全 文 ：第38卷 第3期 水 生 生 物 学 报 Vol. 38, No.3
2 0 1 4 年 5 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA May, 2 0 1 4

收稿日期: 2013-09-11; 修订日期: 2014-02-23
基金项目: 广东省教育厅工程中心建设项目(GCZX-A0909); 国家星火计划(2011GA780001)资助
作者简介: 刘加慧(1989—), 女, 河北邯郸人; 硕士研究生; 主要从事海洋经济动物发育生物学研究。E-mail: 13226267636@163.com
通信作者: 王辉(1966—), 男, 博士生导师; E-mail: whh524@sina.com

doi: 10.7541/2014.63
温度、盐度和 pH对小球藻生长率的联合效应
刘加慧 杨洪帅 王 辉
(广东海洋大学水产学院, 湛江 524088)
摘要: 采用中心复合设计(CCD)研究了温度(16—34 )℃ 、盐度[(15—45)‰]和 pH(6.0—9.0)对小球藻(Chlorella
sp. CHX-1)生长的联合效应。结果表明, 温度、盐度与 pH的一次、二次效应都对小球藻比生长速率有极显
著影响(P<0.01); 温度与盐度间、温度与 pH间的互作效应对小球藻比生长速率影响显著(P<0.05), 而盐度与
pH 间的互作效应影响不显著(P>0.05); 三因子影响度大小依次为: 温度>pH>盐度。采用响应曲面法建立了
温度、盐度和 pH对小球藻比生长速率影响的模型方程, 该模型的决定系数 0.9759, 矫正决定系数 0.9542, 说
明模型的拟合度极高; 模型的预测决定系数 0.8367, 表明可用于预测小球藻比生长速率的变化。通过模型优
化和验证试验, 得出在温度、盐度和 pH组合为 26.7 /25.5‰/7.3℃ 时, 小球藻比生长速率达到最大值 0.69, 满
意度为 0.999。本试验结果可为小球藻生产提供理论指导。
关键词: 小球藻; 温度; 盐度; pH; 生长; 响应曲面法
中图分类号: S968.41+9 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2014)03-0446-08

小球藻 (Chlorella)是一种常见的单细胞绿藻 ,
广泛分布于各种水体。小球藻富含藻多糖、脂肪酸、
糖蛋白和维生素等营养成分, 可以作为全营养食品
提供给人类, 有较好的药理和保健作用[1, 2], 是培育
轮虫和贝类等的重要饵料[3, 4], 也是去除污水 N、P
等物质效率最高的藻类之一[5, 6]。此外小球藻还可用
于生产生物柴油[7—9]。
为了更充分的利用小球藻, 首先要提高小球藻
的生产力。藻类生长与藻本身的生理特点以及诸多
环境因素有关, 其中水体温度、盐度和 pH是影响藻
类生长的重要环境因子。关于环境因子对小球藻生
长的影响国内外已有许多报道, 如杨桂娟等[10]研究
了温度对小球藻生长和溶氧量的影响, 表明在 25℃
时 , 小球藻生长速度与溶氧量的增长速度达到最
大。杜宇等[11]报道了小球藻在低盐环境中有较快的
生长速度。Rai, et al.[12]发现酸性 pH会抑制营养物
NO3+、NH4+的吸收和硝酸还原酶活性进而影响其生
长。赵娜等[13]研究了不同 pH 条件下 Cr6＋对小球藻
生长的毒性效应, 发现Cr6+在藻的最适生长 pH条件
下毒性最小。张桂艳等[14, 15]研究了不同理化因子对
小球藻生长速率、生物量和油脂产量的影响, 发现
温度、盐度和 pH 的影响表现为在适宜生长的条件
下油脂含量提高。De-Bashan, et al. [16]研究发现氮的
吸收取决于小球藻的生长情况。这些研究都说明研
究适宜小球藻生长的环境因子是很有必要的。但以
上研究仅局限于单因子的研究, 不能考察影响因子
之间的互作或协同效应, 也没有建立起可用于预测
的模型。本研究采用中心复合设计和响应曲面分析法,
拟研究温度、盐度和 pH 对小球藻生长的联合效应,
考察温度、盐度和 pH的一次、二次效应及互作效应,
建立相应的回归模型, 并通过模型优化找到最优因
子组合, 为其进一步的生产培养提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料及培养方法
试验用小球藻: 采用广东海洋大学藻种室提供
的小球藻(Chlorella sp. CHX-1)。小球藻保种于 f/2
液体培养基, 4℃冰箱。
3期 刘加慧等: 温度、盐度和 pH对小球藻生长率的联合效应 447

