全 文 ：第 3 0卷 第 5期
9 9 9 1年 9 月
海 洋 与 湖 沼
(兀{E A N OL G IA OE T Ll入I N OL OG I A S I N IC A
V o l
.
3 0
S eP
.
,
N o
.
5
19 9 9
小球藻对 5 种常用基因工程
抗生素的敏感性研究 *
陈 颖 李文彬 张利明 孙勇如
(中国科学院遗传研究所 北京 10 O LO)I
提要 于 19 96 年以本实验室培养的椭圆小球藻为材料 , 就其对 4G 1 8 、 潮霉素 、 氯霉素 、 链霉
素 、 卡那霉素等 5 种抗生素的敏感性进行了研究 。 结果表明 , 小球藻对氯霉素 、 链霉素和卡那
霉素不敏感 , 对潮霉素较为敏感 , 10 协g /m l (致死剂量 , 下 同 )即 。 , 190 ~ ol / L( 致死浓度
, 下 同 )
的用量 可抑制 固体培养中小球藻的生 长 ; 对以 18 则高度敏感 , 30 拼g / m l即 a o 43 m m ol / L 的
4G
1 8 即可完全抑制固体培养中小球藻的生长 , 1 5协g /司即 .0 0 2 ~ ol / L的 4G 1 8 即可完全抑制
液体培养中小球藻的生长 。 与其它 4 种抗生素相 比 , 4G 18 更适合作为小球藻基 因工程 的选择
试剂 。
关键词 小球藻 基因工程 选择试剂
学科分类号 0 7 89
目前 高等植物 遗传转化 中选择性标记 的研 究 已较 为成熟 (w al d or n 。 t al , 198 5 ;
H i l l e e t a l
,
19 8 6 : uF
e h s e r a l
,
19 9 3 )
, 而藻类遗传转化选择标记的研究水平却参差不齐
( H as n a i n e z a l
,
19 8 5 ; 武建秋等 , 19 9 5 , 19 9 9 ; S et v e n s 。 t a z, 19 9 6 ) 。 椭圆小球藻是一种
单细胞真核藻类 , 它体积小 (3 一 12卜m ) , 结构简单 , 再生迅速 , 大规模培养繁殖技术早 已成
熟 , 因此利用转基 因小球藻作为高效 的新型生物反应器来生产有 用产 品 , 具有很大的潜
力 。 为了获得稳定 的转基 因藻株 , 必须利用选择标记基因对转化与未转化的细胞加以 区
分 , 以获得所需的含有 目的基因的藻株 。 因此 , 研究小球藻对一些遗传转化中常用的选择
试剂的敏感性 , 以确定适合小球藻的选择标记基因 , 是今后建立小球藻遗传转化系统 、 使
外源 目的基 因在其中稳定表达的前提条件 , 对利用转基 因小球藻作为高效生物反应器进
行产品开发具有十分重要的意义 。 目前 , 此方面的工作国 内外均未见报道 。 本文报告小球
藻对 5 种常用的基 因工程抗 生素的敏感性 的研究结果 , 以期为今后小球藻遗传转化系统
的进一步完善提供资料 。
1 材料与方法
1
.
1 小球藻来源及培养方法
椭 圆小球藻 ( cl/ lor el al el ilr so ide 。 )样品于 19% 年 由北京大学张购教授提供 。 液体
率 国家 “ 九五 ”科技攻关资助项 目 , 9 6〔 02 刃4刃 5号 。 陈颖 , 女 , 出生于 19 7 2年 8月 , 博 士 , E一 m田卜y lng c h e n @ bj . c .ol
收稿 日期 : 19 9 8习 1刁 8 , 收修改稿 日期 : 199 8司6一 29
5期 陈 颖等 : 小球藻对 5种常用基因工程抗生素的敏感性研究
培养基成分为克 氏培养液 : C减 Nq ) 2 1 .鲍 / L, 长PH O ; .0 2 9 / L , M gS O 4 · 7伙0 0 . 29 / L,
CK 10
.
