全 文 ：　　文章编号:1673-095X(2011)02-0058-05
四种纳米氧化物对小球藻的毒性效应研究
金星龙 , 张　宁 , 李　晓 , 岳俊杰
(天津理工大学 环境科学与安全工程学院 , 天津 300384)
摘　要:本文旨在研究四种纳米氧化物(nZnO、nNiO、nSiO
2
、nFe
2
O
3
)对小球藻(Chlorellavulgaris)的毒性效应.通过
不同浓度纳米材料对小球藻的 96 h急性毒性实验 ,考察了纳米氧化物对小球藻生长状况和藻细胞内叶绿素 、蛋白质
含量的影响.结果表明:低浓度纳米材料促进藻细胞生长 , 叶绿素 a和可溶性蛋白质含量也相应增加;高浓度纳米材
料对藻类均产生不同程度的生长抑制作用 , 该效应表现出一定的浓度依赖性 , 且 nZnO、 nNiO、 nSiO2和 nFe2O3开始
表现抑制作用的浓度分别为≥0.5 、1.0 、10.0和 100.0 mg/L.另外 , nZnO的半数效应浓度(EC50)值为 2.41 mg/L,
毒性最强;nNiO次之 , EC50值为 51.03 mg/L, nSiO2和 nFe2O3毒性较小 , EC50值分别为 198.80和 271.76 mg/L.
关键词:纳米材料;小球藻;生长抑制;叶绿素;蛋白质
中图分类号:X820.2　　　文献标识码:A　　　doi:10.3969/j.issn.1673-095X.2011.02.013
收稿日期:2011-03-03.
基金项目:国家自然科学基金(20807030);中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室开放基金(KF2008-10).
作者简介:金星龙(1973—　),男 ,博士 ,副教授 , E-mail:xljin7911@126.com.
ToxiceffectsoffournanoscaleoxidesonChlorelavulgaris
JINXing-long, ZHANGNing, LIXiao, YUEJun-jie
(SchoolofEnvironmentalScienceandSafetyEngineering, TianjinUniversityofTechnology, Tianjin300384, China)
Abstract:Basedon96hacutetoxicitytests, thetoxicefectsoffournanoscaleoxides(nZnO, nNiO, nSiO2 andnFe2O3)on
thegrowthandthecontentchangeofchlorophylandproteininChlorellavulgariswerestudied.Theresultsshowedthatnano-
materialsacceleratedthegrowthofalgaewithincreasingcontentofchlorophyllorproteinatalowerconcentration.Athigher
concentration, thegrowthofalgaewasinhibited, andrelatedwiththeirconcentration.Theleastinhibitionconcentrationof
nZnO, nNiO, nSiO2 andnFe2O3 was0.5, 1.0, 10.0and100.0 mg/L, respectively.BecausetheEC50 ofnZnOontheal-
gaewas2.41 mg/L, itstoxicitywasthehighest.TheEC
50
ofnNiO, nSiO
2
andnFe
2
O
3
onthealgaewas51.03, 198.80 and
271.76 mg/L, respectively.TheyindicatedthelowertoxicitythannZnO.
Keywords:nanomaterials;Chlorelavulgaris;growthinhibition;chlorophyl;protein
　　随着纳米材料在材料科学和纳米科技中的广泛
应用 ,人类暴露于纳米材料的危险性日益增加 ,其生
物安全性受到越来越多的重视.纳米材料的小粒
径 ,使其具有更大的迁移性和跨膜能力 [ 1] ,因而其危
害性更大.许多研究表明 ,纳米材料会引起靶器官炎
症 、促使机体产生氧化应激反应 ,甚至进入细胞和细
胞核内 ,表现出更大的生物效应.然而 ,纳米材料对
水生生物的潜在毒性还知之甚少 ,这一领域的大部
分研究集中于某几种纳米材料对水蚤的行为效应和
对鱼脑的损害 ,而对藻类毒性的研究并不多.从已发
表的文章看 ,这部分研究主要集中于有限几类纳米
材料的毒性效应 ,例如 , Park等 [ 2]研究了银纳米材料
对蓝藻铜绿微囊藻的生长抑制作用 ,朱小山等[ 3]研
究了三种金属氧化物纳米颗粒对斜生栅藻的毒性效
应等等.由于纳米材料种类繁多 ,许多纳米颗粒对藻
类毒性研究仍较少 ,因此 ,对纳米材料作用于藻类进
行研究具有十分重要的意义.
