全 文 ：收稿日期:2011 － 07 － 29;修回日期:2011 － 09 － 30
基金项目:国家自然科学基金项目(50907074)。
作者简介:王海英(1974) ，女，副教授，博士，研究方向为微
藻生物技术(E-mail)whyzxb@ 163. com。
检测分析
基于尼罗红荧光染色的小球藻脂质
快速检测方法研究
王海英，符 茹，黄宝祥
(中南民族大学 微生物与生物转化重点实验室，武汉 430074)
摘要:尼罗红荧光染色的脂质测定方法已经应用到一些种类的微藻当中，但在细胞壁较厚的一些绿
藻中因不易染色而无法应用。选用了 4 株小球藻，对尼罗红荧光染色测定脂质的方法进行改进，采
用 20%二甲基亚砜溶液作为渗透剂，在 35 ～ 40 ℃下对藻细胞进行前处理，加强尼罗红与胞内脂质
的结合;藻细胞密度的 OD540在 0. 8 ～ 1. 1 范围内，加入 15 μL质量浓度为 0. 1 mg /mL的尼罗红丙酮
溶液染色可以有效提高荧光发射强度。该方法能够较为准确地反映胞内脂质含量，可以作为自然
界中广泛筛选富脂绿藻的快速检测方法。
关键词:小球藻;脂质;尼罗红;荧光
中图分类号:TS224;TQ646 文献标志码:A 文章编号:1003 － 7969(2012)03 － 0078 － 04
Rapid determination of lipid in Chlorella based on Nile red fluorescence
WANG Haiying，FU Ru，HUANG Baoxiang
(Key Lab for Microorganisms and Biotransformation，South － Central University for
Nationalities，Wuhan 430074，China)
Abstract:The Nile red fluorescence method has been successfully applied to determine the lipids in cer-
tain microalgae，but it could not be applied in those with thick cell walls. The solvent of dimethyl sulfox-
ide(DMSO)was introduced to four strains of Chlorella samples as the penetrating agent at an elevated
temperature to enhance the combination of Nile red and lipid. In the improved Nile red fluorescence stai-
ning method，the microalgae cell with OD540 of 0. 8 － 1. 1 was pretreated with 20% DMSO at 35 － 40 ℃
by water bath，and dyed by adding 15 μL Nile red(concentration 0． 1 mg /mL). The fluorescence intensi-
ty with the improved method was enhanced. The improved Nile red fluorescence staining method could be
used as a rapid detection technique for screening of naturally － occurring algal strains in a broader spec-
trum for high lipid production.
Key words:Chlorella;lipid;Nile red;fluorescence
微藻含有丰富的脂质，具有光合作用效率高、环
境适应能力强、生长周期短、生物产量高的特点，成
为国内外公认的生产生物质能源的理想原料［1 － 2］。
筛选脂质含量高的微藻，成为当前能源微藻资源开
发研究中的热点和难点。微藻细胞内的脂质含量是
决定以微藻为原料制备生物能源的关键，也是能否
实现商业化生产的主要因素之一。目前，传统的微
藻脂质测定方法主要是有机溶剂提取称重的方法，
但原料需求量大，效率低，安全性差，存在一定的局
限性，无论是对优良藻种的筛选，培养条件的优化或
是藻采收时期的确定，建立快速简便低能耗的微藻
脂质测定方法尤为重要。
尼罗红(9 － diethylamino － 5H － benzo［a］phe-
noxazine － 5 － one)是一种脂溶性的荧光染料，能够
与脂类物质(包括甘油酯、磷脂、蜡以及各种脂肪
酸)相结合，选择合适的激发波长可显示强烈桔红
色荧光(发射波长 480 nm)。因此，可以利用尼罗红
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与脂类物质结合发出的荧光检测信号，对细胞内的
脂类含量进行快速、灵敏、可靠的活体定量测定。这