培养方法: 小球藻经长时间保存其活力会下降,
故正式试验前应先进行活化培养。先将小球藻接种
于 f/2培养基培养 4d进行活化。每天摇瓶 5—6次, 防
止藻细胞下沉或附壁。培养温度 25 , ℃ 光照 40 μmol/
(m2·s), 光暗比 12h︰12h。将进入对数期的藻种离
心、洗净后接入装有 50 mL f/2培养液[17]的 100 mL
锥形瓶, 使初始 OD值在 0.1—0.2。置于 GZX-150C
光照培养箱内在不同温度下进行一次性培养(控温
精度 0.1 ), ℃ 中间不更换培养液。用 NaCl调节藻液
盐度, 1 mol/L的 NaOH和 1 mol/L的 HCl调节藻液
pH, 并每隔 4h 监测一次水体 pH 变化, 用 Tris-HCl
缓冲液校正 , 以保证试验过程中 pH 变化不超过
±0.2。每天摇动锥形瓶两次(09:00和 17:00), 随机调
换锥形瓶的位置使受光均匀。藻种接种及培养过程
中, 均严格遵循无菌操作。
1.2 试验设计
采用中心复合法试验设计 (Central composite
design, CCD)研究温度、盐度和pH对小球藻生长的
联合效应。根据预试验的结果, 本试验中温度范围
为 16—34 , ℃ 盐度范围为 (15—45)‰, pH范围为
6.0—9.0。温度(T)、盐度(S)和pH在上述范围内各取
5个水平, 各因子水平的编码值分别是–1.68179、–1、
0、1、1.68179。整个试验共计20个温度、盐度和pH
三因子交叉组合(表1), 其中因子点数为8个 , 轴点
数6个, 星号臂α= ±1.68179, 中心点数为6。每个因
子点和轴点组合重复3次(表1)。为消除系统误差, 所
有因子组合均随机安排。
1.3 生长测定
取小球藻藻液, 用分光光度计测其在680 nm下
的光密度值(OD680)[18, 19], 以光密度值代表藻的生长
情况。每天定时取样测定, 每组设3个重复。接种后
1—5d, 藻液OD值快速增长, 第6天, 增长速率明显
减缓, 6d以后OD值变化很小。所以, 用培养前6d的
平均生长速率表示各种培养条件下的小球藻的比生
长速率。比生长速率(Specific growth rate, SGR)根据
普通生物学通用的计算公式[14]计算得到:

表 1 试验设计与相应结果
Tab. 1 Experimental design and results
编码值 Coded value 实际值 Actual value
组别 No.
T S pH T ( )℃ S (‰) pH
比生长速率
Specific growth rate (/d)
(mean ± SD)
1 1 –1 –1 30.4 21.1 6.6 0.52±0.06
2 0 0 0 25.0 30.0 7.5 0.64
3 0 0 0 25.0 30.0 7.5 0.69
4 –1 –1 1 19.6 21.1 8.4 0.26±0.12
5 1 1 –1 30.4 38.9 6.6 0.32±0.04
6 –α 0 0 16.0 30.0 7.5 0.24±0.10
7 –1 1 –1 19.6 38.9 6.6 0.20±0.17
8 0 0 α 25.0 30.0 9.0 0.26±0.09
9 0 0 –α 25.0 30.0 6.0 0.41±0.14
10 1 1 1 30.4 38.9 8.4 0.13±0.03
11 0 0 0 25.0 30.0 7.5 0.64
12 1 –1 1 30.4 21.1 8.4 0.39±0.08
13 –1 –1 –1 19.6 21.1 6.6 0.27±0.07
14 0 0 0 25.0 30.0 7.5 0.65
15 0 0 0 25.0 30.0 7.5 0.67
16 α 0 0 34.0 30.0 7.5 0.41±0.05
17 0 –α 0 25.0 15.0 7.5 0.58±0.09
18 0 α 0 25.0 45.0 7.5 0.30±0.12
19 –1 1 1 19.6 38.9 8.4 0.22±0.07
20 0 0 0 25.0 30.0 7.5 0.63
注: |α|=1.68179, α为星号臂
Note: α is the star arm; and |α|=1.68179