藻类细胞对许多毒物都很敏感 ,而且具有生长
第 27卷　第 2期
2011年 4月
天　津　理　工　大　学　学　报
JOURNALOFTIANJINUNIVERSITYOFTECHNOLOGY
Vol.27 No.2
Apr.2011
周期短 ,易于分离培养和可以直接观察细胞水平上
的中毒症状等优点 [ 4] ,常用于毒性实验研究.本文以
小球藻为受试生物 ,研究了相同尺寸的四种典型纳
米氧化物对小球藻生长状况 、叶绿素 a和蛋白质含
量的影响 ,探讨纳米材料的毒性大小 ,旨在为纳米材
料的生物毒性评价提供数据支持.
1　材料与方法
1.1　实验试剂与仪器
纳米氧化锌(nZnO)、纳米氧化镍(nNiO)、纳米
三氧化二铁(nFe2O3 , α相)和纳米二氧化硅(nSiO2)
均购自北京纳辰科技发展有限公司 , 粒径均为
30 nm,纯度大于 99.9%.实验中所用玻璃仪器在使
用前用 10%浓硝酸浸泡 48 h,然后用去离子水洗净 ,
经高温高压(121℃, 15 min)灭菌后待用.
1.2　藻种培养
在无菌条件下 ,取长势良好的小球藻藻种接种
到盛有 BG-11培养基的 250mL锥形瓶中 ,于光照培
养箱中培养 ,培养温度为(24±1)℃,光暗比为 12 h
∶12 h,光照强度为(3 000±10%)lx,每天定时摇晃
培养瓶数次.每隔 24 h用血球计数板在显微镜下计
数 ,重复 3次 ,取平均值.若计数值之间相差大于
15%,应重复计数.将处于指数生长期并达到同步生
长的藻液用于毒性测试.
1.3　暴露实验
将一定量的纳米材料加入无菌蒸馏水中 ,按一
定浓度梯度配制纳米材料悬浮液 ,进行超声分离 ,使
其充分分散 ,并在暴露实验前紫外照射 20 min.根据
预实验 ,暴露实验中纳米材料浓度梯度按以下设置 ,
nZnO:0、0.5、 1.0、 5.0、 10.0、15.0、20.0 (mg/L);
nNiO:0、0.1、1.0、10.0、40.0、60.0、100.0 (mg/L);
nSiO2:0、1.0、10.0、100.0、150.0、200.0、300.0 (mg/
L);nFe2O3:0、1.0、10.0、100.0、200.0、300.0、400.0
(mg/L).
在 250 mL三角瓶中加入 25 mL藻试验液(接种
密度为 1.6×106 /mL),再添加 75 mL各浓度梯度的
纳米材料悬浮液 ,溶液的终体积为 100 mL,培养周期
为 96 h.实验每个梯度设置 3个平行 ,结果取平
均值.
1.4　测定方法
藻生长量的测定:分别于混合培养后的 24、48、
72和 96 h观测小球藻的生长状况 ,用血球计数板在
显微镜下计数 ,并同时在 680 nm处测定吸光度值
(OD680),建立藻细胞密度与 OD680的线性关系 ,以进
行相互验证 ,以 OD680来表征藻生物量.纳米颗粒的
浊度会影响吸光度的测定 ,因此 ,测得的吸光度需扣
除纳米材料悬浮液的背景值.用概率单位法计算
96 hEC50.
叶绿素 a含量测定:取纳米材料作用 4 d后的藻
液 ,用体积分数为 90%的丙酮提取 ,并用戴荣继等的
方法计算叶绿素 a的含量 [ 5] .