种方法被广泛用于各种细胞，也被成功作为荧光探
针检 测 Isochrysis galbana，Emiliania Huxleyi 和
Crypthecodinium cohnii等一些藻类的脂质含量［3 － 4］。
目前该方法应用较多是属于硅藻纲、黄藻纲、褐藻纲
的藻，而很少有应用到绿藻纲中。传统的尼罗红染
色是以水溶液为媒介进行染色的，以往研究发现属
于绿藻纲的一些小球藻的脂质并不能用该方法测
定，可能是由于较厚的细胞壁组成和结构阻止了尼
罗红染料穿透细胞壁和细胞质膜，使其不能有效地
与胞内脂质相结合。小球藻是一类重要的可以作为
脂质来源的微藻，为了能用尼罗红荧光法分析这一
类藻细胞中的脂质，本文以 4 株小球藻为材料，通过
物理和化学的预处理，提高尼罗红染色的有效性，优
化尼罗红荧光法检测胞内脂质的条件，建立便捷快
速的检测小球藻细胞内脂质含量的方法。
1 材料与方法
1. 1 藻种
选用了 4 株小球藻 Chlorella pyrenoidosa No. 1、
Chlorella pyrenoidosa No. 2、Chlorella vulgaris No. 1、
Chlorella vulgaris No. 2 和 1 株三角褐指藻 Phaeodac-
tylum tricornutum(均来自中南民族大学生命科学学
院发酵工程实验室) ，经抗生素法制备无菌藻株。
1. 2 藻种的活化及培养
小球藻的活化和培养采用改进的 Bristol’s solu-
tion 培养基(g /L) :NaNO3 0. 25，K2 HPO4·3H2 O
0. 075，MgSO4·7H2 O 0. 075，CaCl2·2H2 O 0. 025，
KH2 PO4 0. 175，NaCl 0. 025，FeCl3·6H2 O 0. 005，
Fe － EDTA(0． 49 g /L)1 mL，A5微量元素液 1 mL。
其中 A5微量元素液(g /L) :ZnSO4·7H2 O 0. 22，
H3BO3 2. 86，MnCl2 · 4H2 O 1. 81，CuSO4 · 5H2 O
0. 079，(NH4)6 MO7 O24·4H2 O 0. 039，土壤提取液
1 mL。Phaeodactylum tricornutum 采 用 f /2 培 养
基［5］。250 mL三角瓶中装 100 mL 液体培养基，接
种量 10%，28 ℃静置培养，光照强度 4 500 lx，光暗
比为 12 ∶ 12(h /h) ，每日随机调换三角瓶并摇动 2 ～
3 次悬浮藻细胞。
1. 3 传统尼罗红染色法
取培养至对数生长期后期的藻液适量，
8 000 r /min 离心 5 min，去除上清，藻细胞沉淀用
PBS缓冲溶液洗两次，用 PBS重悬藻细胞至 OD540值
0. 8，1 mL 藻液加 15 μL 尼罗红染料(质量浓度为
0. 1 mg /mL丙酮溶液) ，室温下混匀染色 5 min，激发
波长 480 nm，测定其在 575 nm波长的荧光强度。
除了特殊说明，以下所有实验均做 3 个平行。
1. 4 称重法［6］
提取溶剂为氯仿 － 甲醇混合溶液(体积比为
2 ∶ 1) ，室温下在 0. 3 g藻粉中加入 3 mL 提取溶剂，
超声提取约 10 min，6 000 r /min 离心 5 min，取固体
层以下脂质层，重复此步骤 3 ～ 5 次。合并所有脂质
层溶液于已恒重好的离心管中，于 80 ℃水浴蒸干溶
剂，放入 40 ℃烘箱中过夜干燥至恒重，计算脂质
含量。
1. 5 数据处理
用统计软件 GraphPad Prism 5 的单因素方差分
析(ANOVA)中的 Dounnett 多重比较进行数据差异
性分析。
2 结果与分析
2. 1 传统尼罗红染色法对小球藻染色的局限性
图 1 是尼罗红染色后检测到的 5 株藻的荧光强
度，4 株小球藻都只有很微弱的荧光强度(2. 50 ～
5. 13)。三角褐指藻 P. tricornutum 产生的荧光强度
达到 51. 68，是 4 株小球藻荧光强度的 10 倍以上。
通过称重法测定 P. tricornutum 的脂质含量为
17. 4%，4 株小球藻的脂质含量在 14% ～ 19%内，与
P. tricornutum 脂质含量相差不大。这种溶剂提取
称重法与尼罗红染色荧光强度的巨大差别，与 Chen
等［7］的研究结果一致，可以认为尼罗红染色法的有
效性和微藻的分类及结构有关系。P. tricornutum属
于褐藻纲，胞内脂质与尼罗红能够较好结合，而属于
绿藻纲的 4 株小球藻则可能由于尼罗红染料不能与
细胞中的脂质有效结合而导致发射的荧光强度较
低。可见同一染色条件下不同藻种的荧光强度并不
能作为脂质含量的指示。
2. 2 改进尼罗红染色法测定小球藻脂质方法的
优化
2. 2. 1 不同有机溶剂预处理对染色的影响
传统尼罗红染色法不能有效测定小球藻中的脂
质含量，如果能找到一种处理方法来影响细胞壁和
972012 年第 37 卷第 3 期 中 国 油 脂
质膜的完整性以促进尼罗红染料与脂质的结合，从
而发射出较强的荧光强度。取培养至对数生长期后
期的藻液适量，8 000 r /min 离心 5 min，去除上清，
