全 文 ：大规模异养发酵培养小球藻USTB-01研究
景建克1 ,许倩倩1 ,刘　硕1 ,陈　灏2 ,闫　海1
(1.北京科技大学应用科学学院生物科学与技术系 ,北京 100083;
2.中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室 ,北京 100085)
摘要:采用异养小球藻 USTB-01 ,分别在 50 、500 L和 5 000 L发酵罐逐级放大进行异养发酵培养的优化控制研究。结果表
明 ,随着小球藻异养培养过程中生物量的增大 ,按照 3个不同阶段逐渐加大葡萄糖和硝酸钾(C/N质量比为 20∶1)分别作为碳源
和氮源的流加量 ,可以大幅度提高小球藻 USTB-01的生长速度。 72 h内 ,分别在 50 、500 L和 5 000 L发酵罐进行异养发酵培养
小球藻USTB-01过程中 , 都获得了质量浓度 40 g/L 以上的藻细胞干重 ,在培养物中保持低浓度的葡萄糖和硝酸钾在支持小球
藻快速生长方面发挥了重要作用。无论在培养规模 ,还是在最终培养获得的藻生物量上 ,均取得了非常重要的研究进展。
关键词:小球藻USTB-01;异养发酵培养;优化控制
中图分类号:Q914.82　 文献标识码:A　 文章编号:0253-4320(2008)12-0067-04
Heterotrophic mass culture of Chlorella USTB-01 in fermentor
JINGJian-ke1 , XU Qian-qian1 , LIU Shuo1 , CHEN Hao2 , YAN Hai1
(1.Department of Biological Science and Technology , School of Applied Science , Beijing University of Science and
Technology , Beijing 100083 , China;2.Research Center for Eco-environmental Sciences , Chinese Academy of Sciences ,
Beijing 100085 , China)
Abstract:The optimal control for the heterotrophic mass culture of Chlorella USTB-01 , is studied in 50 L, 500 L and 5 000 L
fermentors , respectively.The results show that the growth of Chlorella USTB-01 is greatly improved by continuous feeding the
mixture of glucose as a carbon source and nitrate as a nitrogen source (the mass ratio of carbon to nitrogen is 20)at three
different rates according to different microalgal growth phases.The maximum dry weight concentration (DWC) of microalgal
cells within 72 hours could reach as much as more than 40 g/L in 50 L , 500 L and 5 000 L fermentors , respectively.Keeping
low concentrations of glucose and nitrate in the cultured solution plays a very important role in supporting the rapid growth of
microalga.The advance in this way is achieved in both the culture scale and the great biomass of Chlorella USTB-01 obtained.
Such a high microalgal biomass obtained in such a short period as within 72 hours has not been previously reported in the world.
Key words:Chlorella-USTB-01;heterotrophic culture;optimal control
　收稿日期:2008-08-12;修回日期:2008-10-23
　基金项目:国家自然科学重点基金项目(20537020);北京市科委产业孵化资助项目(06KW1028)
　作者简介:景建克(1981-), 男 ,硕士生;闫海(1962-), 男 ,博士 , 教授 ,研究方向为藻类和微生物学 ,通讯联系人 , 010-62333177 , haiyan@sas.
