全 文 ：细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2008, 30: 755-760 http://www.cjcb.org
收稿日期: 2008-07-21　　接受日期: 2008-09-01
国家自然科学基金(No.30670845)和河北省自然科学基金(No.C200
7000831)资助项目
*通讯作者。Tel: 0311-86265563, Fax: 0311-86266180, E-mail:
wjk@hebmu.edu.cn
旋覆花内酯抑制炎性因子介导的内皮细胞与
单核细胞的黏附
李　睿　刘　彬　郑　斌　韩　梅　温进坤*
(河北医科大学基础医学研究所, 河北省医学生物技术重点实验室, 石家庄 050017)
摘要　　为了观察旋覆花内酯 (1-O-acetylbritannilactone, ABL)乙酰化衍生物ABLO2对脂多糖
(lipopolysaccharide, LPS) /干扰素-g (interferon-g, IFNg)刺激的内皮细胞ECV304活化及其与
RAW264.7单核/巨噬细胞相互作用的影响, 采用Western 印迹检测核因子-kB (nuclear factor-kB,
NF-kB) 活化以及NF-kB依赖的黏附分子的表达水平, 应用电泳迁移率改变分析 (electrophoretic
mobility shift assay, EMSA) 检查ABLO2预处理及LPS/IFN-g诱导对NF-kB与DNA结合活性的影
响。结果显示, ABLO2显著抑制LPS/IFN-g诱导的NF-kB核转位和DNA结合活性, 同时ABLO2降
低 NF-kB 抑制蛋白 (IkB) 激酶 (IkB kinases, IKK) 的活性, 抑制IkB的磷酸化及降解; ABLO2还通过
减少血管细胞黏附分子-1 (vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、骨桥蛋白 (osteopontin, OPN)、
基质金属蛋白酶-9 (metalloproteinase-9, MMP-9)、黏蛋白-c (tenascin-c) 的表达, 进而减弱单核细
胞与内皮细胞之间的黏附作用。研究结果表明, ABLO2通过抑制IKK活性及IkB降解而抑制NF-kB
活化, 进而起到抑制NF-kB依赖的黏附分子表达及细胞黏附作用。
关键词　　旋覆花內酯乙酰化衍生物ABLO2; ECV304细胞; 核因子-kB; 黏附分子; 细胞黏附
动脉粥样硬化是一种血管慢性炎症性疾病[1]。
当血管内膜受损时, 损伤部位浸润的白细胞、单核细
胞和血小板释放多种细胞因子, 这些细胞因子不仅可
激活内皮细胞, 而且可刺激单核细胞浸润及内皮细胞
合成、分泌多种黏附因子, 如骨桥蛋白(osteopontin,
OPN)、血管细胞黏附分子-1 (vascular cell adhesion
molecule-1, VCAM-1)等 从而加剧血小板和单核细胞
与内皮细胞之间的黏附, 促进炎性因子的释放, 加重
血管炎性反应[2,3]。已有研究证实, 炎性因子可激活
靶细胞内的核因子kB (nuclear factor-kB, NF-kB), 活
化的NF-kB是介导炎症反应的关键转录调控因子[1]。
因此, 抑制NF-kB活化, 减少血管损伤部位炎性介质
的释放, 已成为防治动脉粥样硬化的新策略。旋覆
花内酯(1-O-acetylbritannilactone, ABL)是从欧亚旋覆
花(Inula britannica L.)中分离得到的一种具有抗炎
作用的单体化合物。以往研究证实, ABL具有抑制
单核/巨噬细胞活化和血管平滑肌细胞炎性应答的
作用[4~6]。为了进一步增强ABL的生物利用度, 我们
用人工合成法对ABL进行乙酰化修饰, 并得到ABL的
乙酰化衍生物ABLO2。本研究观察ABLO2对脂多糖
(lipopolysaccharide, LPS) /干扰素-g (interferon-g, IFN-g
诱导的内皮细胞活化及其与单核细胞相互作用的影
响, 并对其作用机制进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
ABLO2的化学结构见图 1。DMEM培养基购自
Gibco公司; 凝胶阻滞分析试剂盒购自Promega公司;
抗NF-kB、基质金属蛋白酶-9 (metalloproteinase-9,
MMP-9)、OPN、VCAM-1、GAPDH多克隆抗体,
抗IkBa、黏蛋白-c (tenascin-c)单克隆抗体均购自
Santa Cruz公司; 抗IKKa、IKKb、p-IKKa/b多克
隆抗体, 抗p-IkBa单克隆抗体均购自Cell Signaling
图 1　ABLO2化学结构式[5]
756 ·研究论文·
公司; [g-32P]ATP购自北京福瑞生物工程公司。
ECV304人脐静脉内皮细胞株、RAW264.7小鼠单
核/巨噬细胞株由ATCC提供。
1.2 细胞培养及实验分组