448 水 生 生 物 学 报 38卷

K=(lnNT – lnN0)/T
其中, K表示小球藻比生长速率; NT为时间 T的OD值;
N0是初始时的 OD值; T为培养时间, 试验期 T为 6d。
1.4 数据处理
以温度、盐度和 pH三因子为自变量, 小球藻比
生长速率为因变量 , 建立小球藻比生长速率和温
度、盐度、pH之间的回归方程模型为:
0 1 2 3 4 5
2 2 2
6 7 8 9
T S pH T S T pH
S pH T S pH
= + + + + × + ×
+ × + + + +
Y β β β β β β
β β β β ε
式中, Y为响应变量(小球藻比生长速率); β0为常数;
β1、β2、β3分别代表温度、盐度和 pH的一次效应; β3、
β4、β5分别代表温度与盐度间、温度与 pH间、盐度
与 pH间的互作效应; β6、β7、β8分别代表温度、盐
度和 pH 的二次效应; ε 为残差, 并假定其服从均值
为 0 的正态分布。采用 ANOVA 方法检验模型的显
著性, 并给出几种决定系数以辅助确定模型的拟合
优度。采用 SAS (v9.13)软件中的 RSM 模块对数据
进行统计分析, 模型中的各项效应采用最小二乘法
进行估计并采用 F统计量进行显著性检验。各因子
对生长的影响可通过等高线图展示。显著水平设定
为 0.05。
2 结果
对应于各个温度、盐度和pH组合的生长结果如
表1所示。由于每个因子点与轴点重复了3次, 故给
出了生长数据的标准差; 而为进行模型的失拟检验
及估计、降低纯误差, 本研究设置中心点次数为6,
无需再设重复组, 因此没有给出标准差。从结果看,
由于试验中采取了严格控制因子波动范围的措施 ,
数据的精度较高。
2.1 模型检验
通过对模型进行方差分析(表 2)可见, 方程模型
极显著(P<0.01), 失拟检验结果显著(P<0.05), 可能
是极小的纯误差造成的, 而非模型不恰当。

表 2 模型充分性的方差分析
Tab. 2 Analysis of variance for the adequacy of the model
项目
Term
平方和
SS
自由度
df
均方
MS
F 值
F value
P值
P value
模型 Model 0.65 9 0.073 44.59 <0.0001
残差 Residual 0.016 10 1.61E-03
失拟 Lack of fit 0.014 5 2.77E-03 6 0.0357
纯误差 Pure error 2.31E-03 5 4.61E-04
和 Total 0.67 19
注: 模型决定系数R2=0.9759, 矫正决定系数Adj.R2=0.9542, 预测决定系数Pred.R2=0.8367
Note: R2 was 0.9759, the Adj.R2 and the Pred.R2 reached 0.9542 and 0.8367, respectively


2.2 模型建立
对系数进行显著性检验结果表明(表 3), 温度、
盐度与 pH 的一次效应、二次效应对小球藻比生长
速率影响极显著(P<0.01), 温度与盐度、pH中任意
一因子间的互作效应对小球藻比生长速率影响显
著(P<0.05), 盐度与 pH 间的互作效应对小球藻比
生长速率影响不显著(P>0.05)。由于表 3 中的系数
估计值都是以编码值的形式给出 , 故可以直接比
较各因子效应的大小。由表 3可见, 温度、盐度与
pH 对小球藻比生长速率的影响度大小依次为: 温
度>pH>盐度。
对试验数据进行二次多元回归拟合, 根据试验
得出的小球藻比生长速率与温度、盐度和pH之间的
(即非编码)回归方程为:
2 2 2
14 09672 0 32698T 0 084718S 2 55264pH
0 000909T 0 00863T pH 0 000508S
pH 0 00451T 0 00111S 0 15776pH
= − + + +
− × − × −
× − − −
SGR
S
. . . .
. . .
. . .

该模型决定系数 R2 为 0.9759, 矫正决定系数
Adj.R2为 0.9542, 预测决定系数 Pred.R2为 0.8367。
由于本研究采用的试验设计具有正交性, 因而上述
模型方程中那些不显著的项可直接剔除而不必重新
估计各项系数。
2.3 响应曲面分析
从图 1、图 2、图 3可以看出, 当保持温度、盐
度和 pH 三个因子中的任何一个因子为最佳条件不
变时, 随着其他两个因子的升高, 小球藻的比生长
速率均呈先上升后下降的趋势。图 1、图 2 和图 3
的等高线图清晰的显示了随着这三个因子变化, 小
球藻的比生长速率存在最佳范围。
3期 刘加慧等: 温度、盐度和 pH对小球藻生长率的联合效应 449

