全 文 ：第 21卷第 3期 大 连 水 产 学 院 学 报 V o.l 21 No. 3
2 0 0 6年 9月 JOURNAL OF DALIAN FISHER IES UN IVERSITY S ep. 2 0 0 6
研究简报 文章编号:1000 -9957(2006)03 - 0294 - 03
小球藻多糖的分离纯化和组成分析
李亚 清 1 , 　杨海 波 2 , 　刘　艳 2 , 　王心 满 3
(1.大连理工大学精细化工国家重点实验室 ,辽宁 大连 116012;2.大连大学 环境与化学工程学院 ,
辽宁 大连 116622;3.辽宁省朝阳师范高等专科学校 生物化学工艺系 ,辽宁 朝阳 122000)　
摘要:采用冻结 -融化方法 , 用冷水提取海水小球藻 Chlorella sp. 多糖 , 多糖经除蛋白 、 乙醇分级沉
淀 、 柱层析等一系列步骤处理后 , 得到组分均一的小球藻多糖 (简称 CPSB - 1)。将 CPSB - 1完全酸
水解 , 用高效阴离子液相色谱对其溶液进行分析 , 结果表明:组成多糖 CPSB - 1的单糖有 D -岩藻
糖 、 D -鼠李糖 、 D - 2 -氨基葡萄糖 、D -半乳糖 、 D -葡萄糖和几种未知的单糖;各已知糖基的摩尔
比为 D -岩藻糖∶D -鼠李糖∶D -2 -氨基葡萄糖∶D -半乳糖∶D -葡萄糖 =1. 3∶1.0∶1.4∶1.2∶3.1。
关键词:小球藻;多糖;分离纯化;组成分析
中图分类号:Q53;Q949　　　　文献标识码:A
小球藻 Ch lorella sp. 为单细胞绿藻 , 有 “药物藻类 ” 之美誉 。小球藻提取液具有激活淋巴细胞 、
增强机体免疫力 、抵抗外来疾病的入侵 、 促进人体受伤组织修复等作用 , 还能防止胃溃疡 、高血压和
心脑血管疾病的发生 , 是目前国内外研究开发的热点。多糖是小球藻提取液中众多活性成分之一 , 目
前关于该项内容的研究报道不多 [ 1 - 2] 。本试验中 , 作者采用冻结 -融化方法 , 用冷水等一系列步骤处
理提取海水小球藻多糖 , 并对小球藻多糖的组成进行了分析 。
1　材料和方法
1.1　材料
试验用海水小球藻藻种由辽宁省海洋水产研究院提供 , 在实验室内进行培养。 Sephadex G - 50由
Pharmacia公司生产 , D -葡萄糖 、 D -半乳糖 、 D -岩藻糖 、 D -鼠李糖 、 D -阿拉伯糖 、 D -木糖 、
D -果糖 、 D -赤藓糖 、 D -2 -氨基葡萄糖均由美国 Sigma公司生产 , 其它试剂或溶剂均为 ACS级 ,
由比利时 Acros公司生产 。
1.2　方法
1.2.1　分离纯化　1)将生长至平衡期的小球藻液离心 (3 500 r /m in) 5m in, 获得新鲜的小球藻藻
泥;2)向藻泥中加入 5倍体积的去离子水 , 置于冰箱 ( -4℃)中冷冻 , 然后取出融化 , 如此反复 3
次提取水溶物;3)将冻融后的溶液离心 (4 500 r /m in) 10m in, 弃残渣 , 取上清液;4)将上清液在
水浴中加热 , 浓缩至原体积的 1 /3, 然后加入体积分数为 3%的三氯乙酸沉淀蛋白 , 离心 (12 000
r /m in) 10 m in, 取上清液;5)在上清液中加入 5倍体积的乙醇溶液 (体积分数为 95%), 所得的沉
淀物即为小球藻粗多糖;6)将粗多糖溶于水 , 再用体积分数分别为 10%、 30%、 50%的乙醇进行分
级沉淀 , 最终得到 3个级别的多糖 , 记为 CPSA、 CPSB和 CPSC (CPS为英文 Ch lo re lla po lysaccha ride
的缩写 ), 其中 CPSB的含量较大 。
取一定量的 CPSB加入适量的蒸馏水至完全溶解 , 用 Sephadex G - 50 (柱型:1.5 cm ×75.0 cm)
柱层析 , 进一步纯化 。上样后用 0.02mo l /L的 N aC l溶液洗脱 , 流速为 0.3mL /m in, 每管收集 3 mL,
然后用蒽酮 -硫酸法 [ 3]跟踪检测。收集含糖部分的洗脱液 , 经蒸馏水透析 、 浓缩 , 用体积分数为
　收稿日期:2004-12-25
　基金项目:辽宁省博士科研启动基金资助项目 (001059)
　作者简介:李亚清 (1964 - ), 女 , 副教授。 E -m ail: ssq f200510@163. com　通讯作者:杨海波 , 女 , 教授。 E -m ail:
cnyanghb@126. com
DOI牶牨牥牣牨牰牭牫牭牤j牣cnki牣dlhyxb牣牪牥牥牰牣牥牫牣牥牪牨
95%的乙醇沉淀 , 再离心 (12 000 r /m in) 10 m in。沉淀物依次用无水乙醇 、丙酮洗涤 , 然后在低温
60℃下干燥 , 即获得纯品 CPSB -1。
1.2.2　纯度鉴定　用两种方法对 CPSB - 1的纯度进行鉴定:1)醋酸纤维素薄膜电泳法[ 4] ;2)
HPLC法 。
