全 文 ：基金项目： 国家自然科学基金项目 “莱茵衣藻缺氮诱导三酰甘油积累缺陷突变体筛选及功能分析” （No. 30960032）， 国家自然科学基金项目
“莱茵衣藻缺铁应答缺陷突变体构建及功能分析” （No. 30860028）， 中央级公益性科研院所基本科研业务费 “莱茵衣藻铁营养及微藻产氢”
（No. ITBBZX0841）资助。
第一作者简介： 周玉娇， 女， 1986 年生， 硕士研究生。 研究方向： 能源藻类生理生化。 E-mail: zhoujiaobeier@163.com。
* 通讯作者， 邓晓东， E-mail： xiaodong9deng@hotmail.com。
收稿日期： 2010-07-01 修回日期： 2010-08-30
第 31 卷 第 12 期 热 带 作 物 学 报 Vol．31 No．12
2010 年 12 月 CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS Dec.2010
小球藻紫外线诱变及高含油藻株筛选
周玉娇 1，2， 李亚军 2， 费小雯 3， 黎云祥 1， 邓晓东 2*
1西华师范大学环境科学与生物多样性保护省级重点实验室， 四川南充 637002
2
中国热带农业科学院热带生物技术研究所
农业部热带作物生物技术重点开放实验室 海南海口 571101
3海南医学院基础医学部生化教研室， 海南海口 571101
摘要 利用紫外诱变技术， 对海南本地淡水水域筛选得到的小球藻 Y019 进行诱变， 得到 1 100 株诱变株。 以
HSM 培养基和 HSM 氮缺乏培养基分别进行筛选， 筛选出 M37 和 M67 两个高含油量株系。 与野生型小球藻 Y019
相比， 其相对生长速率没有明显变化， 油脂含量分别提高了 24.58％、 17.88％， 具有良好的开发应用前景。
关键词 小球藻； 紫外诱变； 油脂含量
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2010.12.007
中图分类号 S555.6
小球藻（Chlorella vulgaris）为普生性单细胞绿藻， 在自然界中分布广泛， 是第一种人工培养的微藻[1-3]。
小球藻光合效率高， 含有丰富的蛋白质、 氨基酸、 不饱和脂肪酸、 维生素、 矿物质和色素等， 具有极其
丰富均衡的营养成分和优良的医疗保健作用， 是一种重要的微藻资源[4]。 同时， 由于它的高含油量和生长
迅速的特征， 被认为有可能成为生产生物柴油的重要藻株[5]。
紫外线对生物具有较强的生物学效应， 紫外诱变是一种有效的育种方法。 紫外线与化学诱变剂相比，
具有污染小、 操作简单， 且能使培养达到无菌等优点。 紫外线辐照影响 DNA 的复制与转录， 引起基因突
变和染色体畸变， 产生各种各样的变异[6]。
小球藻作为生物柴油的重要藻株因其株系和分离地不同， 含油量和生物量积累有所不同。 本项目前
期分离得到的本地小球藻 Y019 含油量在 HSM 培养基上最高可以达到 20％。 但油脂含量离大规模培养降
低生产成本的要求还不够。 本研究通过紫外线诱变筛选出油脂含量高， 生长速度快的藻株， 以期获得可
供开发利用的小球藻株系。
1 材料与方法
1.1 藻种
小球藻（Chlorella vulgaris Y-019）采自海口周边热带淡水水域， 通过平板分离纯化方法获取。
1.2 培养条件及生物量测定
挑取固体平板上培养的藻株至含有 1 mL ddH2O 的 2 mL 离心管中， 混合物用枪头吹打均匀， 分别取
适量接种于含有 50 mL HSM 和 HSM 氮缺乏液体培养基的 100 mL 三角烧瓶中， 置于恒温光照摇床中振荡
培养（培养条件为： 25℃， 230 r/min， 24 h全光照， 光照强度 50～110 μE·m-2·s-1）。 HSM培养基其成分如下：
NH4Cl 0.500 g/L、 MgSO4·7H2O 0.020 g/L、 CaCl2·2H2O 0.010 g/L、 K2HPO4 1.440 g/L、 KH2PO4 0.720 g/L、
12期 周玉娇等： 小球藻紫外线诱变及高含油藻株筛选
CH3COONa·3H2O 2.000 g/L、 H3BO3 0.001 g/L、 MnCl2·4H2O 0.005 g/L、 ZnSO4·7H2O 0.022 g/L、 FeSO4·7H2O