藻细胞沉淀用 PBS 洗两次，分别采用 20%的甲醇、
乙醇、异丙醇、丙酮、二甲基亚砜水溶液，水以及 PBS
缓冲溶液，重悬藻细胞至 OD540值 0． 8，35℃水浴
20 min，按 1 mL 藻液加 15 μL 尼罗红染料(质量浓
度为 0． 1 mg /mL丙酮溶液) ，混匀染色 5 min，激发
波长 480 nm，测定其在 575 nm波长的荧光强度，结
果见图 2。
图 2 显示，与水和 PBS 缓冲液相比，20%的甲
醇、乙醇、异丙醇、丙酮的处理并没有增加藻的荧光
强度，而 20%的二甲基亚砜(DMSO)对藻的预处理
得到了较高的荧光强度。DMSO能够改变生物膜对
电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性，促进了尼
罗红染料进入藻细胞。因此，选择 20%的 DMSO 水
溶液重悬藻细胞进行预处理。
2. 2. 2 DMSO体积分数对染色的影响
取培养至对数生长期后期的藻液适量，
8 000 r /min离心 5 min，去除上清，藻细胞沉淀用
PBS洗两次，分别采用不同体积分数的 DMSO(0、
5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%)水溶
液重悬藻细胞，使藻液 OD540值 0． 8，40℃水浴 20
min，按 1 mL藻液加 15 μL尼罗红染料(质量浓度为
0． 1 mg /mL 丙酮溶液) ，混匀染色 5 min，激发波长
480 nm，测定其在 575 nm 波长的荧光强度，考察
DMSO体积分数对染色的影响，结果见图 3。
图 3 显示，当用体积分数为 20%的 DMSO 处
理 4 株小球藻时，均出现最大荧光强度。因此，后
续实验均采用体积分数 20% 的 DMSO 水溶液预
处理。
2. 2. 3 预处理温度对染色的影响
按 2. 2. 2 方法，采用 20%DMSO水溶液预处理，
分别在不同温度下(20、30、35、40、45、50、55、60 ℃)
水浴 20 min，考察预处理温度对染色的影响，结果见
图 4。
图 4 显示，加入 20%的 DMSO 后，尼罗红染色
的 4 种小球藻在预处理温度为 35 ～ 40 ℃时有较高
的荧光强度。除了 C. pyrenoidosa No. 2 在 45 ℃温
度下出现了较强的荧光强度，其他小球藻在预处理
温度超过 40 ℃时，荧光强度都出现降低。
2. 2. 4 尼罗红染料用量对染色的影响
按 2． 2． 2 方法，采用 20% DMSO水溶液稀释藻
液，在 40 ℃水浴 20 min，按 1 mL藻液加入不同体积
质量浓度为 0． 1 mg /mL的尼罗红染料丙酮溶液，考
察不同尼罗红染料用量对染色的影响，结果见图 5。
图 5 显示，尼罗红染料用量在 5 ～ 15 μL 之间时，4
株小球藻的荧光强度均随尼罗红染料用量的增加而
逐渐增强，在 15 μL 时达到最大，超过15 μL时荧光
强度逐渐减弱。
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2. 2. 5 藻细胞密度对染色的影响
取对数生长期后期藻细胞用 20%DMSO水溶液
按不同比例稀释，得到一系列细胞密度不同的藻液
(以 OD540表征) ，然后 40 ℃水浴 20 min，按 1 mL 藻
液加 15 μL尼罗红染料(质量浓度 0． 1 mg /mL丙酮
溶液) ，混匀染色 5 min，激发波长 480 nm，测定其在
575 nm波长的荧光强度，考察藻细胞密度对染色的
影响，结果见图 6。
图 6 中尼罗红染色的 4 株小球藻荧光强度均随
OD540的增大而增强，到达最高值后，随着 OD540的继
续增加而略有下降。4 株小球藻重悬液的 OD540值
在 0. 8 ～ 1. 1 时，荧光强度达到最大。
2. 3 改进的尼罗红染色法和传统尼罗红染色法、称
重法的比较
图 7 是对 4 株小球藻分别用传统尼罗红染色
法，改进的尼罗红染色法和称重法进行测定的结果。
与传统尼罗红染色法相比，改进的尼罗红染色
法的荧光强度显著增强(p ＜ 0. 01) ，重复性也很好。
说明改进的尼罗红染色法可以实现厚壁小球藻的染
色，更为准确地反映胞内脂质含量，可以用作绿藻脂
质含量的快速筛选。
3 结 论
针对一些小球藻的尼罗红不易染色的问题，选
取 4 株小球藻为材料，通过物理和化学的预处理，提
高了尼罗红染色的有效性。优化的小球藻细胞脂质
尼罗红活体染色的条件为:使用 20%的 DMSO作为
渗透剂，在水浴温度 35 ～ 40 ℃ 下对 OD540 值为
0. 8 ～ 1. 1 的藻液进行预处理，然后以 1 mL 藻液用
15 μL质量浓度为 0． 1 mg /mL的尼罗红丙酮溶液进
行染色。
改进的尼罗红染色法加强了尼罗红染料与小球
藻脂质的结合，所发射的荧光强度较好地反映了小
球藻细胞脂质的含量。与传统的称重法比较，该方
法具有原料需求少、效率高、低能耗的特点，可以作
为筛选高脂质含量绿藻的快速检测方法。
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