滑 、明亮 ,逐渐看到表面有许多小的瘤
状突起 ,最后形成了芽丛(图 1-7)。在有 KT 的培
养基上有些愈伤组织逐渐产生了许多谷粒状的小
颗粒堆(图 1-1),石蜡切片观察发现此种小颗粒是
许多胚状体(图 1-2 、3)。幼叶在 12号培养基上能
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直接产生不定芽丛 ,不定芽起源于伤口处 ,先形成
少量结构紧密的愈伤组织 ,然后在隆起处产生多个
小瘤状突起 ,进而发育为不定芽(图 1-8 、6)。待芽
丛长至1 cm高 ,芽丛中的芽一个个清晰可见时 ,将
各芽切离 ,转入扶壮培养基上培养 。不定芽的切离
不能太早 ,太早会因看不清芽与芽的分界而伤及不
定芽 ,致使部分芽呈畸形 ,芽数量减少或再分化时
间延迟 。细胞悬浮培养过程中 ,定期观察发现 ,加
入Gln 100 mg·L-1或加入0.1%琼脂均能促进细胞
分裂(图 4),加入 L-Phe 100 mg·L-1对促进细胞分
裂作用不明显 。待产生大量的球形胚后 ,转入固体
培养基上培养 ,球形胚在固体培养基上培养初期 ,
培养基中仍需加入适量激素 。们采用 MSB+KT 0.
5 mg·L-1+IAA 0.3 mg·L-1培养基 ,能使球形胚大
量增殖(图 1-10),并很快发育为各期胚状体。新疆
紫草胚状体形态与合子胚相似 ,经历球形 、心形 、鱼
雷形 、子叶形各时期 。
图 1　新疆紫草组织培养植株再生情况
　　1.愈伤组织经再分化培养产生的球形胚团;2 、3.石蜡切片示鱼雷胚(2)和子叶胚(3);4.悬浮培养的细胞团;5.新疆紫草的染色体;6.石
蜡切片示不定芽;7.愈伤组织上产生的不定芽丛;8.幼叶伤口处的愈伤组织和不定芽;9.在玻璃温室中培养的壮苗;10.悬浮培养的球形胚团
转入固体培养后大量增殖;11.土培成活的新疆紫草再生苗。
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3　不定芽扶壮 、生根及试管苗移栽
　　切离后的不定芽在扶壮过程中 ,用 6-BA 0.6
mg·L-1较合适 ,但温度和光照是两个很重要的因
素。在恒温 、恒定光照强度的培养架上 ,芽的生长
较快 ,但叶片窄长 、新绿色 ,显示出体质较弱。若将
接有切离芽的培养瓶放在玻璃温室中培养 ,情况就
好得多 ,温室温度昼夜在 10 ～ 28℃波动 ,自然光照
强度比培养架上强很多 ,在这种条件下 ,芽的生长
虽然较慢 ,但长出的叶片比较宽 、厚 ,呈浓绿色 ,显
示出个体的强壮 ,这种光 、温条件与新疆紫草自然
生长环境中的光 、温条件较接近 ,以这种方式扶壮
的芽有较强的生命力 。扶壮后的芽长高至 3 cm以
上时就可以诱导生根 ,在诱导生根过程中 ,来自培
养架上扶壮的芽生根慢 ,而在玻璃温室扶壮的芽生
根快 ,苗健壮(图1-9)。待试管苗根粗达2 mm以上
时 ,经 5 d的敞口炼苗后 ,洗净根部琼脂 ,移入由灭
菌蛭石填充的营养杯中 ,盖上薄膜 1周 ,揭膜后培
养1个月 ,移入土壤填充的花盆中栽培 , 1个月后
统计成活率:在移栽的 236株试管苗中 , 31株土培
成活(图 1-11),成活率 13.2% 。
4　遗传稳定性分析
　　在新疆紫草种苗根尖和再生试管苗根尖制备
染色体标本的过程中 ,经多次试验发现 ,预处理开
始的时间 、预处理的药液种类和浓度以及预处理时
间明显影响新疆紫草根尖分裂相的多少和染色体
的形态 ,以上午 10时左右进行预处理的效果较好 。
新疆紫草根尖的耐药性较差 ,用对二氯苯饱和液处
理后常出现染色体粘连 ,分散度不好 ,在室温(15 ～
20℃)下 ,用 0.05%秋水仙素溶液预处理材料 2 h
较合适 ,在 4℃或 25℃以上预处理的材料均未得到
满意的效果。预处理后的材料用酶解去壁 、低渗 、
滴片法制备染色体 ,得到了较好的分裂相(图 1-5)。
统计新疆紫草种苗根尖细胞 101 个分裂相结果表
明 ,其染色体为 2n=14;统计再生试管苗根尖细胞
68个分裂相的结果表明 ,染色体为 14条的占 97.
1%,说明这种再生试管苗的遗传性较稳定 。
上述实验表明 ,利用新疆紫草嫩芽 、胚轴段作
为外植体进行组织培养 ,可从愈伤组织诱导产生大
量的不定芽。愈伤组织扩增过程中 ,激素水平须进
行调整 ,尤其是降低 2 , 4-D ,不仅有利于愈伤组织
扩增 ,且对后续诱导愈伤组织的再分化也很有利 。
在再分化诱导过程中 ,提高细胞分裂素的浓度是关
键 , KT 2.5 mg·L-1或 6-BA 1.0 mg·L-1都有利于芽
的分化 ,前者还有利于球形胚的形成。从芽丛中切
离不定芽 ,应等到芽长至一个个分界明显时再切离
较好 ,以免周围的芽受损 。在芽的扶壮过程中 ,适
度增大昼夜温差和光照强度 ,虽然幼芽生长慢 ,但
容易形成壮芽 ,而且对诱导生根有利 ,对试管苗移
栽成活也很有利 。细胞悬浮培养能产生大量的球
形胚 。球形胚在固体培养基上培养初期需要加少
量激素诱导才能大量扩增并继续发育 ,待长成鱼雷
后期胚和子叶胚时 ,即使在没有激素的培养基上也
可以顺利萌发形成试管苗。
试管苗移栽成活率不高的原因可能是当时的
光 、温等环境条件不太适宜新疆紫草的生长发育所
致 ,还需深入探讨。关于新疆紫草的染色体数目 ,
我们的结果是 2n=14 ,试验分析表明再生试管苗
的遗传性较稳定。
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