1g2 几 , eF Q , 10m g / L , 附加 0 . 1% 的酵母提取物和 0 . 2% 的葡萄糖 。 固体培养基成
分同液体培养基 , 并添加 】. 8% 的琼脂 , p H = .6 0 一 8 . 0 。
固体培养 : 温度为 25 一 28 ℃ , 光照培养 1h6 , 光照条件为 3 0 0 一 4 0 O 0 lx , 黑暗培养 h8 ,
划线培养使藻成单藻落 。
液体培养 : 将在固体培养基中生长的直径约为 lm m 的单藻落接种于 20 m ! 液体培养
基中悬浮培养 , 转速为 80 一 10 0 r/ m in , 温度及光照条件同固体培养方法 。 预培 养 4一 5d 后
进行抗生素敏感性测定实验 。
L Z 抗生素来源及配制
4G 18
、 卡那霉素购 自 iL fe T ec h n ol og ie s 公司 , 潮霉素购 自 is g m a 公 司 , 氯霉素 、 链
霉素购 自华美生物公 司 。 抗 生素母液的配制参照萨姆布鲁克等 ( 19 9 2) , 母液浓度 均为
50m g/ m l
, 并用孔径为 0 . 2 卜m的细菌过滤器抽滤灭菌 。
L 3 实验方法
L l l 固体培养中小球藻对抗生素敏感性的测定 配制不同抗生素浓度梯度 (表 l) 的
固体培养基于直径为 gc m 的培养皿中 , 每种处理设 3 次重复 , 平行设置对照组 。 收集经液
体培养第 5 天的小球藻 , 调整密度至 1 x 108 ce l s /m l , 吸取 0 . 4m l铺板于含不同抗生素的固
体培养基中 , 置于适宜条件下培养 。
表 1 5种抗生素的实验浓度
T a b
.
I V如 o u s e o cn e n t r a it o n s o f if v e an it b i o it c s fo r et s t
抗生素 实验所设浓度梯度年g/ m l)
八曰n,ùù、únUù、Jl,`
八曰Unl八曰nflé气乙zn`曰八nUUù、nU14óUonOCù0
..,`勺`)nUC八曰M衬洲”ó日八U
《又 18
潮霉素
抓霉素
链霉素
卡那霉素
2 5
7 5
L .3 2 液体培养中的小球藻对 4G 18 敏感性的测定 挑取单藻落于含有液体培养基的
三角瓶中 , 在适宜条件下培养 4一d5 ( 10 6一 10 7ce Us/ m l ) , 于 440 nm 测定吸光度 O D 值 , 然后
将其分装到 10 o m l 三角瓶中 , 每瓶加藻液 2 0 m l , 再分别加人 5卜g / m l 、 10林g / m l、 15协g / m l和
20 卜g/ m l的 4G 18 , 3次重复 , 平行设置对照组 , 观察培养 , 并分别在生长第 1周 、 第 2 周 、 第 3
周后测定 O D 值 。
2 结果与分析
2
.
1 固体培养中小球藻对 5 种抗生素的敏感性
通过对 5 种抗生素的筛选后发现 , 小球藻对 4G 18 最为敏感 (表 2) 。 在固体培养 中 ,
1 0拼g / m l的 4G 18 即对小球藻的生长有 明显的抑制作用 , 培养 1周后仅有少量藻落长 出 。
在含有 25 卜g / m !的培养基 中 , 1周 内没有生长出藻落 , 仅在 2 周后 , 有零星藻落出现 , 说 明
25 协g / m l的 4G 18 尚不能完全抑制小球藻的生长 。 而在 30 协g/ ml 的 4G 18 培养基中 , 培养 3
周 , 甚至 4一 5 周以后 , 均无一个藻落长出 , 可见 30 协g / m l即 o . 043 mm ol / L的 4G 18 已能够完
海 洋 与 湖 沼 3 0卷
T a b
.
2
表 2 小球藻对 5种抗生素的敏感性测定结果
Te
s t o f s e n s i ti v ity
o f hC l
or e l la e l l切 s o ide a t o fi v e na ti b l o ti e s
抗生素
(训 18
潮霉素
氯霉素
链霉素
卡那霉素
致死剂量 (卜 g / m l ) 致死浓度 (m m o l / L )
3 0
10 0
0刀 4 3
0
.
19 0
> 2 0 0 > 0石 1 9
> 6 0 0 > 0 4 12
> 6 0 0 > 1
.