可溶性蛋白质含量测定:取纳米材料作用 4d后
的藻液 ,离心(4 000 r/min, 15 min)后弃去上清液 ,
加 5 mL蒸馏水将藻转移至研钵中 ,研成匀浆 ,再离
心(4 000r/min, 10 min),将上清液转入 10 mL刻度
试管中 ,再向残渣中加 2 mL蒸馏水 ,悬浮后再离心
10min,合并上清液 ,定容至刻度 ,采用考马斯亮蓝法
测定可溶性蛋白质含量 , 以牛血清白蛋白作标准
曲线 [ 6] .
1.5　数据统计分析
用 SPSS15.0对实验数据进行方差分析 ,采用 t
检验 ,检测不同浓度处理组与对照组的差异显著性.
2　结果与讨论
2.1　纳米材料对小球藻生长的影响
2.1.1　生长抑制曲线分析
四种氧化物纳米材料对小球藻生长状况的影响
分别见图 1、2、3、4.从图中可以看出 ,除 nZnO外 ,其
它纳米材料在低浓度时表现出对小球藻生长的促进
作用(nZnO在低浓度时未表现出明显的促进作用),
这可能是因为藻细胞受到纳米材料胁迫 ,某些酶活
性增强 ,有利于藻的生长 ,而高浓度表现出抑制作
用 ,且浓度越高抑制作用越明显;在混合培养初期
(t<2 d),抑制作用不明显 ,随着培养时间的延长 ,
抑制作用逐渐增强.nZnO的抑制作用最强(图 1),
0.5 mg/L的处理组抑制作用不明显 (无统计学差
异), 1 mg/L时就表现出明显抑制 ,与对照组相比呈
现显著性差异(p﹤ 0.05);当浓度增大到 20 mg/L
时 ,生长基本停滞 ,相对数量法计算抑制率达到 92.
8%,显微镜下观察可见细胞萎缩变形 ,藻体颜色变
浅 ,甚至发白.这与冀静等 [ 7]的研究结论相似.相比
之下 ,其他三种纳米材料对小球藻的毒性较小 ,低浓
度的 nNiO未表现出明显抑制作用 ,在 1 mg/L时的
作用初期还能促进其生长(图 2),且在作用第 3 d后
·59·2011年 4月　　　　　　　　　　金星龙 ,等:四种纳米氧化物对小球藻的毒性效应研究
大于 40mg/L的浓度组才表现出明显抑制 ,抑制率
为35.8%;作用 4 d后 ,高浓度处理组(100mg/L)生
长极其缓慢 , 与对照组相比差异极其显著(p﹤ 0.
01),表现出部分细胞凋亡的现象 ,李永仙等 [ 8]在比
较纳米氧化镍和镍离子对细胞的胁迫性时也观察到
同样的现象.nSiO2对小球藻的生长抑制实验中(图
3),低浓度处理组与对照组曲线比较一致 ,高浓度组
的小球藻仍能缓慢生长;同样 , nFe2O3在 100 mg/L
时 ,才表现出明显抑制作用(图 4).
图 1　nZnO对小球藻的生长抑制
Fig.1　Effectsofnano-ZnOonthegrowthof
Chlorelavulgaris
图 2　nNiO对小球藻的生长抑制
Fig.2　Effectsofnano-NiOonthegrowthof
Chlorelavulgaris
图 3　nSiO
2
对小球藻的生长抑制
Fig.3　Effectsofnano-SiO2 onthegrowthof
Chlorelavulgaris
图 4　nFe2O3对小球藻的生长抑制
Fig.4　Effectsofnano-Fe2O3 onthegrowthof
Chlorellavulgaris
2.1.2　半数效应浓度计算与分析
半数效应浓度(EC50)值能够定量表征纳米材料
毒性效应的大小 , EC50值越小 , 纳米材料的毒性越
大.本文通过概率单位法计算了四种纳米材料对小
球藻的 96 hEC50值 ,结果见表 1.
