全 文 ：动　物　学　研　究　2000 , Aug.21 (4):257～ 261 CN 53-1040/Q　ISSN 0254-5853
Zoological Research

含小球藻和无小球藻绿草履虫的基因组 DNA多态性的研究
孙　军　　顾福康
(华东师范大学生物系 上海　200062)
摘要:以 “绿草履虫-小球藻” 共生系统为材料 , 选用 20 种随机引物对光培养下含小球藻共生体的草履
虫和暗培养诱导除去小球藻共生体的草履虫基因组 DNA 进行遗传多态分析 , 由扩增产物电泳图谱显示 , 用
S401 、 S147、 S786 、 S759 、 S86 、 S155、 S140 等随机引物扩增出 866 、 1 393 、 1 637 bp 等具有相同特征的电泳条
带;随机引物 S174 、 S750 、 S769、 S755 、 S103 等则扩增出 1 385 、 1 852、 1 579 bp 等无共生藻草履虫的特有条
带。据此推测 , 绿草履虫中的共生小球藻会导致宿主草履虫基因组结构的改变。同时显示小球藻共生体的基因
组可能与宿主基因组有某些相似之处。
关键词:绿草履虫;小球藻共生体;基因组 DNA
中图分类号:Q959.117 　文献标识码:A 　文章编号:0254-5853(2000)04-0257-05
　　近年来对变形虫 、鞭毛虫 、纤毛虫等原生动物与
病毒 、细菌 、真菌甚至藻类细胞组成的共生体系的研
究主要集中在共生体系初建时的双方相互识别 、内
共生体的进入方式 、双方生理上的相互适应以及两
者协同进化等方面 ,但对双方合作的物质基础和生
理上的相互关系还知之甚少(Soldo 等 ,1992)。绿草
履虫-小球藻(Paramecium bursaria-Chlorella sp.)共
生体系是共生关系研究的理想材料 。研究已表明在
该共生体系中 ,小球藻可通过其表面特有结构避免
宿主溶酶体酶的消化 ,而能专一性地与绿草履虫建
立共生关系(Reisser 等 , 1982;Stephen 等 , 1981);随
着共生关系的建立 ,绿草履虫细胞体会增大并产生
趋光性运动方式(Reisser 等 ,1984),此时如去除绿草
履虫中的小球藻 ,绿草履虫的配对节律会改变 ,生活
力会下降(Tanaka 等 , 1996)。共生体系中的小球藻
也不同于自由生活的小球藻 ,会发生如 1 , 5-二磷
酸核酮糖羧化酶活性明显增加 ,碳酸酐酶活力下降
等变化(Reisser 等 ,1981)。在其他共生体系中也存
在共生双方相互影响的现象 , 如尖形草履虫
(Paramecium acutum)中的共生体组成中含有 30%
的宿主蛋白(Lorch 等 , 1982);在变形虫中细菌共生
体能改变宿主的基因表达(Choi 等 , 1997;顾福康等 ,
1999)。共生体的介入以何种方式影响宿主尚不清
楚 。有人推测宿主与共生体双方长期合作可能会使
基因组结构发生相应改变(Ossipov 等 , 1997;Siles
等 ,1993)。为了探索原生动物及其真核细胞共生体
中基因组结构与共生作用的可能关系 ,我们选择了
绿草履虫-小球藻共生体系为材料 ,利用随机扩增
多态(RAPD)方法分析了该共生体系中宿主及共生
体的基因组多态性。
1　材料和方法
1.1　绿草履虫和小球藻样品处理
所用实验材料为 1990 年 6 月采自上海动物园
小湖内 , 经纯系培养获得的绿草履虫 。将绿草履虫
按下述方法处理 , 得到含有共生藻的和无共生藻的
绿草履虫及小球藻。
1.1.1　含共生藻的绿草履虫　将绿草履虫在 27 ～
30℃培养 , 保证足够的阳光照射 (室温低时 , 可在
恒温光照培养箱中培养)。此时绿草履虫中的小球
藻发育 、生长良好 , 可稳定保持绿草履虫和小球藻
两者的共生关系 。
1.1.2　无共生藻的绿草履虫　将含有共生藻的绿
草履虫经暗处理(Corliss , 1990;Rautian等 ,1993),
即在无光照的恒温培养箱中培养 。保持与 1.1.1相
同的营养条件 , 培养 3 ～ 4个月之后 , 经光镜镜检 ,
