全 文 ：第 9 卷第 4 期
2 0 1 3 年 8 月
南 方 水 产 科 学
South China Fisheries Science
Vol. 9，No. 4
Aug.，2013
doi:10. 3969 / j. issn. 2095 － 0780. 2013. 04. 006
收稿日期:2012-12-09;修回日期:2013-01-27
资助项目:国家基础研究重大项目前期研究专项(2010CB134409) ; 国家科技支撑计划项目(2011BAD14B01) ; 海南大学植物学国家级重点
学科项目(071001)
作者简介:杨 勋(1988 －) ，男，硕士研究生，从事微藻生物能源研究。E-mail:yangxunlovelove@ 163. com
通信作者:刘平怀(1967 －) ，男，教授，从事微藻生物种质资源方面研究。E-mail:pinghuailiu@ yahoo. cn
营养元素和 pH对若夫小球藻生长和油脂积累的影响
杨 勋，郝宗娣，张 森，刘平怀
( 海南大学材料与化工学院，海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南 海口570228)
摘要: 以若夫小球藻(Chlorella zofingiensis) 为研究对象，考察了不同的营养方式( 自养、混养、异养) ，不同的氮
源、磷(P) 质量浓度和pH对其生长和油脂积累的影响。结果表明，若夫小球藻在混合营养方式下藻体质量浓度
及油脂质量分数明显高于自养与异养方式，以蔗糖为碳源的混合营养方式下若夫小球藻总脂质量浓度最高(3. 14
g·L －1) ，分别是自养和异养的4. 6 和 5. 0 倍。以尿素为氮源时若夫小球藻总脂质量浓度最高(0. 79 g·L －1)。在一
定范围内增加 P质量浓度能提高若夫小球藻总脂质量浓度，其最适 P质量浓度为 7. 0 ～ 14. 0 mg·L －1。人为改变
培养液的 pH对若夫小球藻细胞生长影响较大，若夫小球藻能够在 pH 4. 5 ～ 9. 5 范围内生长，超出此范围时细胞
很快裂解死亡。
关键词:若夫小球藻; 营养方式; 氮源; 磷;pH 总脂
中图分类号:S 917. 1 文献标志码:A 文章编号:2095 － 0780 －(2013)04 － 0033 － 06
Effects of trophic elements and pH on growth rate and lipid
productivity of Chlorella zofingiensis cells
YANG Xun，HAO Zongdi，ZHANG Sen，LIU Pinghuai
(College of Materials and Chemical Engineering，Hainan University，Ministry of Education;Key Lab. of Protection and
Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Ｒesources，Hainan University，Haikou 570228，China)
Abstract:We investigated the biomass productivity and lipid content in Chlorella zofingiensis under different trophic modes (auto-
trophic，mixotrophic and heterotrophic) ，with different nitrogen，concentration of phosphorus and pH. The results indicate that the
biomass productivity and lipid content of C. zofingiensis under mixotrophic cultivation are higher than that of under autotrophic and het-
erotrophic cultivation. The lipid productivity of C. zofingiensis is 3. 14 g·L －1 under mixotrophic cultivation with sucrose，which is 4. 6
and 5. 0 folds of those obtained under autophototrophic and heterotrophic conditions. The maximum lipid productivity is 0. 79 g·L －1with
CON2H4 as nitrogen source. The lipid productivity of C. zofingiensis increases with K2HPO4 concentration at 0 ～ 80 mg·L and optimum
concentration of phosphorus is 7. 0 ～ 14. 0 mg·L －1 . In addition，different pH values have great influence on the growth of