ECV304与RAW264.7细胞均培养于含10%新生
小牛血清的DMEM培养基中。当ECV304生长至
70%~80%融合时, 换成无血清培养基, 饥饿培养24 h,
使细胞同步于静止期。用不同浓度ABLO2 (10 mmol/L、
20 mmol/L、50 mmol/L)预处理ECV304细胞2 h, 加
入LPS (10 mg/ml)和IFN-g (20 IU)刺激细胞10 min、
30 min、60 min, 收集细胞用于检测NF-kB、IkBa
和IKK; 刺激6 h、 12 h、24 h, 收集细胞用于检测
NF-kB依赖的黏附分子。
1.3 电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility
shift assay, EMSA)
按聂磊等[7]报道的方法, 提取各组细胞核蛋白, 用
改良的Lowry’s 法进行蛋白质定量。以含有NF-kB
结合模体的双链寡脱氧核甘酸为探针, 用[g-32P]ATP
进行5末端标记, 将标记探针与5 mg核蛋白在结合
缓冲液中室温反应20 min, 以100倍过量的非标记探
针作为特异性竞争结合对照。DNA-核蛋白复合物
经5% PAGE分离后, 于 –70 ℃放射自显影。
1.4 细胞总蛋白提取及Western印迹
收集各组ECV304细胞, 按韩梅等[8]的方法用冷
PBS洗涤3次后, 将细胞重悬于裂解液(1% NP40, 150
mmol/L NaCl, 50 mmol/ L Tris·HCl, pH 7.5, 10%甘油,
1 mmol/L Na3VO4, 1 mmol/L PMSF)中,冰浴30 min, 使
细胞充分裂解。4 ℃, 8 000 r/min 离心10 min, 收集
上清液, 进行蛋白质定量。各组取等量蛋白质, 经
8%SDS-PAGE分离后, 电转移至PVDF膜上。依次
与一抗、二抗进行结合反应, 用ECL发光法检测抗
体结合区带。
1.5 细胞黏附实验
将ECV304细胞按1×104个/孔的密度接种于包
被了2％明胶的96孔板中, 加入20 mmol/L ABLO2预
处理2 h, 用无血清培养基洗去ABLO2; 同时, 用LPS/
IFN-g刺激RAW264.7细胞30 min (作为激活的
RAW264.7细胞)将其接种至单层内皮细胞表面(5×104
个/ml, 200 ml/孔), 继续共温育30 min。弃去培养基,
用PBS洗去未黏附的细胞。用4%多聚甲醛固定后,
于高倍镜下随机计数5个视野中黏附的巨噬细胞数,
以此表示细胞黏附活性。实验重复3次。
1.6 统计学处理
实验结果采用x－ ±s表示, 采用SPSS 13.0统计软
件进行组间方差分析, 以P<0.05表示统计学上有显
著差异。
2 结果
2.1 ABLO2抑制LPS/IFN-g诱导的NF-kB核转
位及DNA结合活性
Western印迹结果显示, 在未经处理的对照ECV304
细胞核蛋白中, 即有NF-kB p65存在, LPS/IFN-g刺
激10 min、30 min、60 min后, 核内NF-kB p65的
水平呈进行性升高(图2A)。用20 mmol/L ABLO2预
处理的ECV304细胞, 核内p65水平明显低于LPS/
IFN-g处理组, 提示ABLO2可抑制LPS/IFN-g诱导的
NF-kB p65核转位。为了确定ABLO2是否影响NF-
kB p65与DNA调控元件的结合活性, 以5末端标记
的含有 NF-kB结合模体的双股寡核苷酸为探针, 分
别与不同条件处理的ECV304细胞核蛋白进行结合反
应。DNA-核蛋白复合物经电泳分离后, 放射自显影
结果可见, LPS/IFN-g刺激ECV304细胞30 min后, 核
蛋白可与探针形成明显的DNA-核蛋白复合物滞后
迁移区带, 该区带可被100倍过量的非标记探针所消
除, 说明核蛋白与DNA结合具有特异性。用不同浓
度ABLO2 (10 mmol/L、20 mmol/L、50 mmol/L)预处
理的细胞, 其核蛋白与探针结合形成的迁移区带明显
减弱, 且ABLO2对NF-kB结合活性的抑制效应具有剂
量依赖关系(图2B)。
2.2 ABLO2抑制LPS/IFN-g诱导的IkBa磷酸
化和降解
为了确定ABLO2抑制NF-kB核转位的上游机制,
本研究进一步观察了LPS/IFN-g处理对IkBa磷酸化
及降解的影响。Western 印迹分析结果显示, 未处
理的内皮细胞中含有较高水平的IkBa, 其磷酸化水
平相对较低。用LPS/IFN-g刺激细胞10 min、30
min、60 min后, IkBa磷酸化水平快速、短暂升高,
而IkBa含量变化与其磷酸化程度呈相反趋势。用
20 mmol/L ABLO2预处理ECV304细胞后, LPS/IFN-g
诱导的IkBa磷酸化及降解受到明显抑制, 与未经
ABLO2预处理的细胞相比, IkBa保持较高的水平(图
3)。在此基础上, 进一步用抗磷酸化IKKa/IKKb抗
体检测了ABLO2对IKK (IkB激酶复合体)磷酸化水平