绿草履虫整个细胞失去绿色。透射电镜检查 , 绿草
履虫细胞质内仅残留小球藻退化痕迹或偶尔存有个
收稿日期:1999-12-13;修改稿收到日期:2000-02-25
　　　基金项目:国家自然科学基金资助项目 (39970088);高等学校博士学科点专项科研基金资助项目
别小球藻。
1.1.3　小球藻　光照培养条件下 , 常见绿草履虫
释放出内共生小球藻或是细胞自身裂解释放小球藻
于周围环境中。这些小球藻因趋光运动而附着在容
器壁上 。此时可直接从培养瓶壁上收集小球藻 。
1.2　DNA提取及浓度测定
采用改良盐析法提取 3种样品的DNA。基本步
骤:①1 000 r/min , 4 min 离心收集虫体。 ②溶液 Ⅰ
(含 0.02mol/L EDTA 、0.05mol/L Tris)悬液 ,加入蛋
白酶 K 和溶液 Ⅱ(含 0.02 mol/L EDTA 、0.05 mol/L
Tris 、2%SDS)与细胞裂解物混匀 ,55 ～ 60℃水浴消化
24 h 。③5mol/L NaCl沉淀去除溶液中残留蛋白质 ,
冰浴 20min ,离心 10 min ,而后用 2倍体积预冷的无
水乙醇沉淀 DNA 。④收集絮状沉淀 DNA(沉淀不明
显可离心收集), 70%乙醇洗涤后 ,用 TE液或 ddH 2O
溶解沉淀 。⑤4℃保存于冰箱备用。利用紫外分光
光度计测定OD 值 ,通过 OD260/OD280的比值判断
样品DNA纯度。本实验中 ,此比值都大于 1.80。
1.3　3种 DNA样品的 PCR扩增和产物电泳分析
参考以前的方法 (王义权等 , 1996), 选用引
物 、扩增及分析方法如下 。
1.3.1　引物　选用 20条 10 bp 随机引物 (表 1)。
产品均购自上海 Sangon公司。
1.3.2　PCR反应及电泳　使用PTC-200 DNA En-
表 1　实验中所使用的随机引物及其序列
Table 1　Random primers and sequences used in the
experiment
随机引物(random primer) 序　列(sequence)
S103 5 AGACGTCCAC 3
S147 5 AGATGCAGCC 3
S401 5 GTTGGTGGCT 3
S155 5 ACGCACAACC 3
S140 5 GGTCTAGAGG 3
S376 5 GAGCGTCGAA 3
S159 5 ACGGCGTATG 3
S380 5 GTGTCGCGAG 3
S151 5 GAGTCTCAGG 3
S086 5 GTGCCTAACC 3
S174 5 TGACGGCGGT 3
S729 5 CCCGTCAGCA 3
S750 5 CGGGCAACGT 3
S755 5 AACCGACGGG 3
S759 5 TGCCCTGCCT 3
S763 5 GTCTGACGGT 3
S769 5 CGCGGACGAT 3
S771 5 AGCACTTCGG 3
S786 5 AGCCACCATG 3
S788 5 TGGATTAGGC 3
gine进行 PCR扩增。反应总体积为 50μL。包括
Tris-HCl 10 mmol/L , KCl 50 mmol/L , MgCl2 1.5
mmol/L ,4种 dNTP 共 200μmol/L ,随机引物 15 ng ,
基因组 DNA 5 ～ 30 ng ,Taq DNA 聚合酶 1.5单位。
混匀。加盖石蜡油 。PCR 反应过程:预变性 93℃4
min ,94℃变性 1 min , 36℃退火 1 min , 72℃延伸 1
min 。共循环 42 次。当完成最后 1 次循环时 , 在
72℃延伸 5 min。扩增产物在含有 0.05%溴化乙锭
的 1%琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为 1×TAE ,
150V电泳 30 ～ 50min 。
1.3.3　采用 FR-980生物电泳图像分析系统(上海
复日公司产品)。利用 SmartView 、PhotoShop 软件进