表 3 回归方程系数及 95%置信区间估计
Tab. 3 Coefficient estimate and 95% confidence intervals
95%置信区间 95% confidence interval因子
Factor
系数估计
Coefficient estimate
标准误
Standard error
P 值
P value 低值 Low 高值 High
截距/Intercept 0.66 0.016 0.62 0.69
T 0.051 0.011 0.0009 0.027 0.075
S –0.076 0.011 <0.0001 –0.1 –0.052
pH –0.04 0.011 0.0043 –0.064 –0.016
T×S –0.043 0.014 0.0122 –0.075 –0.012
T×pH –0.041 0.014 0.0158 –0.073 –9.54E-03
S×pH –4.04E-03 0.014 0.782 –0.036 0.028
T2 –0.13 0.011 <0.0001 –0.15 –0.11
S2 –0.088 0.011 <0.0001 –0.11 –0.065
pH2 –0.13 0.011 <0.0001 –0.15 –0.1
注: 系数估计值为编码值
Note: The coefficient estimates were given in terms of coded factors


图 1 温度和盐度对小球藻比生长速率影响的等高线图
Fig. 1 Contour plot of the combination effects of temperature and
salinity on the growth rate of Chlorella sp. CHX-1

图 2 温度和 pH对小球藻比生长速率影响的等高线图
Fig. 2 Contour plot of the combination effects of temperature and
pH on the growth rate of Chlorella sp. CHX-1

2.4 优化
本研究中得到的模型方程有很高的拟合度和预

图 3 盐度和 pH对小球藻比生长速率影响的等高线图
Fig. 3 Contour plot of the combination effects of salinity and pH
on the growth rate of Chlorella sp. CHX-1

测能力, 根据 Montgomery, et al. [20]的方法对小球藻
比生长速率的模型方程进行优化。结果显示, 温度、
盐度和 pH 的最优组合为 26.7 /25.5℃ ‰/7.3, 此时小
球藻的比生长速率达到最大值 0.69, 满意度为
0.999。为了进一步验证响应曲面优化条件的可靠性,
按所得最优条件进行验证试验, 所得比生长速率为
0.70, 与理论预测值基本相符 , 说明模型优化条件
合理有效。
3 讨论
3.1 温度对小球藻生长的影响
温度通过影响藻类光合作用与呼吸作用强度来
影响其生长发育, 对经济微藻的生长速率及生化组
成造成显著影响 [21—23], 是影响藻类生长发育的重
要环境因素。本试验研究结果显示, 温度的一次效应
450 水 生 生 物 学 报 38卷