ustb.edu.cn。
　　小球藻是单细胞绿藻 ,属于低等植物 ,是一种简
单的光合作用有机体 。小球藻富含蛋白质 、不饱和
脂肪酸 、类胡萝卜素 、叶黄素 、虾青素和多种维生素
等 ,对提高人体的免疫力和促进生物的生长都有良
好的效果[ 1] 。近年来 ,研究发现小球藻生长因子具
有诱发干扰素 、激发人体防御和免疫组织中的巨噬
细胞 、T 细胞和 B细胞的功能 ,又具有促进人体对环
境污染有害物质解毒和排泄的作用[ 2-3] ,因此小球
藻在食品 、医药 、化工和环保等领域的研究探索已经
越来越引起人们的普遍重视。
目前 ,小球藻生产主要采用类似于农业的大型
水泥池自养培养方式[ 4] ,然而存在藻生物量低 、培养
周期长和小球藻产品质量差等缺点[ 4-6] 。1953年 ,
Lewin[ 7]首先发现了一些藻类能利用有机物作为唯
一的碳源和能源进行异养生长 ,从而引起了单细胞
藻类培养的一次重要革命 。近年来对于小球藻的异
养培养研究越来越受到众多学者的重视 ,特别是通
过高细胞浓度异养发酵培养技术的研究与探索 ,大
幅度提高了小球藻的生长速度 ,使小球藻异养培养
的工业化生产成为可能。Shi 等[ 8]研究了异养发酵
培养小球藻的控制条件 ,获得了藻细胞干重质量浓
度31.2 g/L 的较高藻生物量。Liang 等[ 9] 应用流加
工艺在5 、50 、200 、800 L和 4 000 L机械搅拌发酵罐
中大规模异养培养小球藻 ,最高细胞干重质量浓度
达到了43.3 g/L。2004年笔者成功地从天然水体中
筛选到一株可以异养快速生长的小球藻种 USTB-
01 ,批量培养 5天获得 26 g/L 藻细胞干重[ 10] ,另外 ,
围绕小球藻高产叶黄素的培养控制及叶黄素的提取
·67·
第 28卷第 12期 现代化工 Dec.2008
2008年 12月 Modern Chemical Industry
DOI :10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2008.12.001
提纯等方面笔者也进行了探索[ 11-13] 。
为了使小球藻尽快更有效地实现工业化生产 ,
必须进一步提高其培养规模和效率 ,为此该研究分
别在 50 、500 L和 5 000 L发酵罐进行逐级放大异养
发酵培养实验 ,72 h内都获得了质量浓度 40 g/L 以
上的藻细胞干重 ,大幅度提高了培养规模和培养效
率 ,取得了具有明显创新性的研究结果 ,至今除笔者
外尚未见有在如此短时间内获得如此大量小球藻生
物量的研究报道 ,此研究成果为异养培养小球藻的
工业化生产奠定了坚实的基础 。
1　实验部分
1.1　实验材料
实验用小球藻USTB-01系笔者于 2004年从天
然水体中获得[ 11] ,具有极好的异养生长特性和培养
潜力 。采用食品级葡萄糖和分析纯硝酸钾分别作为
小球藻生长的碳源和氮源 ,其他所用试剂均为分析
纯 ,实验前没有经过进一步纯化。
1.2　培养条件
小球藻 USTB-01的工业化大规模培养实验在
北京某制药公司发酵厂进行。首先采用三角瓶 ,在
温度 30℃和摇床转速 200 r/min条件下异养批量培
养小球藻 USTB-01 ,培养 3 d后收获直接作为 50 L
全自控发酵罐的藻种。在逐级放大发酵培养过程
中 ,50 、500 L和 5 000 L发酵罐的实际培养体积分别
为20 、250 L 和 2 500 L ,前一级发酵培养获得的小球
藻发酵液直接作为藻种转入下一级进行进一步扩大
培养 。
在批量和发酵培养过程中所用培养基均由笔者
自主研制 ,初始 pH为 6.50左右 ,已经获得国家发明
专利。根据小球藻的不同生长期 ,采用碳氮质量比
为20∶1的 600 g/L 葡萄糖和硝酸钾混合溶液进行 3
个阶段不同流速的流加 , 0 ～ 12 h 流加葡萄糖量为
1.0 g/(L·h), 12 ～ 24 h 流加葡萄糖量为 1.5
g/(L·h),24 ～ 48 h流加葡萄糖量为 2.0 g/(L·h)。
实验所用培养基和容器均经过 121℃、20 min的
高温 、高压灭菌 , 发酵培养的控制条件是:温度为
30℃;50 、500 L和 5 000 L发酵罐的曝气量分别为 2 、
25 m3/(L·h)和 250 m3/(L·h);通过自动流加 10%盐
酸始终控制50 L 发酵罐培养pH为 7.0 ,初始搅拌转