C. zofingiensis cells，which live in pH from 4. 5 to 9. 5，while die soon when pH exceeds this range.
Key words:Chlorella zofingiensis;trophic modes;nitrogen sources;concentration of phosphorus;pH;lipid productivity
微藻是水生生态系统中以光能自养产能的初级
生产者，在特定条件下微藻细胞能够积累大量的三
酰甘油，含量可达细胞干质量的 50%以上［1］，利
用微藻生产油脂已经成为目前研究的热点，微藻油
脂可以用作保健食品或制备生物柴油［2］。微藻细
胞能够利用二氧化碳(CO2) 进行光合自养生长，在
34 南 方 水 产 科 学 第 9 卷
培养液碳源充足的条件下，部分微藻可以在有光照
情况下利用有机和无机碳源进行混合营养生长或是
在无光照条件下异养生长［3 － 4］，混养和异养已经成
为一种快速、大量培养微藻的有效方法［5］。氮
(N)、磷(P) 是微藻生长所需要的重要元素，N 的
缺乏会导致藻细胞生长受到抑制，但有利于脂类物
质的积累［6 － 7］;P对微藻油脂积累的影响则因藻种
不同而有别，一些微藻在缺 P 状况下油脂积累增
加，而部分微藻缺 P 反而导致油脂质量分数降
低［8 － 9］。
小球藻是单细胞藻类，常见的有普通小球藻
(Chlorella vulgaris)、蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)、
若夫小球藻(C. zofingiensis) 等。若夫小球藻被认为
是优良的虾青素和油脂生产株［10 － 11］。目前关于若
夫小球藻生产油脂的研究主要为光合自养和异
养［12 － 13］，以及 N、P 浓度对其生长和油脂积累的
影响［14］，较少见到营养方式、不同氮源和 pH 对
其生长和油脂积累的影响报道。笔者以若夫小球藻
为研究对象，考察了 3 种营养方式、不同氮源、P
质量浓度和 pH对其生长和油脂积累的影响，以期
提高若夫小球藻藻体质量浓度和油脂质量浓度，为
其工业化应用提供研究基础。
1 材料与方法
1. 1 材料与设备
若夫小球藻由海南大学生物工程实验室分离保
存。试验前反复平板划线纯化直到显微镜检不再有
杂菌。
光照发酵罐( 瑞士INFOＲS) ; 光照摇床( 瑞士
MINITＲON) ; 紫外可见分光光度计( 中国普析通用
TU-1810) ; 甲醇、葡萄糖等试剂均为国产分析纯。
1. 2 培养基及培养条件
微藻的培养采用以下 2 种方式:1) 发酵罐培
养，培养基为 BG-11 液体培养基，按体积分数为
10%接种，生长条件设定为温度 26 ℃，搅拌速度
300 r·min －1，植物生长灯连续光照，光照强度为
10 000 lx，通入无菌空气，通气压力为 0. 16 Mpa;
2) 光照摇床培养，培养基为BG-11 液体培养基，
以 10%的体积分数接种于 2 000 mL 三角瓶中，三
角瓶中装 1 000 mL 培养液，置于光照摇床里，生
长条件设定温度 26 ℃，搅拌速度 100 r·min －1，连
续光照，光照强度为 4 000 lx。培养结束后离心收
集藻液，冻干后藻粉保存于 － 20 ℃冰箱。
1. 3 试验设计
1. 3. 1 营养方式对细胞生长和油脂积累的影响
在 3 种营养方式下培养若夫小球藻:1) 光合自
养(BG-11 基本培养基，光照) ;2) 混合营养(BG-
11 基本培养基，葡萄糖、蔗糖、甘氨酸和乙酸钠，
最终有效碳质量浓度均为 2 g·L －1，光照) ;3) 异
养(BG-11 基本培养基，质量浓度为 20 g·L －1的葡
萄糖和蔗糖，黑暗)。试验均采用摇床培养，设 2
组平行试验，自养和混合营养的培养周期为 12 d，
异养的培养周期为 9 d，培养过程中每天测定光密
度(OD680 nm) ，离心收集藻液，冻干后测定干质量
及总脂质量浓度。
1. 3. 2 不同氮源对细胞生长和油脂积累的影响
以不含氮源的 BG-11 培养基为基本培养基，在
培养基中分别加入硝酸钠、氯化铵、尿素，最终有
效氮质量浓度均为 165 mg·L －1，以不含氮源的 BG-
11 培养基为对照，研究不同氮源对若夫小球藻细
胞生长和油脂积累的影响，培养周期为 10 d，培养
过程中每天测定 OD680 nm，离心收集第 10 天的藻
液，冻干后测定干质量及总脂质量浓度。
1. 3. 3 P 质量浓度对细胞生长和油脂积累的影响
以 BG-11 培养基为基本培养基，设定 P 质量