0.005 g/L、 CoCl2·6H2O 0.002 g/L、 （NH4）6Mo7O24·4H2O 0.002 g/L、 Na2·EDTA 0.050 g/L。 HSM氮缺乏培养基
其成分如下 ： MgSO4·7H2O 0.020 g/L、 CaCl2·2H2O 0.011 g/L、 K2HPO4 1.440 g/L、 KH2PO4 0.720 g/L、
CH3COONa·3H2O 2.000 g/L、 H3BO3 0.001 g/L、 MnCl2·4H2O 0.005 g/L、 ZnSO4·7H2O 0.022 g/L、 FeSO4·7H2O
0.005 g/L、 CoCl2·6H2O 0.002 g/L、 Na2MoO4·2H2O 0.002 g/L、 Na2·EDTA 0.050 g/L。 培养至一定浓度后取
样， 用 ddH2O 进行稀释， 用酶标仪（BIO-TEK Elx800）测定 490 nm 波长处各稀释样品的吸光值； 同时取
各稀释样品测定其干重， 并制作标准曲线。 培养期间每 48 h 取样 1 次， 用酶标仪测定 490 nm 波长处的
吸光值并依据标准曲线换算其生物量， 每组实验设 3 个平行。 平均相对生长速率（R）用下式表示： R＝
（lnQ2－lnQ1）/（t2－t1）其中： Q1是接种时（t1）的细胞密度， Q2 是生物量最大时（t2）的细胞密度。
1.3 中性脂含量测定
自 Greenspan 等 [7]提出用尼罗红（9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one）染色， 用荧光法测定
细胞内油脂含量以来， 先后在多种生物中证明尼罗红染色后细胞荧光强度与细胞内油脂含量显著相关。
Chungang Gao等[8]研究表明小球藻经尼罗红染色后细胞荧光密度与细胞内油脂含量成线性相关（R2=0.906 7）。
培养期间每 48 h取 200 μL藻液， 在加入 0.2 μL 0.1 mg/mL尼罗红染料和 1.8 μL DMSO孵育 10 min， 用荧
光发光检测仪以 480 nm 为激发波长， 575 nm 为消散波长分别测定光密度值 A1 和 A2， 并依据标准曲线
换算成油脂含量， 二者之差即为中性脂的吸收值， 每组实验设 3 个平行。 同时取样 10 μL 藻液， 与 1 μL
0.1 mg/mL尼罗红染料混合后制片， 采用荧光显微镜（Nikon 80i）， 以 480 nm激发波长、 570 nm 消散波长的
荧光滤镜观察细胞中脂滴的大小和数量。 以 Triolein（Sigma）做为油脂标准品在相同测定条件下检测， 并制
作标准曲线。
1.4 紫外线诱变
分别取对数生长期的 Y019小球藻藻液 1 mL置于 9 cm培养皿底部， 使藻液在培养皿底部铺一薄层， 用
18 W 紫外灯， 照射距离为 40 cm 进行不同时间的照射， 时间梯度为： 0、 5、 10、 15、 20、 30、 40 min，
设置 3 个平行。 根据致死率， 确定适合本实验的诱变剂量。 以上述预试验中确定的诱变剂量对小球藻
Y019 进行诱变。 诱变后将全部藻液暗培养 12 h 后涂于 HSM 固体培养基上， 15 d 后挑取体积较大、 颜色
浓绿的藻落于新的 HSM 固体培养基和 HSM 氮缺乏培养基上培养， 15 d 后进行油脂含量检测。 经初步筛
选的突变藻株进行液体培养。 分别取适量藻液接种于含有 50 mL HSM 液体培养基和 HSM 氮缺乏培养基
100 mL 三角烧瓶中， 置于恒温光照摇床中振荡培养（培养条件为： 25 ℃， 230 r/min， 24 h 全光照， 光照
强度 50～110 μE·m-2·s-1）。 比较突变藻株生长速率及油脂含量。 数据采用 Excel及 SPSS软件进行处理[9-10]。
2 结果与分析
2.1 紫外线诱变预试验结果
用紫外线处理 Y019 小球藻细胞后， 藻液颜
色由原来的绿色变浅。 在显微镜下观察， 存活细
胞数目随着照射时间的延长而降低。 在照射后第
3 天藻细胞死亡率稳定时， 统计其死亡率（图 1）。
使用的各种紫外线剂量对 Y019 小球藻细胞
都有致死作用， 其半致死剂量为 IC50=10 min。 为
了获得较多的突变株， 又不至于因为辐射剂量过
大造成大部分细胞死亡而残留一些不活跃的细