从表 1可以看出 ,在本试验条件下 , nZnO的毒
性最强 , EC50为 2.41 mg/L;nNiO次之 , EC50为
51.03 mg/L,而 nSiO2和 nFe2O3对小球藻的毒性效
应比较弱 , EC50分别为 198.80和 271.76 mg/L.根
据 《水和废水监测分析方法 》中规定的毒性分级标
准 [ 9] , nZnO为高毒 , nNiO为中毒 , nSiO2和 nFe2O3
为低毒.
表 1　浓度对数与概率单位剂量反应方程和 EC50
Tab.1　Thedose-responseequationsoflogarithmic
concentrationandprobabilityunitandthevalueofEC50
纳米材料 剂量反应方程 R2 EC50 /(mg· L-1)
nZnO y=1.655 5x-7.399 7 0.920 9 2.41
nNiO y=3.176 1x-11.948 0.930 8 51.03
nSiO
2 y=0.787x+1.357 3 0.988 9 198.80
nFe2O3 y=1.355 9x-1.1746 0.983 6 271.76
　　注:y表示纳米材料的浓度对数 lnC, x表示小球藻受抑
制百分数.
2.2　纳米材料对叶绿素 a含量的影响
藻的生长过程中受到多种因素的影响 ,光合作
用是重要因素之一.叶绿素 a是藻类进行光合作用
的物质基础 ,其含量的高低可以表征藻类的存活情
况和生物量的大小.四种纳米材料对小球藻叶绿素 a
含量的影响见图 5.
·60· 　　　　　　　　　　天　津　理　工　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　第 27卷　第 2期
图 5　纳米材料对叶绿素 a含量的影响
Fig.5　Effectsofnanomaterialsonthechlorophyla
contentsofChlorellavulgaris
由图 5可见 ,首先 ,与对照组相比 ,随着处理浓
度的增加 ,经 nNiO、nSiO2和 nFe2O3处理后的小球藻
叶绿素 a含量曲线先增大后减小 ,经 nZnO处理的则
一直呈现下降趋势.这表明 , nNiO、nSiO2、nFe2O3低
浓度时可以促进叶绿素 a的合成 ,高浓度时抑制叶
绿素 a含量的增加 ,而 nZnO未表现出明显的促进作
用 ,这与本文 2.1节的研究规律是一致的.其次 , nZ-
nO在很低的浓度(0.5 mg/L)下 ,叶绿素 a含量已低
于对照组 ,随着浓度增大 ,叶绿素 a含量降低幅度很
大.如 , nZnO浓度为 15 mg/L时 ,处理组中叶绿素 a
含量为 0.67 mg/L,是对照组的 26.8%,此时 ,显微
镜下可见细胞形状不规则 ,大部分细胞变形裂解;而
对于 nNiO,浓度为 1 mg/L时 ,叶绿素 a含量与对照
组相差不大 , 浓度增大 , 叶绿素 a含量降低 , 如
60 mg/L的处理组中叶绿素 a含量相比对照组降低
了 37.6%;对于 nSiO2和 nFe2O3 , nSiO2低浓度处理
组(≤10 mg/L)的叶绿素 a含量明显高于对照组 ,
nFe2O3(≤100 mg/L)也有类似现象 ,浓度增大叶绿
素 a含量降低 , nSiO2和 nFe2O3在 300 mg/L的处理
组 ,叶绿素 a含量分别比对照组降低 56.7%和
41.2%.以上表明 , nZnO毒性最强 ,而 nFe2O3毒性
最小 ,因为铁是合成叶绿素时不可缺少的重要因子 ,
在一定的浓度范围内有利于叶绿素的合成 ,浓度过
高才会影响叶绿素的含量.