的影响。结果显示, 给予LPS/IFN-g刺激后, IKK磷
酸化水平呈时间依赖性升高; 用ABLO2预处理后,
IKK磷酸化水平比单纯LPS/IFN-g刺激组降低70 %
7 5 7李　睿等: 旋覆花内酯抑制炎性因子介导的内皮细胞与单核细胞的黏附
图3　ABLO2抑制LPS/IFN-g诱导的IkBa磷酸化和降解
与LPS/IFN-g处理组相比, *P<0.05。
图2　ABLO2抑制LPS/IFN-g诱导的NF-kB核转位及DNA结合活性
A: Western印迹分析显示核蛋白中NF-kB的变化; B: EMSA。1: 空白对照组; 2: 100倍过量的非标记探针; 3: 未处理组; 4: LPS/IFN-g刺激组;
5~7: ABLO2 (50 mmol/L、20 mmol/L、10 mmol/L)预处理后再用LPS/IFN-g刺激组。与LPS/IFN-g处理组相比，*P<0.05, △P<0.01。
758 ·研究论文·
图4　ABLO2抑制LPS/IFN-g诱导的IKK磷酸化
与LPS/IFN-g处理组相比, *P<0.05。
图5　ABLO2抑制NF-kB依赖的黏附分子表达
与LPS/IFN-g刺激组相比, *P<0.05。
7 5 9李　睿等: 旋覆花内酯抑制炎性因子介导的内皮细胞与单核细胞的黏附
左右。在相同条件下, ABLO2对IKKa/b的蛋白质水
平无明显影响(图4)。
2.3 ABLO2抑制NF-kB依赖的黏附分子表达
循环白细胞与血管内皮细胞的黏附是动脉粥样
硬化炎症反应的起始环节, 活化的内皮细胞所释放的
多种黏附分子是介导细胞黏附的前提条件。许多黏
附分子, 如OPN、VCAM-1、MMP-9等基因的转录
激活大多受到NF-kB的调控。为了进一步观察
ABLO2抑制NF-kB活化后是否影响这些黏附分子的
表达, 本实验检测了ABLO2预处理细胞后, NF-kB下
游黏附分子表达的变化。Western 印迹结果显示, 在
未经处理的ECV304细胞中, VCAM-1、OPN、
MMP-9、黏蛋白-c的表达水平均较低, 用LPS/IFN-
g刺激不同时间后, 这些蛋白质的表达水平均有不同
程度的升高, 其中MMP-9、VCAM-1在刺激12 h后
明显升高; OPN和黏蛋白-c在刺激6 h明显升高并维
持该水平至24 h。用ABLO2预处理细胞后, 能明显
抑制LPS/IFN-g诱导的黏附分子表达(图5)。
2.4 ABLO2抑制单核细胞与内皮细胞的黏附
为了观察ABLO2抑制黏附分子表达后是否影响
单核与内皮细胞之间的黏附作用, 将LPS/IFN-g激活
的RAW264.7单核巨噬细胞接种于单层内皮细胞表
面, 共温育30 min后, 计数黏附的巨噬细胞。如图
6所示, LPS/IFN-g可显著增强单核细胞与内皮细胞
之间的黏附作用, 两种细胞间的黏附活性较对照细胞
增加4.7倍; 用ABLO2预处理的内皮细胞, 其与
RAW264.7细胞的黏附活性受到明显抑制, 比未经预
处理的细胞下降33%(图6)。
3 讨论
动脉粥样硬化发生发展的不同阶段均存在慢性
炎症反应[9]。在动脉粥样硬化发生早期, 脂质在动脉
壁上的沉积, 以及动脉分支处受血液湍流的冲击, 使
血管内皮受损。受损的血管内皮细胞表达各种黏附
分子, 后者通过与其配体结合, 介导内皮细胞与单核
细胞之间的黏附。在趋化因子和单核/巨噬细胞集
落刺激因子的作用下, 与内皮细胞黏附的单核细胞向
内膜下迁移, 活化成为巨噬细胞, 并释放IFN-g、
TNF-a、IL-1b等炎性细胞因子, 继而刺激血管平滑
肌和内皮细胞的炎性反应, 包括环加氧酶-2 (COX-2)
和NOS基因表达增强, 前列腺素和一氧化氮合成增
加, 以及血清中C反应蛋白(CRP)水平升高等, 最终
导致血管病变的发生[10]。NF-kB是调控炎性基因表
达的重要转录因子[11], 可启动黏附分子、趋化因
子、细胞因子、生长因子等100多种炎症反应相关
基因的表达。静息状态下, NF-kB与IkB结合, 以非
活性形式存在于细胞浆中, 不具有转录活性。当细
胞受到致炎因子刺激时, 与NF-kB结合的IkB在IKK
的催化下发生磷酸化、继之泛素化降解, NF-kB被
释放并转位入核, 参与启动包括黏附分子在内的多种
基因的表达, 进一步加重血管炎症反应[12,13]。因此,
抑制内皮细胞的活化和NF-kB的激活, 阻断单核细胞
与内皮细胞的黏附, 对减缓血管病变进展具有重要意
义[3]。
ABLO2是ABL的乙酰化衍生物。前期研究发现,
该化合物能有效抑制RAW264.7细胞合成炎性介质
NO和PGE2, 并证实其作用机制与抑制NF-kB活化及
iNOS和COX-2基因表达有关[4]。在血管平滑肌细
胞, ABL对NF-kB活化启动的炎性基因COX-2表达
也具有较强的抑制作用[5]。然而, ABL能否调制血管
内皮细胞的炎性应答及其作用机制目前尚不清楚。
本实验从炎症信号转导通路、黏附分子表达和单核
细胞与内皮细胞相互作用角度证实, ABLO2可明显抑
制LPS/IFN-g诱导的内皮细胞NF-kB核转位及DNA