浓度为 0、3. 5 mg·L －1、7. 0 mg·L －1和 14. 0 mg·
L －1，研究 P质量浓度对若夫小球藻细胞生长和油
脂积累的影响，培养周期为 10 d，培养过程中每天
测定 OD680 nm，离心收集第 10 天的藻液，冻干后测
定干质量及总脂质量浓度。
1. 3. 4 pH对细胞生长和油脂积累的影响 采用
发酵罐培养，在 pH 为 7 条件下培养 4 d，然后逐
渐改变 pH，pH 每 2 d 降低或升高 0. 5，直到若夫
小球藻细胞裂解死亡，得到其对 pH 的最大耐受限
度，培养过程中每 2 d 测定 OD680 nm; 再次采用发
酵罐培养若夫小球藻，依上述方法调节 pH，在若
夫小球藻细胞裂解死亡之前停止培养，收集藻细胞
测定藻体质量浓度及油脂质量分数。以未控制 pH
的培养为对照，考察极端 pH 对若夫小球藻细胞生
长和油脂积累的影响。
1. 4 分析方法
参照 LUYEN［4］总脂测定方法并稍加改进，称
取藻粉 0. 1 g，加入氯仿-甲醇-水( 体积比为1∶2∶
1) 混合液20 mL，50 ℃超声提取 15 min，然后加
入氯仿-水( 体积比为1∶1) 混合液10 mL，50 ℃超
声提取 15 min，取氯仿层于旋转蒸发器上蒸干，得
第 4 期 杨 勋等: 营养元素和pH对若夫小球藻生长和油脂积累的影响 35
到微藻油在 50 ℃下干燥至恒质量，计算出油率，
设置 3 个平行试验，取平均值。按照下面公式计算
油脂质量分数和总脂质量浓度:
油脂质量分数 =(m1 /0. 1g)× 100%，式中 m1
表示 0. 1 g藻粉提取所得到的油脂质量(g) ;
总脂质量浓度(g·L －1)=微藻藻体质量浓度 ×
油脂质量分数，式中微藻藻体质量浓度(g·L －1) 为
单位体积培养液所收获的微藻质量。
2 结果与分析
2. 1 营养方式对细胞生长和油脂积累的影响
若夫小球藻在不同营养方式下的生长曲线见图
1。混合营养方式下若夫小球藻生长状况明显好于
自养和异养方式，生长速率由高至低依次为乙酸
钠、蔗糖、葡萄糖和甘氨酸，培养初期甘氨酸生长
速率较快，但很快进入稳定期。异养状况下若夫小
球藻生长周期较短，6 d 即出现明显的衰退。若夫
小球藻在不同营养方式下的最终藻体质量浓度、油
脂质量分数和总脂质量浓度见表 1。与生长曲线类
似，混养方式下若夫小球藻藻体质量浓度和油脂质
量分数要高于自养和异养方式。若夫小球藻在以蔗
糖为碳源的混合营养方式下藻体的质量浓度最高
(7. 2 g·L －1) ，分别为自养和异养的3. 1 和 4. 5 倍，
若夫小球藻在以葡萄糖为碳源的混合营养方式下油
脂质量分数最高(44. 4%) ，分别为自养和异养的
1. 5 和 1. 3 倍。若夫小球藻在以蔗糖为碳源的混合
营养方式下总脂质量浓度最高(3. 14 g·L －1) ，分别
是自养和异养的 4. 6 和 5. 0 倍。若夫小球藻在以蔗
糖为碳源的混养方式下总脂质量浓度略高于葡萄
糖，但异养方式下以葡萄糖为碳源明显高于蔗糖。
图 1 营养方式对若夫小球藻生长的影响
Fig. 1 Effects of different trophic modes on the
growth of C. zofingiensis
若夫小球藻最适合的培养方式为添加少量的蔗糖或
葡萄糖的混合营养模式。
2. 2 不同氮源对细胞生长和油脂积累的影响
若夫小球藻在不同氮源下的生长曲线见图 2。
在以硝酸钠和尿素为氮源的情况下，若夫小球藻的
生长速率明显高于氯化铵和缺氮( 空白) 状况。在
培养的前 3 d若夫小球藻的生长速率基本相同，之
后硝酸钠和尿素组进入对数生长期，培养第 7 天生
长速率减缓进入稳定期，氯化铵组则以较低速率生
表 1 不同营养方式下若夫小球藻细胞藻体质量浓度、油脂质量分数和总脂质量浓度
Tab. 1 Biomass productivities，lipid contents and lipid productivities of C. zofingiensis cells in different trophic modes
碳源
carbon sources
ρ( 藻体)/g·L －1
biomass productivity
w( 油脂)/%
lipid content
ρ( 总脂)/g·L －1
lipid productivity
葡萄糖 glucose 6. 1 44. 4 2. 71
蔗糖 sucrose 7. 2 43. 6 3. 14
甘氨酸 glycine 2. 6 39. 0 1. 01
乙酸钠 sodium acetate 6. 8 31. 4 2. 14
自养 autotrophic 2. 3 29. 9 0. 69