行图像的分析处理。随机扩增电泳条带大小由
SmartView 软件根据 Mark M 1(λDNA/Hind Ⅲ Marks)
标准条带比较而获得 。
1.3.4　根据 Nei和 Li公式:F =2NXY/(NX +NY)
计算共享度 。(F 为共享度 ,表示基因组之间的相似
程度;NXY表示两个物种共有片段数;NX 、NY 表示
X 、Y物种扩增片段总数)
2　结　果
本实验选取上述 20条引物共扩增出 135 条片
段 。除 S159没有扩增带以外 , 其余 19条引物均产
生明显扩增带 , 且有良好重复性。扩增片段大小在
200 ～ 2 000 bp之间 (图 1:Ⅰ , Ⅱ , Ⅲ)。
在含共生藻和无共生藻绿草履虫基因组随机扩
增出的 135条片段中 ,含共生藻的绿草履虫(B)共扩
增出 70条片段;经暗处理后无共生藻的绿草履虫
(A)共扩增出 65条片段。两者共有片段为 51 条。
根据 Nei 和 Li 公式计算出两样品的共享度为
0.756。较大共享度说明两者在基因组结构上有较
大相似性 。从图 1 Ⅰ可清楚看到 ,随机引物 S401 、
S147 、S786 、S759 、S086 、S155 、S140 的扩增产物电泳
图中 ,两个样品均有相同的条带 ,如随机引物 S147
扩增出的 1 393 bp 、866 bp 、413 bp 、341 bp 等片段 ,引
物 S759 的 1 637 bp 、1 238 bp 、751 bp 等片段 ,引物
S086的 653 bp 、542 bp 、373 bp等片段 ,引物 S155的
1 492 bp 、599 bp 、488 bp 、403 bp 等片段 ,引物S140的
426 bp 片段。这证明来自同一个克隆的这两个样品
的基因组结构在很大程度上是一致的 。但从图 1 Ⅱ
中 ,可以看到两者还存有显著差异 。如在引物 S103
扩增的产物中 ,暗培养样品多出 1条 875 bp 的条带;
在引物S 174的产物中 ,多1 385 bp 、437 bp 2条带;
258 　　　　　　　动　物　学　研　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　21卷
图 1　应用随机引物对含有共生藻和不含有共生藻绿草履虫及小球藻基因组扩增产物电泳图
Fig.1　The gel electrophoresis patterns of polymorphic fragments of chlorellae-bearing P.bursaria , chlorellae-free
P.bursaria and chlorellae after amplification with random primers
Ⅰ.应用 7个随机引物对含共生藻和无共生藻绿草履虫基因组扩增产物电泳图(the gel electrophoresis patterns of polymorphic fragments of
chlorel lae-bearing P.bursaria and chlorellae-f ree P.bursaria after random amplifi cation with seven random primers S 401 , S147 , S786 , S759 ,
S086 ,S155 , S140);Ⅱ.应用 5个随机引物对含有和不含有共生藻绿草履虫及小球藻基因组随机扩增产物电泳图(the gel elect rophoresi s
patterns of polymorphic fragments of chlorel lae-bearing P.bursaria , chlorellae-f ree P.bursaria and chlorel lae after amplificationw ith S174 , S750 ,
S769 ,S755 , S103);Ⅲ.应用 4个随机引物对含有和不含有共生藻绿草履虫及小球藻基因组随机扩增产物电泳图(the gel elect rophoresi s