检测仪器为:HPLC岛津高效液相色谱仪 (LC -10AT VP);WATERS 2414示差折光检测仪;色
谱柱为 TSK G400不锈钢柱;记录仪为岛津 C -R6A 。多糖 CPSB - 1样品的浓度为 2 g /L, 进样量为
20 μL, 流速为 1 mL /m in, 流动相为 1.0 g /L的 NaC l。
1.2.3　紫外光谱和红外光谱的测定　用 KBr法压片 , 然后用 N ICOLET - 560型红外光谱仪测定;用
UV - 755B型紫外可见分光光度计测定多糖 CPSB - 1饱和溶液的吸光值 , 空白溶液为蒸馏水 。
1.2.4　多糖的组成测定　1)蛋白质和淀粉的检测　用茚三酮法 [ 5]检测 CPSB -1中的蛋白质 , 用 K I
- I2试剂检测淀粉。
2)糖基组成的测定　称取 3 mg多糖 CPSB - 1样品置于 10 mL水解管中 , 加入 2moL /L的三氟
乙酸 2mL, 然后充氮气 , 封管。在 121℃下水解 1 h[ 6] , 冷却 , 40℃下减压蒸发干燥 。再加入 1mL蒸
馏水 , 减压蒸发干燥 , 重复 3次 , 保证未反应的三氟乙酸挥发干净。将水解后的样品溶于蒸馏水 , 用
高效阴离子液相色谱仪 (HPAEC - PAD)进行分析 。
高效液相色谱仪的色谱条件:ESA Inc582型高压泵 542型自动进样器 , Cou lochemⅡ电化学检测
器 , Dionex Inc(USA)CarboPac TM PAⅠ型色谱柱 (250 mm ×4mm), CoulA rray fo rw indow s色谱工作站 。
糖的液相色谱条件:流动相 A为水 , 流动相 B为 100 mmo l /L的 N aOH 水溶液;洗脱液为流动相
A与 B的混合液 (1∶1)。糖醛酸的液相色谱条件:流动相 A为 100mmo l /L的 N aOH水溶液 , 流动相
B为 100mmo l /L的 NaOH水溶液 +1mmol /L的 NaA c溶液;洗脱液为 85%的流动相 A +15%流动相
B。流速为 1 mL /m in, 柱温为 30℃。
2　结果与讨论
图 1　小球藻多糖 CPSB的分离纯化谱图
　F ig.1　Elu tion pa ttern of Ch lorella poly-
saccharide ( CPSB ) through
Sephadex G -50 column
新鲜的小球藻经冻结 -融化 、冷水提取 、 乙醇分级 , 得
到 3个多糖组分 , 分别为 CPSA、 CPSB和 CPSC。 CPSB经
Sephadex G - 50柱层析 (图 1)纯化得到多糖 CPSB - 1, 该
糖为白色粉末。
多糖 CPSB - 1的醋酸纤维素薄膜电泳的单一泳带 (图
2)和 HPLC (图 3)的单一峰均表明该多糖组分均一。红外
光谱显示 CPSB - 1具有多糖的特征吸收峰 , 分别为 3445、
2920、 1650、 1375、 1147、 1076、 1040 cm -1 (图 4), 具有
1650 cm
-1的吸收峰 , 表明糖环上有酰基 。紫外光谱在 260
nm和 280 nm处无特征吸收峰 , 表明该物质不含共轭双键。
多糖 CPSB - 1与茚三酮 、 K I - I2反应呈阴性 , 说明其中
可能不含游离或结合的蛋白质 , 也不含淀粉。
图 2　多糖 CPSB - 1的电泳谱图
F ig.2　Electrophoresis ofCPSB -1
图 3　多糖 CPSB - 1的液相色谱图
F ig. 3　Profile of CPSB -1 on HPLC
用高效阴离子液相色谱仪对多糖 CPSB - 1水解液的分析结果表明 , CPSB - 1中不含有糖醛酸。
与标准单糖的液相色谱相比较 , 可以确定组成多糖 CPSB - 1的单糖有 D -岩藻糖 、 D -鼠李糖 、 D - 2
-氨基葡萄糖 、 D -半乳糖 、 D -葡萄糖和几种未知的单糖 (图 5)。各已知单糖的摩尔比为 D -岩藻
295第 3期　　　　　　　　　李亚清 ,等:小球藻多糖的分离纯化和组成分析
糖∶D -鼠李糖∶D -2 -氨基葡萄糖∶D -半乳糖∶D -葡萄糖 =1.3∶1.0∶1.4∶1.2∶3.1 (表 1)。
图 4　多糖 CPSB - 1的红外光谱图　　　　 图 5　多糖 CPSB - 1水解液的高效阴离子液相色谱图　　　　
F ig. 4　 In frared spec trum of CPSB - 1 F ig. 5　HPAEC -PAD spec trum of hydrolyzed solu tion of CPSB - 1
在多糖 CPSB - 1中 , 各种糖基的比例相差不是很大 , 但 D -鼠李糖的含量很高 , 这在天然多糖
中不多见。 CPSB - 1很可能具有不同一般多糖的生理活性 , 有待于进一步进行药理生理活性检验。
　　陈清花等[ 1] 从海水小
球藻中纯化出的多糖 , 组成
糖基为鼠李糖 、 核糖 、阿拉