速为 200 r/min ,每间隔 6 h 将转速提高 75 r/min ,直
至达到 500 r/min为止。500 L 和 5 000 L 发酵罐中
培养不控制pH ,搅拌转速始终分别控制在 260 r/min
和245 r/min。在发酵培养过程中 ,分不同时间间隔
进行取样分析 ,分别测定反映藻生物量的光密度
(OD680 nm)、还原糖浓度和 pH 。
1.3　分析测定方法
采用分光光度计 ,在波长 680 nm下以去离子水
作为参比 ,分别测定稀释不同倍数小球藻发酵液的
光密度 ,以此代表小球藻的生物量 。采用 pH 计直
接测定小球藻发酵液的 pH 。小球藻发酵液中的葡
萄糖浓度和硝酸根浓度分别采用碘量法[ 14]和离子
色谱法测定。
2　结果与分析
2.1　50 L发酵罐培养结果
图1是在 50 L发酵罐中 ,采用流加葡萄糖和硝
酸钾方式或将葡萄糖和硝酸钾全部加入到初始培养
基中 2种不同条件下 ,小球藻的生长 、发酵液中葡萄
糖浓度和硝酸钾浓度的变化过程。
(a)
(b)
(c)
1—流加;2—不流加
图 1　50 L 发酵罐流加和不流加2种条件下
培养结果
图1(a)显示 ,与初始将培养基所有成分全部加
入相比 ,根据小球藻不同生长期分 3个速率流加葡
萄糖和硝酸钾 ,可以明显提高小球藻的生长速度 。
采用不流加方式培养 , 初始 OD680 nm为 4.3 , 48 h
·68· 现代化工 第 28卷第 12期
OD680 nm为 68.6 , 对 应的平均 生长速 率为 1.3
OD680 nm/h 。而采用流加方式培养 ,初始 OD680 nm为
1.7 ,48 h OD680 nm为 128.8 ,对应的平均生长速率为
2.6 OD680 nm/h ,同比提高 100%,说明采用流加方式
是高效快速培养出小球藻的优化控制条件。根据建
立的小球藻 USTB-01的细胞干重浓度与 OD680 nm之
间的线性关系 [ 细胞干重浓度(g/L)=0.357
OD680 nm]计算[ 11] ,培养 48 h采用不流加碳 、氮源方
式获得小球藻细胞干重质量浓度为 24.5 g/L ,而根
据小球藻的不同生长期 ,分 3个阶段流加碳 、氮源方
式培养获得小球藻细胞干重质量浓度 46.0 g/L ,至
今尚未发现有在如此短时间培养获得如此高藻生物
量的研究报道。
图1(b)显示了流加与不流加葡萄糖 2 种条件
下 ,发酵液中葡萄糖浓度的变化 。采用不流加方式
培养 ,初始葡萄糖质量浓度达到 78 g/L ,培养 48 h
后降低到 40 g/L ,较高的葡萄糖浓度严重抑制了小
球藻的生长[ 9 , 11] 。而根据小球藻不同生长期 ,采用
逐渐加大葡萄糖流加量方式培养 ,发酵液中葡萄糖
质量浓度经历了前 24 h 逐渐增加到 19.8 g/L ,此后
逐渐降低到48 h的1.4 g/L 的先增加后降低的变化
过程 ,但始终维持在 20.0 g/L以内。实验 48 h结束
时葡萄糖已经基本消耗利用完 ,既保证了小球藻生
长的碳源所需 ,又没有对小球藻生长产生明显的
抑制 ,因此采用分3个不同速率 、逐渐增加葡萄糖流加
量是一种非常有效的小球藻异养发酵培养控制方式。
图1(c)显示了在流加与不流加硝酸钾条件下
硝酸钾浓度的变化过程 ,其变化趋势与葡萄糖浓度
的变化类似 。在不流加条件下 ,硝酸钾质量浓度从
初始的11.4 g/L 逐渐降低到 48 h 的 6.2 g/L。而在
流加条件下 ,硝酸钾质量浓度在前 30 h 逐渐增加到
2.6 g/L ,以后逐渐降低 , 48 h降低到 0.3 g/L以下 。
采用流加方式既可以保证小球藻生长的氮源供给 ,
同时也不会有较高浓度的硝酸钾积累而抑制小球藻
的生长。
2.2　500 L发酵罐培养结果
图2是 500 L 发酵罐采用葡萄糖和硝酸钾流加
方式下 ,小球藻生长(OD680 nm)和 pH的变化过程。
由图 2可知 ,小球藻的生长基本经历了前 12 h
的生长延迟期 、从 12 h 到 48 h 的生长指数期和从
48 h到54 h的生长稳定期3个阶段 ,从初始OD680 nm
12.8生长到 48 h 的 130.5 ,平均生长速率为 2.5
OD680 nm/h ,对应藻细胞干重质量浓度为46.6 g/L ,达
到了很高的藻生物量 。图 2显示在培养 42 h 内发
酵液的 pH基本呈现缓慢增加趋势 ,而 42 h 以后出