patterns of polymorphic fragments of chlorellae-bearing P.bursaria , chlorel lae-free P.bursaria and ch lorellae after random amplifi cation with
S 155 ,S401 , S140 ,S729);A 为不带有共生藻绿草履虫样品(chlorellae-f ree P.bursaria);B为带有共生藻绿草履虫样品(chlorellae-bearing
P.bursaria);C为小球藻样品(chlorellae)。
2594期　　　　　　　　　　　　孙　军等:含小球藻和无小球藻绿草履虫的基因组 DNA 多态性的研究
同理 ,可看出在随机引物S750 、S769 、S 755扩增产物
电泳中分别多出 1 852 bp 、1 579 bp 、469 bp 等条带 ,
表明两者也存在明显差异 。
3　讨　论
内共生体是否会引起宿主基因的改变 ,目前一
直没有直接的证据。但有一些间接的实验结果让人
不得不从基因组的改变上寻找原因(Choi 等 ,
1997)。如X-细菌与变形虫建立起共生关系以后 ,
会不可逆地改变宿主结构 ,使得宿主与内共生菌生
死相依。有的共生体系可产生特有的产物 ,如鞭毛
虫(Pelaina cyanea)和蓝细菌(Cyanella)共生体系中
所产生的淀粉 ,变形虫-X细菌共生体系中产生的
分子量高于 200 kDa 的蛋白质等(Soldo 等 , 1992),
都是共生体系中任何一方在共生关系建立前不可能
独立产生的物质 。这些特有的产物是如何产生和如
何影响共生体系的运作目前尚不知哓 。国外不少研
究人员已提出内共生体可能影响宿主的基因组结构
的设想 。我们从绿草履虫样品随机扩增片段的多态
性上揭示了这种改变的存在:以“绿草履虫-小球
藻”共生系统为材料 ,选用 20种随机引物对光培养
下含小球藻共生体的草履虫和暗培养诱导除去小球
藻共生体的草履虫基因组 DNA进行遗传多态分析 ,
从扩增产物电泳图谱显示出 ,用 S401 、S147 、S786 、
S759 、S 86 、S 155 、S140 等随机引物扩增出866 、
1 393 、1 637 bp 等具有相同特征的电泳条带;随机引
物S174 、S750 、S769 、S755 、S103等则扩增出1385 、
1 852 、1 579 bp 等无共生藻草履虫的特有条带 。由
所得结果推测 ,绿草履虫中的小球藻共生体会导致
宿主草履虫基因组结构的改变 。
当前 ,国际上越来越多的人们也开始注意环境
对于生物体基因的影响。至于这种影响如何实现目
前仍无直接的证据 ,但这种由环境引起生物体基因
改变的现象已被在不同领域研究不同对象的人们所
发现(Whitehead ,1998)。小球藻共生体对绿草履虫
细胞内环境的影响而导致宿主基因组改变的机理仍
需进一步探讨。
根据图 1Ⅲ可知 ,在随机引物 S155 、S401 、S140 、
S729的扩增产物电泳图谱中 ,绿草履虫的 2个样品
B 、A 与小球藻C 有 6条共有条带 ,即引物S155有共
有条带 403 bp ,引物S401 、S140 、S729分别有共有条
带 277 、413 、426 、550和 669 bp。对于绿草履虫与小
球藻两者基因扩增产物会产生共有条带现象是否为
一种偶然? 作者认为 ,如果绿草履虫本身含有小球
藻 ,样品A 虽然经过暗培养除去了小球藻 ,但不一
定去除完全 ,有可能会被 PCR扩增出残存的小球藻
DNA。如果这种可能性存在 ,那么所有的样品或至
少大部分样品扩增电泳带中都应有小球藻带“背
影” 。但事实上这种情况并未发生 。而且以上 6条
共有带中 ,C 带均为弱带(排除 PCR 扩增时小球藻
DNA量不足的可能性)。相比之下 ,小球藻作为干
扰而存在的A 、B 两样品反而有较强的带(即扩增的
DNA片段分子数量多)。很难想象在A 、B 两样品中
作为干扰而存在的小球藻 DNA 会扩增出更多的