2 4 0
全抑制一定量的小球藻的生长 ,是小球藻生长的致死剂量 (图版 I : 1 ) 。
在被检测 的 5 种抗生素中 , 卡那霉素对小球藻的生长抑制最不明显 , 当卡那霉素的用
量高至 6 0 协g /m l即 1 . 24 ~ of / L时
, 经 2一 3 周的培养 , 仍有大量成片的绿色藻群长出 , 其
生长状态与对照组差别不大 。 小球藻对链霉素也不敏感 , 但较卡那霉素敏感 。 当选择压力
增加至 60 0卜g /m l即 0 . 4 12 ~ ol / L时
,
2一 3周后 , 大多数小球藻已不能生长 , 培养基中仅长
出 2一 3个藻落 。 当潮霉素含量为 25 协g /ml 时 , 开始表现出对小球藻生长的抑制作用 , 只有
当浓度增至 10 协g / m l即 o . 190 m m ol / L时 , 才表现出对小球藻的完全抑制作用 , 2一 3 周后 ,
未 发现有藻 落长 出 , 继续培养至第 4 、 5 周 , 仍维持 该状 态 (图版 I : 2) 。 而氯霉素含量达
20 0 “ g / m 】即 o . 6 1 9m m ol / L时 , 固体培养中仍有小球藻成片长出 , 不能完全抑制小球藻的生
长 。 因此 , 与其它 4 种抗生素相 比 , 小球藻对 4G 18 最为敏感 。
.2 2 液体培养中小球藻对 G 4 18 的敏感性
经测定 , 小球藻培养液在 4 4 Onm 时有最大吸收高峰 , 因此所有 O D 值均在 4 4 0mn 下测
得 。
未加抗 生素之前 , 测得生长第 4 天的小球藻液体培养液密度为 3 . 9 x 1 0 7 ce U s/ m l ,
O D 值为 1 . 7 7 0 。 分别加人浓度为 5协g / m l 、 10林g /m l 、 1 5卜g /m l和 2 0协g / m l的以 18 , 生长 l 周
后观 察 , 发现对照组及 各处理溶液均为绿色 , O D 值分 别为 1 . 924 、 1 . 868 、 1 . 806 、 1 . 802 和
1
.
7 8 8
。 生长 2周后 ,各处理 间培养液颜色出现差异 , 对照组为深绿色 (图版 I : 3 ) , 含 5协g /m1
目0
第 。周 第 1 周 第 2 周 第 3 周
图 1 液体培养中不同浓度以 18 对小球藻生长的影响
R g
.
l E fe
e匕 o f v an o us (孙 1 8 e o cn e n atr it o n o n
C e ll切 o ide a g r o w ht 一n li P l d e u l t l r e
4G 18 的培养液颜色为浓绿色 , 其 O D 值
为 2 . 5 5 2 ; 而 1 0林g zm l的以 1 8 对小球藻
的生长已表现 出明显的抑制 , 培养液 的
颜 色呈淡绿色 , O D 值为 1 . 5 43 , 在显微
镜下 除能观察到一些正 常的分裂 细胞
外 , 还有皱缩变形的死亡细胞 。 生长至
第 3 周后 , 含 15协g /m l和 2 0协g / m l 以 15
的培 养液完全变成黄 白色 (图版 I : 3) ,
经测定 , O D 值分别为 0 . 57 5 和 0 . 53 2 , 显
微镜 下观 察发现小球藻细胞 均呈皱缩
状态 , 无处于分裂 时期的细胞 。 可见在
液体培 养 中 , 当培 养基 中 4G 18 的浓度
为 10协g /m l时 , 即对小球藻的生长有了
5 期 陈 颖等 : 小球藻对 5种常用基因工程抗生素的敏感性研究
一定的抑制作用 , 而 15林g / m l即 .0 02 2m m of / L的 4G 18 则可完全抑制小球藻的生长 (图 l ) 。
3 讨论与结语
.3 1 在 目前的高等植物遗传转化中 , 4G 18 、 潮酶素 、 氯霉素 、 链霉素和卡那霉素是较为常
用的一些抗生素类选择试剂 。 其中卡那霉素是迄今转化报道中利用最多的一种 , 它已成
功地应用于马铃薯 、 大豆 、 蕃茄 、 向 日葵 、 棉花 、 烟草 、 拟南芥 、 菊花等几十种双子叶植物以
及玉米等极少数单子叶植物中 。 但卡那霉素的使用浓度变化范围很大 , 即不同植物对其
的敏感性不同 。 在转化向日葵的分生组织时 , 25 林g / m l的卡那霉素被认为是最佳浓度 (傅
荣昭等 , 19 9 4) , 而 V as il 等 ( 19 9 1) 在转化小麦悬浮细胞时 , 卡那霉素的用量则高达 4 0 0一
80 0卜g / m l 。 本实验 的结果表明 : 小球藻对卡那霉素极不敏感 , 当用量 高达 6 0 0协g / m 】即
1
.
2 4
~
ol / L时 , 仍未出现抑制小球藻生长的迹象 。
3
.
2 C A T 基因编码的氯霉素乙酞转移酶 (e h l o amr p h
e n i e o l ac
e yt l t ar n s fe r as e
,
C A T )使转基
因植物获得氯霉素抗性 。 目前 已在多种高等植物 中实现了瞬间和稳定表达 ( P o sr c h , ! 9 ;3
幻 o p fe n s et i n , 19 9 1 ) 。 币 e l等 ( 19 5 7 )用电击法将穿梭质粒 p既 6 导人丝状蓝藻 (肋 a b a e n a
s p
.
