全 文 ：2000年版中的规定标准为小于 50ng ml)。
2.5　细胞 DNA残余量:改进前后所有样品 DNA 含量均小于
25pg ,如图 6 所示。
3　讨论
凝胶过滤层析法是重组乙肝疫苗制备工艺中非常重要的
一步[ 1] , 直接关系到成品的质量[ 2] 。改进后在两个方面有收
获:一是产品产量 , 二是产品质量。作者采用留取峰后样并重
新柱层析的方法 , 乙肝表面抗原回收率可以提高 16.19%, 使
乙肝表面抗原尽最大可能地回收 ,降低了柱层析纯化时HBsAg
的损失 ,从而使乙肝表面抗原的总回收率提高到 60%以上。
同时在质量上 ,如纯度 、牛血清蛋白含量等指标均有明显的改
善 ,提高了基因工程乙肝疫苗的质量。
基因工程乙肝疫苗作为乙肝疫苗的第二代产品 , 制备工
艺复杂[ 2] , 从而导致影响乙肝表面抗原回收率的原因很多[ 3] 。
而乙肝表面抗原是一种糖蛋白 , 其本身又有很多不稳定因
素[4] ,所以回收率稍有提高都会带来巨大的经济效益。本文
采用收取峰后样的方法非常简单 ,操作方便 , 既保证了乙肝表
面抗原回收率的提高 , 又使产品的各项检测指标符合规定标
准[5] ,提高了产品质量。因此 , 作者认为这种柱层析收峰方法
非常实用 , 具有使用价值。
参考文献:
[ 1] 李彬 ,叶世德 ,王妍 ,等.柱层析法纯化基因工程HBsAg 中试工艺的
研究[ J] .中国生物制品学杂志 , 1995 , 8(2):56-59.
[ 2] 梅雅芳 ,任贵方 ,朱既明.基因工程乙型肝炎病毒表面抗原(HB-
sAg)连续纯化流程的建立[ J] .病毒学报, 1990 , 6(4):305-311.
[ 3] 陈金元 ,耿毅 ,郑菊梅.CHO-C28细胞收集液中乙型肝炎病毒表面
抗原收率的研究[ J].微生物免疫学进展 , 2001 , 29(1):31-33.
[ 4]冯小黎 ,金业涛 ,苏志国.分离纯化中蛋白质的不稳定性及其对策
[ J] .生物工程进展 , 2000, 20(3):67-71.
[ 5]中国生物制品标准化委员会.中国生物制品规程.2000年版[ S] .
北京:化学工出版社 ,2000年 6月.180-183.
自养条件下小球藻净化氮磷能力的研究
吕福荣 ,杨海波 ,李英敏 ,张欣华 ,于媛 ,刘艳(大连大学化学化工系 , 辽宁 大连 116622)
摘要:研究了在自养条件下 , 小球藻净化氮 、磷的能力。实验结果表明 , 小球藻对氮 、磷的吸收在开始的前 12h 内速度比较
快 ,利用率达 70%和 60%左右;吸收氮 、磷2d , 利用率可分别达到75%和 62%。低浓度的氮 、磷组合有利于小球藻对氮的吸收 , 在
磷浓度 50～ 100mg l范围内可以有效地吸收磷 ,吸收率接近 60%。升高温度有利于小球藻对磷 、氮的吸收。
关键词:小球藻;氮;磷;吸收
中图分类号:Q599　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2003)06-0046-02
Study on the N ,P Purification Ability of Chlorella under Autotrophic Condition
LV Fu-rong ,YANG Hai-bo ,LI Ying-min ,ZHANG Xin-hua ,YU Yuan ,LIU Yan(Department of Chemist ry and Chemical Engineering ,Dalian University , Dalian 116622 , PRC)
Abstract:The utilization of nitrogen , phosphorus of Chlorella was studied under autotrophic condition.The results show that the adsorption speed
of N , P by chlorella was fast in the first 12 hours , and the utilization effective were about 70% and 60%;two days later , the adsorption effective
could reach 75% and 62%.Low concentration combination of N , P took advantagead on adsorption of N by Chlorella.Effective adsorption of P
occurred when P concentration ranged from 50-100 mg l , the adsorption rate of P is almost about 60%.Raising temperature or light intensity can
benefit the sorption of N , P by Chlorella.