胞， 本实验中选用的是 18 W 紫外灯， 照射距离
40 cm， 辐射时间 13 min。
*表示差异性比较达显著水平， **表示差异性比较
达极显著水平。 下同。
图 1 不同剂量紫外线照射 Y019 小球藻致死率
100
80
60
40
20
0
0 5 10 15 20 30 40
辐射时间/min
*
* *
**
致
死
率
/％
2125
热 带 作 物 学 报 31 卷
2.2 小球藻 Y019及诱变株的生长状况
通过突变本实验共得到紫外线诱变株
1 100 株， 经 HSM 或 HSM 氮缺乏培养基
筛选油脂含量改变的藻株共 4 株。 HSM
培养基筛选的诱变株 M37 和野生型小球
藻 Y019 生长状况如图 2-1 所示， 二者生
长曲线相似， 诱变株 M37 生物量略低于
Y019 （经过图 3 所示曲线换算得出 ） 。
Y019 及 M37 生长速率较快， 相对生长速
率分别为： 0.87 和 0.84。 且在第 2 天达到
最大生物量 ， 生物量积累分别为 6.83×
107、 6.69×107 个细胞 /mL （表 1） 。 而在
HSM 培养基筛选的诱变株 M14 的相对生
长速率 0.39 低于野生型小球藻 Y019 的相
对生长速率 0.84， 但其在第 4 天达到的最
大生物量为 7.92×107个细胞/mL。 在 HSM
氮缺乏培养基筛选出 M67 诱变株， 生物
量略低于野生型 Y019（图 2-2）。 Y019 及
M67 的相对生长率分别为 ： 0.39、 0.39。
且在第 4 天达到最大生物量， 生物量积累
分别为 2.67×107、 2.49×107 个细胞/mL（表
2）。 而在 HSM 氮缺乏培养基筛选出 M54
诱变株， 其生长速率及最大生物量皆大幅
度地小于野生型小球藻 Y019（表 2）。
2.3 小球藻 Y019与诱变株含油量比较
藻细胞培养至第 8 天， 野生型 Y019
和 诱 变 株 M37 的 荧 光 密 度 分 别 为 4
323.55、 8 878.55， 经过标准曲线（图4）换
算得出， Y019和 Y019-M37的油脂含量分
别为 19.32％、 37.19％， 增加了 17.88％。
诱变株 M14 的油脂含量与野生型 Y019 相
比有明显下降 ， 油脂含量为 10.00％ 。
M67 诱变株在 HSM 氮缺乏培养基中， 第
0.4
0.3
0.2
0.1
0
干
重
/（
g/
L）
0 0.2 0.4 0.6 0.8
y=0.548 4x-0.041 1
R2=0.999 3
OD490
图 3 OD490与小球藻 Y019 干重线性关系图
图 2-1 诱变株在 HSM 培养基的生长曲线
培养时间/d
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8
Y019 Y019-M14 Y019-M37
**
** **
图 2-2 诱变株在 HSM-N 培养基的生长曲线
0 2 4 6
Y019 Y019-M67 Y019-M540.20
0.15
0.10
0.05
0.00
培养时间/d
图 4 荧光光密度与油脂含量的线性关系
0 2 000 4 000 6 000 8 000 10 000
y=0.020 7x+11.711
R2=0.991 1
250
200
150
100
50
0
油
脂
含
量
/（
m
g/
L）
荧光密度
细
胞
干
重
/(g
/L
)
细
胞
干
重
/(g
/L
)
2126
12期 周玉娇等： 小球藻紫外线诱变及高含油藻株筛选
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
Y019
Y019-M14
Y019-M37
2 4 6 8
**
培养时间/d
**
油
脂
含
量
/（
g/
g）
图 5-1 诱变株在 HSM 培养基的油脂积累
Y019
Y019-M67
Y019-M54
2 4
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
油
脂
含
量
/（
g/
g）
培养时间/d
图 5-2 诱变株在 HSM 氮缺乏培养基的油脂积累
**
Y019 Y019-M37
图 6 诱变株及 Y019 油脂的荧光定性分析
图片倍数： 10×40
图 7-1 诱变株在 HSM 培养基的油脂积累