伯糖 、 木糖 、甘露糖 、葡萄
糖和半乳糖 , 其含量分别为
3.0%、1.9%、1.3%、1.3%、
1.5%、 82.0%和 8.2%, 主
要糖基为葡萄糖和半乳糖 。
表 1　多糖 CPSB - 1水解液中单糖的液相色谱数据和分析结果
Tab. 1　Quant itative ana lysis ofm onosacchar ide in CSPB - 1
　　单糖
m onosaccharide
单糖保留时间
reserved time /m in
单糖含量
con tent /(m g g- 1)
单糖摩尔比
m ol ratio
D -岩藻糖 D - fucose 2. 45 0. 3492 1. 3
D -鼠李糖 D - rh amnose 3. 14 0. 2799 1. 0
D - 2 -氨基葡萄糖 D -2 - glucosam ine 3. 67 0. 4167 1. 4
D -半乳糖 D - galactose 4. 03 0. 3807 1. 2
D -葡萄糖 D - glu cose 4. 27 0. 9450 3. 1
这与本试验结果有很大的不同 , 可能与所选用藻种不同或多糖提取纯化的方法不同有关 。
致谢:本试验得到大连理工大学精细化工国家重点实验室张淑芬教授的指导 ,在此表示衷心感谢 
参考文献:
[ 1] 　陈清花 ,李文权 ,张赛金 ,等.海洋微藻多糖组成的气相色谱分析[ J] .厦门大学学报:自然科学版 , 2003, 42(4):495 - 498.
[ 2] 　张赛金 ,李文权 ,邓永智 ,等.海洋微藻多糖的红外光谱分析初探[ J] .厦门大学学报 , 2005, 44(增刊):212 - 214.
[ 3] 　李建武 ,萧能赓 ,余瑞元 ,等.生物化学原理和方法 [M ] .北京:北京大学出版社 , 1994.
[ 4] 　张惟杰.糖复合物生化研究技术 [M ] .杭州:浙江大学出版社 , 1999:79.
[ 5] 　李建武 ,萧能赓 ,余瑞元 ,等.生物化学原理和方法 [M ] .北京:北京大学出版社 , 1994:150 - 151.
[ 6] 　斯奈德 L R,柯克兰 J J.现代液相色谱法导论 [M ] .北京:化学工业出版社 , 1980.
Separation purification and analysis of Chlorella
polysaccharides from Chlorella sp.
LIYa-qing1 , 　YANG Ha i-bo2 , 　LIU Yan2 , 　WANG X in-m an3
(1. S tate Key Laboratory of Fine chem ical, Dalian University ofTechnology, D alian 116012, Ch ina;　　　　
2. E nvironm ental and C hem ica lEngineering C ollege, Dalian Univers ity, Dalian 116622, Ch ina;　　　　
3. B ioch em ical Engineering Departm en t, C haoyang Teacher’ s Training S choo l, Chaoyang 122000, Ch ina)
Abstract:The uniform Chlorella po lysaccharide CPSB - 1w as prepared by the fo llow ings:co ld -w a te r ex trac-
tion of frozen - thaw , cleanou t pro teins, precipitation by ethanol and separate by co lumn chromatog raphy. It
w as found that the CPSB - 1 are monosaccharide s D - fucose, D - rhamnose, D - 2 - g lucosam ine, D - ga-
latctose, D - g lucose and some unknownmonosaccharide by hydrolyzing tho rough ly and e ffective ion anion flu-
id co lumn chromatographic analysis. Themo le ratio of five knownmonosaccha ride are 1.3∶1.0∶1.4∶1.2∶
3.1.
Key words:Ch lorella sp. ;Chlore lla polysaccharide;separation purification;componen t ana lysis
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