Key words:Chlorella;adsorption;N;P
收稿日期:2002-11-07;修回日期:2003-05-08基金项目:辽宁省博士启动基金资助项目(001059)作者简介:吕福荣(1971-),女 ,山东人 ,硕士 , 讲师 ,从事环境化学的教学和科研工作 ,已发表论文 10篇。
　　工业 、农业和生活废水中含有大量的氮 、磷。氮 、磷是生
物生长的必需的元素之一 , 但水体中磷含量过高(如超过 0.
2mg L), 将引起藻类的过度繁殖 , 造成湖泊 、河流透明度降低 ,
水质恶化 , 即富营养化 , 是环境治理的一大难题。 小球藻(Chlorellasp.)是一类普生性单细胞绿藻 ,属于绿藻门 、绿藻纲 、
小球藻属。目前世界上已知的小球藻有十几种 , 加上它的变
种可达数百种之多。由于小球藻生态分布广 , 易于培养 , 生长
速度快 ,是进行生物技术研究的良好材料。曾有研究肯定了
藻类对污水中氮 、磷等营养物的去除作用和效果[1-3] , 本文研
究了自养条件下小球藻对氮磷的利用状况和影响因素 , 对于
小球藻应用于高氮 、磷含量的污水处理具有重要的指导意义。
图 1　时间对小球藻吸收 NH+4 -N、磷的影响
1　材料与方法
1.1　实验材料
藻种:小球藻由辽宁省海洋水产研究所提供 , 是普生性单
细胞绿藻 , 属于绿藻门(Chlorophyceae)、绿藻纲(Chlorophyceae)、
绿球藻目(Chlorococcales)卵囊藻科(Oocystaceae)、小球藻属(Chlorella)。
图 2　N 、P 浓度与小球藻对 N的吸附率关系图
图 3　N、P浓度与小球藻对 P的吸附率关系图
藻种培养用水:从大连星海外海中抽取 10m 以下海水 , 经
3次抽滤 , 再煮沸 、冷却后添加 0.1%康维营养液 , 用于小球藻
第 13卷第 6 期:46
2003 年 12 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.13 , No.6:46
Dec.2003
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2003.06.024
的培养。
1.2　主要试剂
氢氧化钠 、碘化钾 、碘化汞 、酒石酸钾钠 、钼酸铵 、氯化亚
锡 、磷酸二氢钾 、氯化铵 、盐酸均为分析纯。含 NH+4 -N 溶液(模拟水样)由氯化铵配制;含磷溶液(模拟水样)由磷酸二氢
钾配制。溶液用去离子水配制;实验用水为自来水。
1.3　主要仪器
光学显微镜 、FA2004 电子天平 、THZ-82 水浴恒温振荡
器 、80-2 型离心机 、酸度计 、723 型可见分光光度计 、78-1 型
磁力加热搅拌器 、台式干燥箱。
1.4　小球藻的培养
藻种用 5L摇瓶间歇培养 , 培养液体积 4L , 接种量 20%。
通过自然光照 ,自养培养的方法 , 在测定其生物量的基础上确
定生长平衡期(大约培养 5d 后)以进行净化水中NH+4 -N 和 P的试验。
图 4　温度对小球藻吸收 NH+4 -N的影响
图 5　温度对小球藻吸收P 的影响
图 6　不同生长时期小球藻对 N的吸附
图 7　不同生长时期小球藻对P 的吸附
1.5　实验测定方法
1.5.1　小球藻生物量的测定方法:小球藻生物量的测定采用
血球计数法 、干重法和吸光光度法[4] 。
1.5.2　总磷的浓度的测定:氯化亚锡还原光度法[5] 。
1.5.3　NH +4 —N浓度的测定:采用纳氏试剂光度法[5] 。
1.6　实验操作步骤
取适当浓度的 N、P溶液加入藻液中 ,总体积 100ml , 用 723
可见分光光度计测定藻液的吸光度。振荡不同时间 , 吸取一
定体积溶液离心 、用 0.45μm滤膜过滤后测定溶液中残余的总
磷 、NH+4 —N浓度。调整温度 、氮 、磷的浓度组合测定平衡时溶
液中残余的总磷 、NH+4 —N 浓度。
2　结果与讨论
2.1　时间对吸附的影响
固定 N、P的浓度(NH+4 —N 的浓度为 200mg L , P的浓度为
100mg L pH=8.0 , T=20℃), 每隔一定时间吸取一定量的藻液