对小球藻比生长速率影响极显著(P<0.01), 温度的效
应大于盐度、pH的效应, 与一些学者的研究发现[24, 25]
相一致。等高线图(图 1和图 2)显示, 在 16—25℃温
度范围内小球藻比生长速率呈上升趋势 , 在
29.5—34℃内呈下降趋势。与杨桂娟等[10]和吴松[26]提
出的适宜温度范围一致。在一定温度范围内, 温度
较低时,细胞膜的运输和呼吸代谢功能会受到影响,
致使延迟期增加。但随着温度升高, 酶活性增强, 生
长速率加快[27]。只有在适宜温度范围内, 藻类才会
生长最快。有学者[14]证实在 15—35℃温度范围内,
小球藻的比生长速率呈先上升后下降的趋势。
3.2 盐度对小球藻生长的影响
盐度主要是调节微藻细胞胞内外的渗透压, 影
响微藻光合速率、叶绿素含量和一些代谢活动[28]。
本试验研究结果显示, 盐度的一次效应对小球藻比
生长速率影响极显著(P<0.01), 与 Cho, et al. [24]的研
究结果相符。等高线图(图 1和图 3)显示, 在(15—30)‰
的盐度范围内小球藻比生长速率呈上升趋势 , 在
(30—45)‰内呈下降趋势。金伟[29]指出盐度对单细
胞藻生长的影响呈抛物线型, 盐度过高或过低都不
利于藻的生长, 这与图 1 和图 3 中的趋势相似。江
灵芝等 [30]研究发现蛋白核小球藻 (Chlorella pyre-
noidosa)在(15—45)‰盐度范围均可以正常生长, 以
及韩志国等[31]报道小球藻(Chlorella minutissima)在
盐度 15‰开始出现较典型的生长曲线, 在(20—50)‰
盐度范围内均呈现典型的生长曲线, 与本试验得出
的盐度范围一致。
3.3 pH对小球藻生长的影响
pH值能改变微藻体内相关酶的结构状态和活
性、培养液中碳源的存在形式以及各种金属复合物的
溶解度, 从而影响微藻生长及脂肪酸的含量[12—15]。本
试验结果显示, pH的一次效应对小球藻比生长速率
影响极显著(P<0.01), 等高线图(图2和图3)显示, pH
为 6.0—7.5时小球藻比生长速率呈上升趋势 ,
7.5—9.0时呈下降趋势, 与赵娜等[13]研究结果相符。
在生长过程中, 小球藻会因自身生理代谢活动调节
生活环境的pH[19, 32], 小球藻喜欢弱碱性 (pH7.2—
8.2), 但在弱酸性(pH5.8—6.8)的水中也能生活和繁
殖 [33]。吴松 [26]报道小球藻适宜生长的酸碱度为
pH6—8左右, Matusiak, et al. [34]报道小球藻适宜生
长的pH为7.0—8.0, 与本试验结果相似。
3.4 温度、盐度和 pH对小球藻生长的互作效应
以往的研究多集中于单因子 [13—15]对小球藻生
长的独立影响, 因而这些研究不能考察多因子间的
互作影响, 还有一些采用正交实验[24, 25]。当因子之
间存在互作效应时, 对该交互作用的分析比单独分
析因素的主效应重要得多[20]。目前仅见 Cho, et al. [24]
采用双因素方差分析法, 得出温度和盐度的互作效
应对小球藻比生长速率影响极显著。本试验采用复
合设计, 对温度、盐度、pH的互作效应进行显著性
检验。结果表明, 温度与盐度的互作效应以及温度
与 pH 的互作效应对小球藻比生长速率影响显著
(P<0.05)。原因可能是温度升高或降低均会影响小球
藻体内酶的活性, 而此变化会影响小球藻渗透压调
节和酸碱平衡。但实验结果中盐度与 pH 的互作效
应对小球藻的比生长速率影响不显著(P>0.05), 造
成此结果的原因可能是, 渗透压和酸碱平衡的调节
是两个独立的过程, 不存在关联。
3.5 优化
本研究表明, 温度、盐度和 pH的二次效应对小
球藻的比生长速率影响均极显著(P<0.01), 温度、盐
度、pH与小球藻比生长速率之间呈曲线关系。从图
1、图 2 和图 3 可见, 小球藻的生长存在峰值, 即当
温度、盐度和 pH组合不恰当时, 小球藻生长量会降
低。从实际生产看, 确定温度、盐度、pH的最优组
合对提高小球藻产量具有现实意义。以上引用文献
均未发现温度、盐度及 pH 的二次效应。本试验是
基于可靠模型, 根据 Montgomery, et al. [20]的方法对
模型方程进行优化, 结果显示, 当温度、盐度和 pH
的组合为 26.7 /25.5℃ ‰/7.3 时, 小球藻的比生长速
率达到最大值 0.69, 满意度高达 0.999。本试验的研
究结果是基于可靠的模型, 而以前的研究均未建立
起可靠的模型, 故本试验结果更可靠, 且与杨桂娟
等[10]、吴松[26]报道的最适温度, 韩志国[31]、Sultana,
et al. [35]报道的最适盐度以及王子敬[36]等报道的最
适 pH接近。Mayo, et al. [37]使用混合培养基培育普
通小球藻的最适温度值(32.4℃), Ertit, et al. [38]报道
的 pH(8.0), 与本试验结果相差很大。有资料证实
藻种 [23]、培养基[14, 21]、光照强度及光暗周期[18, 25]
等都会影响藻的生长。所以很可能是藻株、培养基
等生长体系和培养环境的不同造成了最适温度、盐
度和 pH的不同。
3.6 模型的建立及其意义
响应曲面法是通过响应曲面分析得到拟合度较
高的模型方程, 并通过模型对试验指标进行可靠的
3期 刘加慧等: 温度、盐度和 pH对小球藻生长率的联合效应 451