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8
培养时间/d
细
胞
干
重
/（
g/
L）
Y019-M37 Y019-M37（5）
图 7-2 诱变株在 HSM 氮缺乏培养基的油脂积累
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0 2 4 6
Y019-M67 Y019-M67（5）
细
胞
干
重
/（
g/
L）
培养时间/d
4天野生型 Y019和诱变株 M67的荧光密度分别为 13 351.73、 18 919.07， 经过标准曲线换算得出， 其油脂
含量分别为 33.29％、 57.86％， 增加了 24.58％。 诱变株 M54 的油脂含量与野生型 Y019 相比有所下降。
小球藻 Y019和诱变株 M37培养 6 d后藻细胞显微镜观察结果如图 5 所示。 黄光荧光代表以三酰甘油为主
的中性脂， 可通过转酯化反应制备生物柴油； 橘红色荧光代表以磷脂为主的极性脂， 主要参与膜的构成
和代谢调控[11-12]。
综合考虑诱变株的生长状况及油脂含量， 诱变株 M37、 M67 的生长状况与野生型 Y019 相似， 且油脂
含量有了明显提高， 是理想的生物柴油来源。
2.4 高产油诱变株遗传稳定性分析
从第 1 代诱变株 Y019-M37 接种至第 5 代， 其生长状况如图 7-1。 第 1 代诱变株 M37 与第 5 代诱变
株其生状况没有明显变化， 生长速率相同， 且油脂含量也没有明显变化（图 8-1）， 说明诱变株 M37 具有
遗传稳定性。
2127
热 带 作 物 学 报 31 卷
图 8-1 诱变株在 HSM 培养基的油脂积累
培养时间/d
Y019-M37 Y019-M37（5）
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
2 4 6 8
油
脂
含
量
/（
g/
g）
*
*
图 8-2 诱变株在 HSM 氮缺乏培养基的油脂积累
Y019-M67 Y019-M67（5）
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
2 4
油
脂
含
量
/（
g/
g）
培养时间/d
从第 1 代诱变株 Y019-M67 接种至第 5 代， 其生长状况如图 7-2。 第 1 代诱变株 M67 与第 5 代诱变
株其生状况没有明显变化， 生长速率相同， 且油脂含量也没有明显变化（图 8-2）， 说明诱变株 M67 具有遗
传稳定性。
3 讨论
大量使用石油燃料使得能源危机和环境问题日益突出， 继续利用石油燃料被广泛认为是不可持续的，
寻找可替代的新能源是科学家们正努力的方向。 目前生物柴油主要来源于： 含油植物、 废油和动物脂肪，
而这些来源生产的生物柴油远远不能满足现在燃料的需要[13]。 微藻由于具有种类多样、 光合作用效率高、
生物产量高、 生长繁殖快、 生长周期短和自身合成油脂能力强的有利特点而被许多学者认为是制备生物
柴油最佳的原料之一[14]。 而且经证实， 微藻是唯一的可满足现在燃料需求的生物柴油来源[13]。
微藻生物柴油的价格高于石油燃料的价格， 因此如何降低微藻生物柴油的成本是一个关键的问题。
其成本可以通过遗传改良获得高含油微藻、 改进生物炼油技术及光合生物反应器来降低。 据统计， 生物柴
油制备成本的 75％是原料成本 [14]， 改进微藻的产油能力是从根本上解决问题， 生物量及油脂含量高的藻
株成为微藻生物柴油原料的较好选择。 小球藻生长迅速， 生物量大 [3]。 据邢翔、 张小葵等的研究， 批
量培养 Chlorella vulgaris 时细胞数目达 6.27×107个/mL， 细胞干重达 23.647 g/L[15]。 Anondho Wijanarko 等
的研究也显示批量培养 Chlorella vulgaris 时细胞干重达 22.3 g/L[16]。 故提高 Chlorella vulgaris 的细胞油脂含
量是目前降低成本的关键。
紫外线对高等植物具有较强的生物学效应， 能够在农业上进行诱变育种[4]。 在微藻中已有利用紫外线
对藻株进行诱变的成功例子， 如张学成等利用紫外诱变育种技术， 从 C. vulgaris 筛选出高产小球藻珠