DNA片段 ,至少 A 、B 、C 会有大体相当的扩增产物。
从这个角度也可证明 ,在 DNA 电泳分析中 ,小球藻
基因干扰的可能性不大。因此 B 、A 、C 3个样品很
可能有同源顺序或有相似的基因组结构 。
有研究表明 ,共生体对宿主的选择不是随机的 ,
而是存在种属特异性。以纤毛虫-细菌共生体系统
为例 ,如小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)中的共生
菌 Polynucleobacter necessarius;双小核草履虫(Para-
mecium aurelia)中的共生菌 Holospora bacillata;绿草
履虫中的共生菌 Pseudocaedibacter chlorellopellens;
尾草履虫(P.caudatum)中的共生菌 Cytobacter cary-
ophila 等 。这种共生关系的选择不是随机的 ,而似
乎有一种内在的必然联系 ,以保证双方彼此特异的
选择。有的宿主可能会允许几种内共生体存在 ,但
这些内共生体的生活力会不尽相同。同样 ,在有限
的宿主范围内 ,在不同宿主中同一种内共生体的生
活力会有变化。如以藻类内共生体为例 , Chlorella
vulearis 259在 P.bursaria Stock 42W 中没有观察到
有共生现象 , 但在另一个品系 P.bursaria Stock
478A-W 中 ,平均每个细胞含有 54个藻类细胞 ,数
目变化范围在 1 ～ 359个之间(Karakashian ,1963)。
尽管在许多纤毛虫中已经观察到大量的细菌共
生体或藻类共生体 , 但对纤毛虫-共生体两者基因
组间的联系目前尚未见报道 。本文的结果显示绿草
履虫-小球藻共生体系中两者存在同源顺序或相似
的基因组结构 。在此 , 作者尚不排除小球藻在共生
作用中与宿主基因组 DNA 交流而获得同源顺序的
可能性 , 但如果所述的同源顺序是绿草履虫和小球
藻共生体双方都固有的话 , 那么搞清楚两者的同源
顺序的结构和功能 , 则对揭示宿主-共生体两者在
共生作用中相互选择的分子基础也是有意义的。
260 　　　　　　　动　物　学　研　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　21卷
参　考　文　献
王义权 , 周开亚, 秦树臻 , 1996.RAPD 标记检测六种蛇基因组 DNA
多态性[ J] .动物学报 , 42(2):172～ 181.[Wang Y Q , Zhou K Y ,
Qin S Z , 1996.Genomic DNA polymorphisms in six species of ser-
pents using randomly amplified polymorphic DNA(RAPD)markers.
Acta Zool.Sin., 42(2):172-181.]
顾福康 ,隋淑光 ,杨振云 , 1999.肉足鞭毛类原生动物中宿主共生体系
统的研究[ J] .生物多样性 , 7(4):303 ～ 307.[ Gu F K , Sui S G ,
Yang Z Y , 1999.Studies on the host-symbiotic systems in sarcodines
and flagellates.Biodiversity , 7(4):303-307.]
Choi J Y , Lee T W , Jeon K W et al , 1997.Evidence for symbiont-induced
alterat ion of a host′s gene expression:irreversible loss of SAM syn-
thetase from Amoeba proteus[ J] .J .Euk.Microbiol., 44(5):412-
419.
Corliss J O , 1990.Endosymbionts of protozoa[ J] .Zool.Sci., 7(supl.):
167-177.