异养( 葡萄糖)heterotrophic(glucose) 3. 6 34. 4 1. 24
异养( 蔗糖)heterotrophic(sucrose) 1. 6 39. 2 0. 63
36 南 方 水 产 科 学 第 9 卷
图 2 不同氮源对若夫小球藻生长的影响
Fig. 2 Effects of different nitrogen sources on the
growth of C. zofingiensis
长，缺氮组在培养第 4 天即出现明显衰退后进入稳
定期。若夫小球藻在不同氮源下的最终藻体质量浓
度、油脂质量分数和总脂质量浓度见表 2。若夫小
球藻最终藻体质量浓度与生长速率基本一致，硝酸
钠组和尿素组相同且明显高于氯化铵和缺氮组，以
尿素为氮源若夫小球藻藻体质量浓度最高，是缺氮
情况下的 2 倍。硝酸钠组和尿素组油脂质量分数相
同且高于氯化铵组，但低于缺氮组。若夫小球藻最
终总脂质量浓度由高到低依次为尿素、硝酸钠、缺
氮、氯化铵，以尿素为氮源若夫小球藻最终总脂质
量浓度为 0. 79 g·L －1，是缺氮情况下的 1. 8 倍。若
夫小球藻最适生长氮源为尿素。
2. 3 P质量浓度对细胞生长和油脂积累的影响
若夫小球藻在不同 P 质量浓度下生长和油脂
积累情况见图 3 和表 3。若夫小球藻生长速率随着
P质量浓度升高而增快，在质量浓度为 0 ～ 7. 0 mg
·L －1时生长较快，2 d 后进入指数生长期，7 d 后
生长减缓; 当P质量浓度为 14. 0 mg·L －1时若夫小
球藻生长受到抑制，生长速率较慢，但在整个培养
周期其一直处于增长状态。最终藻体质量浓度结果
显示，P质量浓度越高若夫小球藻藻体质量浓度越
高，质量浓度为 14. 0 mg·L －1时若夫小球藻油脂质
量分数最高(40. 6%)。若夫小球藻最终总脂质量
浓度随 P 质量浓度升高而增加，但过高质量浓度
的 P 会对其前期生长有一定的抑制，且对总脂积
累没有明显的促进作用，因此若夫小球藻培养过程
中 P质量浓度应当为 7. 0 ～ 14. 0 mg·L －1。
2. 4 pH对细胞生长和油脂积累的影响
以逐渐改变培养液 pH的方式考察若夫小球藻
对酸和碱的耐受性，结果见图 4 和表 4。在不控制
pH状况下若夫小球藻在培养的前 12 d 均能维持较
高的生长速率，改变培养液 pH 对若夫小球藻生长
影响较大，偏酸或偏碱的环境对若夫小球藻生长有
较强的抑制作用; 若夫小球藻对酸性环境耐受性较
碱性环境强，在 pH为 4. 5 时能够维持较长时间的
正常生长，而在 pH 为 10 时细胞生长衰退较快;
pH为 4 和 10 时若夫小球藻细胞很快变黄并死亡;
pH为 9. 5 和 4. 5 时若夫小球藻藻体质量浓度分别
为 0. 9 g·L －1和 1. 2 g·L －1，是正常状况下的 12%和
16%; 油脂质量分数略低于正常状况; 最终总脂质
量浓度仅为正常状况下的 11%和 15%。
3 讨论
试验结果表明，不同营养方式对若夫小球藻生
长和油脂积累有影响，混合营养是高密度培养若夫
小球藻生产油脂的最佳方式。混合营养最佳碳源为
蔗糖和葡萄糖，在添加少量蔗糖或葡萄糖的混养模
式下若夫小球藻藻体质量浓度和油脂质量分数均明
显高于自养和异养。这与现有几种微藻的研究报道
相一致。陈涛等［15］采用异养方式培养若夫小球藻
生产虾青素，发现其异养最佳碳源为蔗糖和葡萄糖;
表 2 不同氮源下若夫小球藻细胞藻体质量浓度、油脂质量分数和总脂质量浓度
Tab. 2 Biomass productivities，lipid contents and lipid productivities of C. zofingiensis cells in different nitrogen sources
氮源
nitrogen source
ρ( 藻体)/g·L －1
biomass productivity
w( 油脂)/%
lipid content
ρ( 总脂)/g·L －1
lipid productivity
硝酸钠 NaNO3 2. 0 34. 6 0. 69
氯化铵 NH4Cl 1. 0 27. 6 0. 28
尿素 CO(NH2)2 2. 2 35. 9 0. 79
空白 blank control 1. 1 39. 1 0. 43
第 4 期 杨 勋等: 营养元素和pH对若夫小球藻生长和油脂积累的影响 37
表 3 不同磷质量浓度下若夫小球藻细胞藻体质量浓度、油脂质量分数和总脂质量浓度
Tab. 3 Biomass productivities，lipid contents and lipid productivities of C. zofingiensis