S iatr
n M 13 1 )中 , 用 2 5协g /m l的氯霉素筛选获得了阳性克隆 。 武建秋等 ( 1 9 9 5 , 1 9 9 9 )的
研究表明 , 海带对氯霉素很敏感 , C A T 基 因可用作海带及其它大型褐藻基因工程的选择标
记基 因 。 虽然大型藻类对氯霉素很敏感 , 但作者通过实验发现 , 小球藻对氯霉素并不敏
感 , 当用量达到 2 0 林g / m l即 0 . 6 19 ~ of / L时
,仍不能抑制多数小球藻的生长 。
3
.
3 H p T 基 因编 码 蛋 白酶— 潮 霉素磷 酸 转 移 酶 (h y g or m y e i n p h o s p h o tr a n s fe ar s e ,HP T ) , 使转基 因植物获得潮霉素抗性 。 研究发现许多植物对潮霉素表现出很高 的敏感
性 , 其使用浓度大致为 20 一 20 卜g / m l (傅荣昭等 , 19 94) 。 小球藻对潮霉素也较为敏感 , 当
用量增至 10 0协g / m l即 0 . 190 m m of / L时 , 小球藻的生长可完全受抑制 。
3
.
4 由 N p T l l 基因编码的新霉素磷酸转移酶 (Ne o m y e i n p h o sp h o antr
s fe asr
e 一 xl , N P T l l )所
对应的另一种抗生素 4G 18 , 在多种植物中都表现出较低的本底 , 在筛选使用时浓度也相
对较低 。 如在转化大豆胚性悬浮系时 , 4G 18 用量为 50 协g/ m l( 傅荣昭等 , 1 9 4) , 李文彬等
( 19 5) 在转化水稻原生质体时 , 4G 18 的用量为 20 协g / m l 。 H as n ia n 等 ( 19 8 5) 转化莱茵衣
藻时 , 固体培 养基 中 4G 18 的用量为 12 卜g / m l , 而在液体培养基 中 4G 18 的用量仅 为
1
.
5雌 /ml , 表现出对 4G 18 的高度敏感性 。 本实验的结果表明 : 与其它 4 种被检抗生素相
比 , 小球藻对 4G 18 也表现 出较高的敏感性 。 在固体培养 中 , 3 0协g / m l即 .0 043 ~ ol / L 的
4G 18 即可完全抑制小球藻的生长 , 而在液体培养中 , 10卜g / m l的 4G 18 对小球藻 的生长表
现出明显的抑制效应 , 当用量达 15协g / m l即 0 . 0 2 m m ol / L时 , 即可完全抑制其在液体培养
中的生长 。 因此 ,基于小球藻对 4G 18 的高度敏感性 , 可以认为 : 如果以 N P T l l 基因作为小
球藻基 因工程的选择标记基因 , 则 4G 18 更适宜作为转基因小球藻遗传转化的抗生素抗性
选择试剂 。
在 目前的藻类遗传转化研究 中 , 莱茵衣藻研究的最为透彻 , 已成为染色体 、 叶绿体 、 线
粒体三套基 因组均能稳定转化的单细胞真核藻类 , 主要运用野生 D N A与突变 D N A 同源
重组 , 通过互补对转基因藻进行筛选 ( R co h ia x e t a z, 19 5 2 : iK n d l e , 19 9 0: M a y if e ld e z a l ,
19 ;1 Hal
。 t al , 19 3)
。 同时研究 还 表明 , 莱 茵 衣藻对 4G 18 、 卡那 霉素 及腐草霉 素
(P h l e o m y c i n )等抗生素较敏感 ( Has n ia n 。 t a z , 19 8 5 ; S te v e n S 。 2 a l , 19 9 6 ) , 它们的抗性基
5 04 海 洋 与 湖 沼 3 0卷
因可作为转基因藻的选择标记基因 。 大型藻类遗传转化的研究特别是选择标记的研究也
初见端倪 。 武建秋等 ( 1 95 9, 19 99) 研究发现 , 海带对链霉素 、 卡那霉素等不敏感 , 而对潮酶
素 、 氯霉素则非常敏感 , 认为氯霉素可作为转基 因海带的有效选择试剂 , C A T 基 因是海带
基因工程的有效选择标记基 因 。 小球 藻的遗传转化虽也取得 了一些进展 ( aJ ir vs et al,
19 1; C he
n 。 t al , 19 8 )
, 但有关小球藻基因工程选择标记的研究从未见报道 , 本文通过
5种基因工程中常用抗生素对小球藻生长抑制的研究发现 : 小球藻对氯霉素 、 链霉素 、 卡那
霉素不敏感 , 对潮霉素较为敏感 , 而对 4G 18 表现出高度敏感性 。 实验结果初步证明 , 如果
以 N P T l l 基因作为小球藻基因工程的选择标记基 因 , 则 4G 18 更适宜作为转基因小球藻的
抗生素抗性选择试剂 。
参 考 文 献
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5: 10 3一 10 8
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