Karakashian S J , 1963.Growth of Paramecium bursaria as influen ced by
the presence of algal symbionts[ J] .Physiol.Zool., 36(1):52-68.
Lorch I J , Jem K W , 1982.Nuclear lethal effect and nucleocytoplasmic in-
compatibi lity induced by endosymbionts in Amoeba proteus [ J] .J .
Protozool., 29:468-470.
Ossipov D V , Karpov S A ,Smirnov A V et al , 1997.Peculiariti es of the
symbiotic systems of prot ists with diverse patterns of cellular organisa-
tion[ J] .Acta Protozoologica , 36(1):3-21.
Raut ian M S , Skoblo I L , Lebedeva N A , 1993.Genetics of symbiotic in-
teractions between Paramecium bursaria and the intranuclear bacteri-
um Holospora acuminata ,natural genetic variability by infectivity and
susceptibility[ J] .Acta Protozool., 32:165-173.
Reisser W , Benseler W , 1981.Comparat ive studies on photosynthetic en-
zymes of the symbiotic Chlorella from Paramecium bursaria and the
symbiotic and mom-symbiot ic Ch lorel la strains[ J] .Arch Microbiol.,
129:178-180.
Reisser W , Radunz A , Wiessner W , 1982.Participation of algal surface
structures in the cell recogition process during infection of aposym-
biotic Paramecium bursaria w ith symbiotic chlorellae[ J] .Cytobios.,
33:39-50.
Reisser W , Donat P , 1984.Role of endosymbiotic algae in photokinesis
and photophobic responses of ci li ates[ J] .Photochem .Photobiol.,
39:673-678.
Si les L M , Cuesta B C , 1993.Random amplified polymorphic DNA tech-
nique for speciation studies of Echinococcus gramulosus [ J] .Para-
sitol.Res., 79:343-345.
Soldo A T , Brickson S A , 1992.The molecular biology of a bacterial en-
dosybiont[ J] .J .Protozool.,39:196-198.
Stephen J , Maria A , 1981.Inhibition of lysosomal fusion with symbiont-
containing vacuoles in Paramcium bursaria[ J] .Expermental Cell Re-
search , 131:387-393.
Tanaka M ,Miwa I , 1996.Signifi cance of photosynthetic produ cts of sym-
biotic Chlorel la to establi sh the endosymbiosi s and to express the
mating reactivity rhythm in Paramecium bursaria [ J] .Zool.Sci.,
13:685-692.
Whitehead H , 1998.Cultural selection and genetic diversity in Matrilineal
Whales[ J] .Science , 282:1708-1711.
DIVERSITY OF GENOMIC DNA OF CHLORELLAE-BEARING AND
CHLORELLAE-FREE Paramecium bursaria
SUN Jun　　GU Fu-Kang
(Department of Biology , East China Normal University , Shanghai　200062 , China)
Abstract:“Paramecium bursaria-Chlorella sp.” sys-
tem , a kind of ideal symbiotic system , was selected to
research host-symbiont interaction.In order to discover
the difference of genomic DNA of host and symbiont ,
genetic variation of the chlorellae-bearing and chlorel-
lae-free Paramecium bursaria was detected by randomly
amplified polymorphic DNA (RAPD)markers.Genetic
variation from 12 polymorphic fragments amplified with
primers S174 、S750 、S769 、S755 、S103 in both strains of
Paramecium bursaria exited , though they shared the
same fragments amplified with primers S401 、S147 、
S786 、S759 、S086 、S763 、S155.It is implied that some
changes in genomic DNA of P .bursaria have occurred
owing to symbiotic functions.Also , it is shown that there
are the similarity between the amplified product of P .
bursaria and symbiotic chlorellae.
Key words:Paramecium bursaria;Symbiotic chlorellae ;Genomic DNA
2614期　　　　　　　　　　　　孙　军等:含小球藻和无小球藻绿草履虫的基因组 DNA 多态性的研究