cells in different concentration of phosphorus
ρ(P)/mg·L －1 ρ
( 藻体)/g·L －1
biomass productivity
w( 油脂)/%
lipid content
ρ( 总脂)/g·L －1
lipid productivity
0 1. 4 33. 9 0. 47
3. 5 1. 8 37. 7 0. 69
7. 0 2. 2 35. 6 0. 78
14. 0 2. 4 40. 6 0. 97
表 4 不同 pH下若夫小球藻细胞藻体质量浓度、油脂质量分数和总脂质量浓度
Tab. 4 Biomass productivities，lipid contents and lipid productivities of C. zofingiensis cells in different pH
pH ρ( 藻体)/g·L
－1
biomass productivity
w( 油脂)/%
lipid content
ρ( 总脂)/g·L －1
lipid productivity
10. 0 细胞死亡 细胞死亡 细胞死亡
9. 5 0. 9 37. 3 0. 34
4. 5 1. 2 39. 1 0. 47
4. 0 细胞死亡 细胞死亡 细胞死亡
对照(7. 0 ～ 8. 5)blank control 7. 6 42. 5 3. 23
曹云涛等［3］关于不同营养方式对普通小球藻生长
特性和细胞组成结果亦显示小球藻最佳培养方式为
添加葡萄糖的混合营养方式; 杨静等［16］研究了 6
种微藻在不同培养方式下生长及产油情况，发现混
合 营 养 方 式 下，小 球 藻、栅 藻 (Scenedesmus
obliquus)、等鞭金藻(Isochrysis galbana)、三角褐
指藻(Phaeodactylum tricornutum) 藻体质量浓度和油
脂质量分数均高于自养和异养。目前若夫小球藻主
要培养方式为开放式自养或封闭式异养，自养虽然
培养成本较低，但由于细胞密度较小，采收成本较
高; 异养对于无菌操作及设备要求较高，且大量消
耗碳源; 混合营养方式下若夫小球藻藻体质量浓度
和油脂质量分数相对较高，为高密度、大规模培养
若夫小球藻提供了一种理想模式，具有潜在的工业
应用价值。
笔者研究结果表明，不同氮源对若夫小球藻生
长和油脂积累有一定的影响，若夫小球藻以尿素为
氮源时生长速度最快，缺 N 时生长较慢，但油脂
质量分数最高。通常情况下微藻可利用氮源有铵态
氮、硝态氮和有机氮，在吸收速度和利用程度上有
38 南 方 水 产 科 学 第 9 卷
一定差异。研究表明，部分微藻会优先利用铵态氮
源，但铵态氮的吸收会很快改变培养液 pH 而对微
藻生长产生抑制［17］。王顺昌等［18］研究了氨态氮、
尿素氮和硝酸态氮对蛋白核小球藻生长、色素和中
性脂肪积累的影响，发现尿素氮有利于蛋白核小球
藻生长，硝酸态有利于蛋白核小球藻油脂积累。P
参与碳水化合物的代谢和脂肪酸的转化，P 是水生
生态系统中初级生产力水平的关键制约因素，微藻
可以直接利用无机磷元素，无机磷缺乏时藻类也可
以利用有机磷来维持代谢活动［19］。笔者的 P 质量
浓度试验表明，若夫小球藻最适条件为添加 7. 0 ～
14. 0 mg·L －1的 P，过低及过高 P 质量浓度均会对
若夫小球藻生长产生抑制。
pH对微藻细胞生长和油脂积累的影响主要在
于改变细胞膜电荷和营养物的离子化程度，进而
改变细胞内酶的活性和细胞对营养离子的吸收，
例如光合作用中 CO2 的吸收，呼吸作用中对有机
碳源的利用效率，细胞代谢产物的再次利用及其
毒性。眼点拟微绿球藻(Nannocholoropsis oculata)
在 pH 6. 2 ～ 9. 8 下均能较好生长，但在 pH 5. 5 条
件下生长受到较强抑制［20］; 邓光等［21］研究发现，
锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea) 和塔玛亚历山
大藻(Alexandrium tamarense)pH 适应范围较小，
最适 pH为 7. 5 ～ 8. 0，当 pH 为 10 时细胞全部裂
解死亡。笔者的 pH试验结果显示，改变 pH对若
夫小球藻生长有极大的影响，对油脂质量分数影
响较小; 若夫小球藻对pH最大耐受限度为 4. 5 ～
9. 5，当 pH低于 4. 5 或高于 9. 5 若夫小球藻细胞
会很快死亡。
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