预测[20]。然而国内外关于环境因子对藻类生长影响
的研究 , 大多采用单因子 [13—15, 23]或正交实验设计
方法[24, 25]。只针对环境因子的几个孤立的水平点进
行分析 , 极少数地建立了单因子线性回归方程 [24],
但无法对小球藻比生长速率进行连续预测。本研究
首次建立了二次多元曲线回归模型, 回归方程的决
定系数R2高达0.9759, 表明模型的拟合度很高。Cho,
et al. [24]建立的小球藻生长模型相关系数R2≤0.97,
显然本模型拟合度更高。模型失拟检验结果显著
(P<0.05), 可能是极小的纯误差造成的(表2), 而非
模型不恰当。然上述研究者的模型方程都没有进行
失拟检验, 无法判定其恰当性。更重要的是, 本研究
中还给出了模型的预测能力 , 预测R2为0.8367, 表
明能可靠预测到不同温度、盐度和pH条件下小球藻
的比生长速率。其他的模型方程均没有给出此值 ,
因而无法确定其预测能力。
本试验建立了温度、盐度和 pH 对小球藻比生
长速率影响的模型, 得出了温度、盐度和 pH最优组
合, 为小球藻的培养生产提供了理论基础。藻的生
长离不开光照和氮、磷等营养元素, 在一般情况下,
光照强度和培养基中的不同营养盐及其浓度都对小
球藻的生长有明显影响, 然本试验并未考虑, 优化
小球藻生长条件还需要进一步探讨。
参考文献：
[1] Chen Y, Li W B, Sun Y R. Status and prospects of
researches and applications of Chlorella spp. biotechnology
[J]. Progress in Biotechnology, 1998, 18(6): 11—15 [陈颖,
李文彬, 孙勇如. 小球藻生物技术研究应用现状及展望.
生物工程进展, 1998, 18(6): 11—15]
[2] Wei W Z. The isolation, purification and screening of the
tumor-prevention in vitro of glycoprotein from Chlorella
pyrenoidosa [D]. Jiangnan University, 2008 [魏文志. 小球
藻糖蛋白的分离纯化与体外预防肿瘤作用筛选的研究.
江南大学, 2008]
[3] Dhert P, Lavens P, Duray M, et al. Improved larval survival
at metamorphosis of Asian seabass (Lates calcarifer) using
ω3-HUFA-enriched live food [J]. Aquaculture, 1990, 90(1):
63—74
[4] Li L B, Liu Z G, Wang H. Effects of autolyzed baker yeast
as feed on growth and survival of Pinctada martensii
(Dunker) D-larvae and juveniles [J]. Journal of Fishery
Sciences of China, 2008, 15(6): 1034—1041 [李雷斌, 刘志
刚, 王辉. 自溶面包酵母在马氏珠母贝育苗中的饵料效果.
中国水产科学, 2008, 15(6): 1034—1041]
[5] Mallick N. Biotechnological potential of immobilized algae
for wastewater N, P and metal removal: a review [J].
Biometals, 2002, 15(4): 377—390
[6] Jones A B, Dennison W C, Preston N P. Integrated treatment
of shrimp effluent by sedimentation, oyster filtration and
macroalgal absorption: a laboratory scale study [J].
Aquaculture, 2001, 193(1): 155—178
[7] Xu J, Xu X D, Fang X T, et al. Screening and lipid analyses
of high oleaginous Chlorella species [J]. Acta
Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(3): 426—432 [徐进, 徐旭
东, 方仙桃, 等. 高产油小球藻的筛选及其油脂分析. 水
生生物学报, 2012, 36(3): 426—432]
[8] Schenk P M, Thomas-Hall S R, Stephens E, et al. Second
generation biofuels: high-efficiency microalgae for biodiesel
production [J]. Bioenergy Research, 2008, 1(1): 20—43
[9] Chisti Y. Biodiesel from microalgae [J]. Biotechnology
Advances, 2007, 25(3): 294—306
[10] Yang G J, Luan Z Q, Zhou X H. Researching on the effect of
temperature on Chlorella growth and dissolved oxygen
content [J]. Journal of Agricultural Mechanization Research,
2009, 9: 157—158, 161 [杨桂娟, 栾忠奇, 周笑辉. 温度对
小球藻生长量和溶氧量影响研究. 农机化研究, 2009, 9:
157—158, 161]
[11] Du Y, Sun X, Xu N J. Effects of different salinity and iron
concentration on growth, nitrate reductase activity and its
expression in Chlorella [J]. Ecological Science, 2012, 31(4):
441—445 [杜宇, 孙雪, 徐年军. 不同盐度和 Fe3+浓度对
小球藻生长、硝酸还原酶活性及基因表达的影响. 生态科
学, 2012, 31(4): 441—445]
[12] Rai P K, Mallick N, Rai L C. Effect of Cu and Ni on growth,
mineral uptake, photosynthesis and enzyme activities of
Chlorella vulgaris at different pH values [J]. Biomedical and
Environmental Sciences, 1994. 7(1): 56—67
[13] Zhao N, Feng M F, Zhu L. Toxic effects of chromium (Cr6+)
on Chlorella vulgaris and Scenedesmus obliquus at different
pH [J]. Journal Southeast University (Medicine Science
Edition), 2010, 29(4): 382—386 [赵娜, 冯鸣凤, 朱琳. 不
同 pH 值条件下 Cr6+对小球藻和斜生栅藻的毒性效应. 东
南大学学报(医学版), 2010, 29(4): 382—386]
[14] Zhang G Y, Wen X B, Liang F, et al. The effect of physical
and chemical factors on the growth and lipid production of
Chlorella [J]. Acta Ecologica Sinica, 2011, 31(8):
2076—2085 [张桂艳, 温小斌, 梁芳, 等. 重要理化因子对
小球藻生长和油脂产量的影响. 生态学报, 2011, 31(8):
2076—2085]
[15] Zhang G Y, Wen X B, Geng Y H, et al. The effect of pH on
the growth and lipid production of Chlorella sp. [A].
Algology branch of Chinese for Society of Oceanology and
Limnology. Chinese Algology branch Eighth Congress of the
Sixteenth Symposium Abstract Book [C]. 2011 [张桂艳, 温
小斌, 耿亚洪, 等. pH对小球藻(Chlorella sp.)生长和产油
的影响. 中国海洋湖沼学会藻类学分会. 中国藻类学会第
八次会员代表大会暨第十六次学术讨论会论文摘要集.
452 水 生 生 物 学 报 38卷