图6　ABLO2抑制单核细胞与内皮细胞之间的黏附
1: 对照ECV304细胞与RAW264.7细胞之间的黏附; 2: LPS/IFN-g刺激30 min组; 3: ABLO2预温育2 h再用LPS/IFN-g刺激30 min。
与LPS/IFN-g刺激组相比, *P<0.05。
760 ·研究论文·
Acetylbritannilactone Inhibits Inflammatory Stimulus-mediated
Adhesion between Endothelial Cells and Macrophages
Rui Li Bin Liu Bin Zheng Mei Han Jin-Kun Wen*
(Hebei Laboratory of Medical Biotechnology, Institute of Basic Medical Science,
Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)
Abstract To investigate the effects of 1,6-O2-diacetylbritannilactone (ABLO2) on the activation of
endothelial cell ECV304 and its interaction with macrophages treated with lipopolysaccharide (LPS)/interferon-
(IFN-g). Western blot analysis was adopted to measure the nuclear translocation of nuclear factor-kB (NF-kB) and
the expression of some adhesion molecules. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was used to detect DNA-
binding activity of NF-kB in ECV304 cells pretreated with ABLO2. The results showed that ABLO2 inhibited the NF-
kB activation by blocking IkB kinase (IKK) activation, and suppressing inhibitor of NF-kB (IkB) phosphorylation and
degradation. In addition, ABLO2 could inhibit the adhesion between endothelial cells and macrophages by decreasing
the expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), osteopontin (OPN), matrix metalloproteinase-9
(MMP-9) and tenascin-c. These results suggest that ABLO2 is a potent agent to prevent vascular inflammatory
disease in the vessel.
Key words 1,6-O2-diacetylbritannilactone; ECV304; nuclear factor-kB; adhesion molecule; cell adhesion
Received: July 21, 2008 Accepted: September 1, 2008
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30670845) and the Natural Science Foundation of
Hebei Province (No.C2007000831)
*Corresponding author. Tel: 86-311-86265563; Fax: 86-311-86266180, E-mail: wjk@hebmu.edu.cn
结合活性, 降低黏附分子, 如OPN、VCAM-1、
MMP-9等的表达水平。进一步对ABLO2抑制NF-
kB活化的作用机制进行研究时发现, ABLO2通过降
低IkB激酶IKK的活性而抑制IkB的磷酸化及泛素化
降解。此外, ABLO2通过抑制黏附分子表达, 消弱
了单核细胞与内皮细胞之间的黏附作用。上述结果
表明, ABLO2可解除炎性因子诱导的内皮细胞活化,
维持内皮细胞的正常功能, 抑制单核细胞在损伤部位
的募集和向内膜下迁移, 对预防和治疗血管炎性疾病
具有重要意义, 有开发为抗动脉粥样硬化新药的良好
前景。
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