综上 ,低浓度的纳米材料悬浮液对藻细胞产生
一定的刺激作用 ,促进叶绿素的合成 , 光合作用增
强 ,从而藻生物量增加.当纳米材料悬浮液浓度增大
到一定范围 ,超出藻细胞的自我调节能力 ,纳米材料
就成为有毒物质 ,破坏藻细胞的叶绿体结构 ,影响其
正常生理功能 ,进而阻碍光合作用的进行 ,导致藻类
生长受阻.本实验通过检测不同浓度的纳米材料对
叶绿素 a含量的影响 ,表明存在浓度 -效应关系.
2.3　纳米材料对可溶性蛋白质含量的影响
蛋白质是藻细胞正常生理功能的物质保障 ,其
含量的变化可以反映受试藻类受毒害的状况[ 10] .四
种纳米材料对小球藻细胞蛋白质的影响见图 6.从图
中可以看出 , nZnO处理后的小球藻细胞中蛋白质含
量下降 ,且随质量浓度不断增高 ,蛋白质含量逐渐降
低 ,高浓度组(10 mg/L)相比对照组下降了 44.5%,
呈显著性差异(p<0.05).实验发现 ,随纳米氧化锌
浓度的增大 ,藻体颜色逐渐变黄 ,聚集现象越来越明
显 ,当浓度为 20 mg/L时 ,藻体成片聚集 ,藻体颜色
几乎接近透明.nNiO的低浓度处理组(≤1 mg/L)蛋
白质含量略有增加 ,与对照组相比无统计学差异;高
浓度处理组(浓度分别为 10、40、60、100 mg/L)蛋白
质含量逐渐降低 ,相比对照组分别下降了 9.7%、
10.9%、18.8%和 40.5%.nSiO2和 nFe2O3的浓度在
100 mg/L以内时 ,蛋白质含量均有增加 ,其它处理组
随浓度增加依次下降 ,在 300 mg/L时蛋白质含量分
别是对照组的 58.0%和 77.8%.
图 6　纳米材料对小球藻蛋白质含量的影响
Fig.6　Effectsofnanomaterialsontheprotein
contentsofChlorellavulgaris
以上可以看出 ,纳米材料在一定浓度范围内有
利于蛋白质的合成 ,超出一定浓度范围后会阻碍蛋
白质合成 ,这是高浓度纳米材料抑制小球藻生长的
原因之一.这也同时表明 ,小球藻细胞中蛋白质含量
的高低与其生长状况密切相关.另外 ,分析四种氧化
物纳米材料毒性效应不同的原因可能是 , nZnO的毒
性最强是与其光敏性和可以溶出锌离子有关;nNiO
也可以释放出镍离子 ,因而毒性也比较强;nSiO2和
nFe2O3作为生物医学上的常用材料 ,有较好的生物
相容性 ,毒性相对较低.此外 ,四种纳米材料虽然粒
径一致 ,但是对藻类的毒性效应各异 ,因此 ,纳米材
料的毒性效应不只取决于其粒径大小 ,还受其它因
·61·2011年 4月　　　　　　　　　　金星龙 ,等:四种纳米氧化物对小球藻的毒性效应研究
素的影响.
3　结　论
1)相同尺寸的纳米材料表现出不同的毒性效
应.低浓度的纳米材料对小球藻的生长起促进作
用 ,增大到一定浓度后表现出抑制作用 , 呈现出一
定的浓度和时间依赖性.其中 , nZnO毒性最强 ,
EC50值为 2.41mg/L;nNiO次之 , EC50值为 51.03 mg/
L;nSiO2和 nFe2O3毒性最小 , EC50值分别为 198.80
和 271.76mg/L.
2)四种 纳米 氧化 物 (nZnO、 nNiO、 nSiO2 、
nFe2O3)对小球藻的生长开始表现抑制作用的质量
浓度分别为 0.5 、1.0 、10.0和 100.0mg/L.同时 ,低
于这一浓度时 ,相对于对照组叶绿素 a含量和可溶
性蛋白质含量升高 ,而高于这一浓度时两者含量逐
渐降低 ,这进一步表明纳米材料的毒性呈现浓度 -
效应关系.
致谢:感谢南开大学环境科学与工程学院朱琳
教授为本研究提供藻种及技术指导.
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