现下降 , 在 54 h 整个培养过程中 , pH 始终控制在
6.6 ～ 7.9的适合小球藻生长范围 。
1—pH;2—OD680 nm
图 2　500 L 发酵罐小球藻 USTB-01培养结果
pH为中性是小球藻的最适生长范围 ,当 pH 过
高或过低都会严重影响小球藻的生长 ,一般发酵培
养都要控制发酵液的 pH 以达到小球藻的快速生
长[ 8 ,10 , 15] 。影响小球藻发酵液 pH 的主要因素由提
供小球藻生长的碳源和氮源化合物种类决定 ,本研
究采用葡萄糖作为碳源可以产生某些有机酸和二氧
化碳 ,导致 pH 降低 ,而氮源硝酸钾可以使发酵液的
pH升高 ,综合上述 2种因素决定了发酵液 pH 产生
波动 ,但变化范围不大(6.6 ～ 7.9),不会严重影响小
球藻的快速生长。在工业化培养小球藻阶段 ,如果
能够不流加酸碱控制 pH也能够保持 pH基本稳定 ,
不仅可以节约成本 ,而且能够避免流加酸碱过程中
的染菌机会。
2.3　5 000 L发酵罐培养结果
图3是 5 000 L 发酵罐采用葡萄糖和硝酸钾流
加方式培养条件下 ,小球藻生长和 pH 的变化过程。
1—pH;2—OD680 nm
图 3　5 000 L 发酵罐小球藻 USTB-01培养结果
由图 3可知 ,小球藻生长结果与 500 L 发酵罐
培养结果基本类似(图 2),但生长速度有所下降 。
在大规模培养小球藻 USTB-01条件下 ,小球藻生长
也经历了生长延迟期和指数期 2 个阶段 , 由初始
OD680 nm的11.8生长到 63 h的 118.8 ,平均生长速率
为1.7 OD680 nm/h ,对应获得藻细胞干重质量浓度为
42.4 g/L。发酵液 pH 的变化也与500 L 发酵罐培养
·69·2008年 12月 景建克等:大规模异养发酵培养小球藻USTB-01研究
的结果类似(图 2),变化范围为 6.6 ～ 7.3 ,没有对小
球藻 USTB-01的生长产生明显影响 。
目前 ,在小球藻异养发酵培养已经有一些研
究[ 8 ,16] ,以前报道的最大培养规模为 4 000 L 发酵罐
培养[ 9] ,而该研究更进一步将培养规模提高到了
5 000 L发酵罐培养 ,为小球藻异养培养工业化生产
更前进了一步。该研究结果表明随着小球藻生物量
的逐渐增加 ,分 3个阶段逐渐提高葡萄糖和硝酸钾
分别作为碳源和氮源的流加量 ,不仅可以大幅度提
高小球藻的生长速度 ,最高获得了干重质量浓度
46.6 g/L的藻生物量 ,而且能够有效地利用提供的
碳氮源营养物质 ,同时还可以保持发酵液 pH 的基
本稳定 。从容积 50 、500 L 和 5 000 L 连续放大培养
结果显示 ,随着培养规模的增大 ,小球藻 USTB-01
的生长速度从 2.6OD680 nm/h下降到 1.7 OD680 nm/h ,
呈现逐渐减小趋势 ,其原因可能主要与随着培养规
模的增加 、培养基中的溶解氧逐渐降低有关 ,因此有
必要根据不同培养规模更进一步深入研究流加葡萄
糖和硝酸钾的控制战略 ,以达到更有效培养出超高
小球藻细胞浓度的目的。
3　结语
本文采用小球藻 USTB-01 作为藻种 ,分别在
50 、500 L 和5 000 L 发酵罐逐级放大异养发酵培养
方面进行了探索 ,得出的主要结论如下:
(1)根据小球藻 USTB-01 不同生长期 ,按照 3
个速率分别逐渐加大流加葡萄糖和硝酸钾量 ,可以
将小球藻 USTB-01生长速度提高 1倍 。在不同规
模培养条件下 , 72 h 以内均获得了质量浓度 40 g/L
以上的藻细胞干重 ,是一种高效 、大规模异养培养小
球藻的优化控制战略 。在如此短时间获得如此大量
的小球藻生物量 ,除笔者之外尚未见有文献报道 ,具
有非常好的工业化生产小球藻前景 。
(2)从 50 L 到 5 000 L发酵罐逐级放大培养 ,随
着培养规模的增加 ,小球藻 USTB-01的生长速度逐
渐从 2.6OD680 nm/h下降到 1.7 OD680 nm/h ,培养基溶
解氧不足可能是导致小球藻生长速率下降的主要
原因 。
(3)在小球藻异养发酵培养过程中 ,流加碳氮质
量比为20∶1的高浓度葡萄糖和硝酸钾溶液 ,不仅能
够明显提高小球藻 USTB-01的生长速度 ,而且可以
维持发酵液的 pH 基本稳定 。
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