M51、 M59、 M73， 其相对生长率分别比出发株提高了 6.23％， 3.8％， 5.92％[4]。 黄瑞芳等利用紫外线照射
的方法对巴氏杜氏藻 Dunaliella bardawil H-42 进行诱变， 得到两株总脂含量显著高于原出发株的突变株
HL-1和 HL-2， 它们的总脂含量分别比 H-42提高了 10.6％和 11.8％[17]。 本研究通过诱变得到 M37、 M67，
在相应的培养基中， 其油脂含量分别提高了 17.88％、 24.58％。 由于小球藻的相对生长速率大， 生物量
大， 且 M37、 M67的油脂含量有了明显提高， 具有良好的开发应用前景。
参 考 文 献
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2128
12期
责任编辑： 沈德发
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UV-Irradiation of Chlorella vulgaris and Screening of Petroliferous Strains
Zhou Yujiao1,2, Li yajun2, Fei Xiaowen3, Li Yunxiang1, Deng Xiaodong2
1 SiChuan Provincial Key Laboratory of Environmental Science and Biodiversity conservation, China
West Normal University, Nanchong 637002;
2 Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology, Ministry of Agriculture, Institute of Tropical Bioscienc
and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agriculture Science, Haikou 571101;
3 Hainan medical college, department of basic medicine, Haikou 571101
Abstract Continued use of petroleum fuel is widely recognized as unsustainable because of its scarce
supply and the accumulation of carbon dioxide in the air from it. Scientist are looking for renewable, carbon
neutral fuels. Biodiesel is a potential alternative to petroleum fuel. Microalgae appear to be one of the best
sources of renewable biodiesel that is capable of meeting the global fuel demand. Chlorella vulgaris Y019
which was obtained from freshwater in Haikou was irradiated by ultraviolet and 2 petroliferous mutants
named M37 and M67 cultured in HSM medium and N-deficiency HSM medium, were obtained from
the 1 100 strains. Compared with the parent strain, the triolein of mutants M37 and M67 increased by
24.58% and 17.88%, respectively. They may be potential strains for producing microalgae biodiesel.
Key words Chlorella vulgaris； UV-mutagenesis; Lipid content
周玉娇等： 小球藻紫外线诱变及高含油藻株筛选 2129