2011]
[16] De-Bashan L E, Antoun H, Bashan Y. Cultivation factors
and population size control the uptake of nitrogen by the
microalgae Chlorella vulgaris when interacting with the
microalgae growth promoting bacterium ‐ Azospirillum
brasilense [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2005, 54(2):
197—203
[17] Guillard R R L, Ryther J H. Studies of marine planktonic
diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula
confervacea (Cleve) Gran [J]. Canadian Journal of
Microbiology, 1962, 8(2): 229—239
[18] Hao J M , Zheng J, Li Z B, et al. Study on the relationships
between optical density at certain wavelength and cell dry
weight and cell concentration of three microalgae [J].
Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(28):
17399—17401 [郝聚敏, 郑江, 黎中宝, 等. 3种微藻在特
定波长下的光密度与其单位干重·细胞浓度间的关系研究.
安徽农业科学, 2011, 39(28): 17399—17401]
[19] Wang C, Li H, Wang Q Q, et al. Effect of pH on growth and
lipid content of Chlorella vulgaris cultured in biogas slurry
[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2010, 26(8):
1074—1079 [王翠, 李环, 王钦琪, 等. pH 值对沼液培养
的普通小球藻生长及油含量积累的影响. 生物工程学报,
2010, 26(8): 1074—1079]
[20] Montgomery, Douglas C. Design and analysis of
experiments [M]. New York: Wiley. 1984, 384—418
[21] Ding Y C, Gao Q, Liu J Y, et al. Effect of environmental
factors on growth of Chlorella sp. and optimization of
culture conditions for high oil production [J]. Acta Ecologica
Sinica, 2011, 31(18): 5307—5315 [丁彦聪, 高群, 刘家尧,
等. 环境因子对小球藻生长的影响及高产油培养条件的
优化. 生态学报, 2011, 31(18): 5307—5315]
[22] Converti A, Casazza A A, Ortiz E Y, et al. Effect of
temperature and nitrogen concentration on the growth and
lipid content of Nannochloropsis oculata and Chlorella
vulgaris for biodiesel production [J]. Chemical Engineering
and Processing: Process Intensification, 2009, 48(6):
1146—1151
[23] Ouyang Z R, Wen X B, Geng Y H, et al. The effect of light
intensities, temperature, pH and salinities on photosynthesis
of Chlorella [J]. Journal of Wuhan Botanical Research, 2010,
28(1): 49—55 [欧阳峥嵘, 温小斌, 耿亚红, 等. 光照强
度、温度、pH、盐度对小球藻(Chlorella)光合作用的影响.
武汉植物学研究, 2010, 28(1): 49—55]
[24] Cho S H, JI S C, Hur S B, et al. Optimum temperature and
salinity conditions for growth of green algae Chlorella
ellipsoidea and Nannochloris oculata [J]. Fisheries Science,
2007, 73(5): 1050-1056
[25] Wen G L, Liang W F, Li Z J, et al. Studies on the ecological
factors of four microalgae population in mixed-culture [J].
Progress in Fishery Sciences, 2009, 30(6): 142—148 [文国
樑, 梁伟峰, 李卓佳, 等. 共培养系统中 4 种微藻生态因
子的研究. 渔业科学进展, 2009, 30(6): 142—148]
[26] Wu S. On technique for industrial parent rearing of Chlorella
spp. [J]. Ocean and Fisher, 2008, 8: 34—35 [吴松. 小球藻
工厂化人工培育技术. 海洋与渔业, 2008, 8: 34—35]
[27] Zhang M, Zeng B, Wang M S, et al. The temperature
elevation suppresses the light energy utilization and growth
of Chlolorella pyrenoidosa under high light intensity
conditions [J]. Acta Ecologica Sinica, 2007, 27(2): 662—667
[张曼, 曾波, 王明书, 等. 温度升高对高光强环境下蛋白
核小球藻光能利用和生长的阻抑效应. 生态学报, 2007,
27(2): 62—667]
[28] Ahmad I, Hellebust J A. Osmoregulation in the extremely
euryhaline marine micro-alga Chlorella autotrophica [J].
Plant Physiology, 1984, 74(4): 1010—1015
[29] Jin W. Effect of salt and Cr3+ on physilolgy and biochemistry
of signal-cell alage [J]. Journal of Hebei University (Natural
Science Edition), 2002, 1: 44—50 [金伟. 盐和铬对单细胞
藻生理生化的影响. 河北大学学报(自然科学版), 2002, 1:
44—50]
[30] Jiang L Z, Sun X, Wang W W, et al. Effect of Salinity on the
growth, chlorophyll fluorescence characteristics and
enzymes of Chlorella pyrenoidosa [J]. Journal of Ningbo
University (NESS), 2013, 3: 6—10 [江灵芝, 孙雪, 王玮蔚,
等. 盐度对蛋白核小球藻生长、叶绿素荧光参数及代谢酶
的影响. 宁波大学学报(理工版), 2013, 3: 6—10]
[31] Han Z G. Effects of environmental stresses (salt-stresses,
heat-stresses, osmotic-stresses) on two marine phytoplankton
[D]. Jinan University, 2002 [韩志国. 环境胁迫(盐胁, 热胁,
渗透胁迫)对两种海洋浮游植物的影响. 暨南大学, 2002]
[32] Lustigman B, Lee L H, Khalil A. Effects of nickel and pH on
the growth of Chlorella vulgaris [J]. Bulletin of
Environmental Contamination and Toxicology, 1995, 55(1):
73—80
[33] Hua R C. Culture and Utilize Unicellularalgae [M]. Beijing:
Agricultural Publishing House. 1986, 23—32 [华汝成. 单细
胞藻类的培养与利用. 北京: 农业出版社. 1986, 23—32]
[34] Matusiak K. Studies on the purification of wastewater from
the nitrogen fertilizer industry by intensive algal cultures. I.
Growth of Chlorella vulgaris in wastes [J]. Acta
Microbiologica Polonica, 1975, 25(3): 233—242
[35] Sultana N, Hossain M A. Mass-scale mono-culture of marine
unicellular algae Chlorella minutissima under different
salinities [J]. Indian Journal of Fisheries, 1989, 36(3):
307—313
[36] Wang Z J, Jing J K, Xu Q Q, et al. Effects of different
temperature and pH on the growth and quality of Chlorella
USTB-01 [J]. Modern Chemical Industry, 2009, 29(2):
210—213 [王子敬, 景建克, 许倩倩, 等. 不同温度和 pH
对小球藻 USTB-01 生长和品质的效应. 现代化工, 2009,
29(2): 210—213]
[37] Mayo A W. Effects of temperature and pH on the kinetic
growth of unialga Chlorella vulgaris cultures containing
3期 刘加慧等: 温度、盐度和 pH对小球藻生长率的联合效应 453