离心 , 测定上清液中NH+4 —N、磷的浓度。小球藻对 NH +4 —N、
磷的吸附如图 1 所示。由图 1 可知 , 小球藻对氮 、磷的吸收在
开始的前 12h 内速度比较快 , 利用率达 70%和 60%左右。 而
后的利用率逐渐减慢 , 随着时间的延长 ,小球藻对氮 、磷的吸
收逐渐稳定。从而我们决定 , 小球藻吸收氮 、磷 2d 就可以 , 利
用率可分别达到 75%和 62%。 另外 , 由图 2 可以看出小球藻
对于 N、P的吸收机理与吸附重金属是不完全相同的。这是因
为 N、P是小球藻生长的营养物质 , 藻细胞壁上存在一定的磷
酸根 、羧基 、巯基 、胺基等基因 ,小球藻对 N、P的吸附属于缓慢
吸附。而且由以上两个图也可以看出 , N 的吸附率比 P 的稍
高 , 这是因为藻细胞壁表面存在磷酸根 ,而无氨根。
2.2　N、P浓度对小球藻净化能力的影响
N的浓度分别为 N1 =100mg L , N2 =200mg L , N3 =300mg
L;P的浓度分别为 P1=50mg L , P2 =100mg L , P3=150mg L , 将
N、P浓度进行正交组合成 9 组。
图 2 显示小球藻对N 的吸收随N 、P浓度组合不同而有很
大不同。低浓度的氮 、磷组合有利于小球藻对氮的吸收 , 当
NH +4 —N 浓度 100mg l ,总 P浓度 50mg l时 , 小球藻对氮的利用率达 70%左右。而从图 3 可以看出 , 小球藻在磷浓度 50 ～
100mg l范围内可以有效地吸收磷 , 吸收率接近 60%,超过此
范围将影响它对磷对的吸收力。当磷的浓度达到 150mg l时 ,
小球藻对磷的利用率已降到了 20%以下。
2.3　温度对小球藻净化能力的影响
改变小球藻的吸附温度分别为 20℃、30℃, 发现随着温度
的升高 ,利于小球藻对 N、P 的吸收 , 这与吸附热动力学有关。
吸附温度主要通过影响生物吸附剂的生理代谢活动 、基团吸
附热动力和吸附热容等因素 , 进而影响吸附效果。所以 , 温度
升高使小球藻的净化能力变强。
2.4　不同生长期对小球藻吸附的影响
小球藻的生长分为四个时期 , 分别为延缓期(培养开始第
4-5d)、对数生长期(培养开始第 5-8d)、静止期(培养开始第
9-12d)、死亡期(培养开始第 13-17d), 在这四个阶段测定 N、
P的浓度 ,如图 6 、7 所示。由图可以看出 , 小球藻对 N、P的吸
附随着培养时间的延长而逐渐升高。当在死亡期时 , 对
NH +4 —N和总磷的吸收达到 70%和60%以上。
3　结论
小球藻对氮 、磷的吸收在开始的前 12h 内为速度比较快 ,
利用率达 70%和 60%左右;吸收氮 、磷 2d ,利用率可分别达到
75%和 62%。低浓度的氮 、磷组合有利于小球藻对氮的吸收 ,
在磷浓度 50～ 100mg l范围内可以有效地吸收磷 , 吸收率接近
60%。在最佳 pH 为 8.0 ～ 8.5 的条件下 , 吸收率可达 80%左
右;升高温度有利于小球藻对磷 、氮的吸收。 可以进行更加深
入研究以应用于污水处理中。
参考文献:
[ 1] 严国安.藻类净化污水的研究及其进展[ J] .环境科学进展 , 1995, 3
(3):44-54.
[ 2] 曹国民 ,赵庆祥 ,高广达.生物除磷脱氮工艺技术研究[ J] .中国环境
科学 , 1996 , 16(1):68-72.
[ 3] Robinson P K , et al.Phosphorus uptake kinetics of immobilized Chlorella
inbatch and continuous-flow culture[ J] .Enzyme Microb Technol , 1989 , 11
(9):550.
[ 4] 余若黔.低氮异养小球藻对氨氮的去除及其成分变化[ J] .华南理工
大学学报(自然科学版),2000 , 28(8):12.
[ 5]中国国家环保局.水和废水监测分析方法[ M] .第 3版.北京:中国
环境科学出版社 ,1989.
472003年 12 月　　　　　　　　　　　　　　自养条件下小球藻净化氮磷能力的研究