bacteria [J]. Water Environment Research, 1997, 69(1):
64—72
[38] Ertit Taştan B, Duygu E, Dönmez G. Boron bioremoval by
a newly isolated Chlorella sp. and its stimulation by
growth stimulators [J]. Water Research, 2012, 46(1):
167—175
COMBINED EFFECTS OF TEMPERATURE, SALINITY AND pH ON THE
SPECIFIC GROWTH RATE OF CHLORELLA
LIU Jia-Hui, YANG Hong-Shuai and WANG Hui
(Fisheries College, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)
Abstract: By using central composite design, the join effects of water temperature (16—34 ), salinity [(15℃ —45)‰],
and pH (6.0—9.0) on the growth of Chlorella sp. CHX-1 were examined in this study. The results showed that the linear
and quadratic effects of temperature, salinity and pH on the specific growth rate (SGR) of Chlorella were significant
(P<0.01). The interactive effect of temperature and salinity, interactive effect of temperature and pH were significant
(P<0.05), but the interaction between salinity and pH was not significant (P>0.05). The effect of temperature on the
SGR was greater than that of pH, which in turn was greater than that of salinity. Through response surface methodology,
a model equation about the relationship of the growth rate to the three factors was established, with the R2, Adj.R2 as
highly as 0.9759 and 0.9542, suggesting that the fitting capability of the model was satisfactory. The Pred.R2 reached to
0.8367, demonstrating that the model could be practicably applied for prediction. Through the optimization of the relia-
ble model, the SGR reached its maximum (0.69) when the 3-factor combination was 26.7 /25.5℃ ‰/7.3, with the desi-
rability value being 0.999. These experimental results could offer theoretical reference for the production of the Chlo-
rella.

Key words: Chlorella; Temperature; Salinity; pH; Specific growth rate; Response surface method