全 文 ：制备生物柴油用小球藻的
油脂富集培养研究
齐沛沛 ,王　飞
(南京林业大学化学工程学院 ,江苏 南京 210037)
摘要:研究了培养温度 、光照强度 、氮源及其氮含量对小球藻 Chlorella spp的生长 、油脂含量及脂肪酸的影响 ,以期获得最为
适宜的富含油脂微藻的培养条件。采用比生长速率评价微藻的生长状况 ,以溶剂浸提法提取微藻中的油脂 ,并采用气质联用和
气相色谱分析微藻的脂肪酸组成。研究结果表明 , 既能使微藻 Chlorella spp良好生长又可提高其油脂含量的培养条件为:温度
25℃、光照强度 3 500 lux 、添加氮源硝酸钠并使其含氮质量浓度为 0.25 g/ L ,此时的油脂含量可达 43.7%。微藻脂肪酸的组成以
C16∶0、C18∶0 、C18∶2为主 ,表明小球藻的主要脂肪酸组成为 C16和 C18脂肪酸。
关键词:Chlorella spp;微藻油脂;脂肪酸组成
中图分类号:Q945;Q949.93　 文献标识码:A　 文章编号:0253-4320(2008)S2-0036-04
Study on oil accumulation culture of microalgae Chlorella spp for biodiesel production
QI Pei-pei , WANGFei
(College of Chemical Engineering , Nanjing Forestry University , Nanjing 210037 , China)
Abstract:The factors that affecting the growth , lipid content and the fatty acid composition of microalgae Chlorella spp ,
are investigated in this paper to determine the optimum culture condition.These factors include culture temperature , light
intensity and nitrogen sources.Growth rate is used to evaluate the growth of Chlorella spp ,microalgae oil is extracted by solvent
extraction method , and the fatty acid composition is analyzed by GC-MS and GC.The results show that the optimum culture
conditions of Chlorella spp are:temperature of 25℃, light intensity of 3 500 lux , and NaNO3 as nitrogen source and N content of
0.25 g/ L.Under the optimum conditions , the lipid content of microalgae is up to 43.7%.The major components of fatty acids in
Chlorella spp are C16 and C18 fatty acids.
Key words:Chlorella spp;microalgae oil;fatty acid composition
　收稿日期:2008-10-10
　基金项目:国家“ 948”重大引进创新项目(2006-4-C05);南京林业大学科研创新基金项目
　作者简介:齐沛沛(1983-),女 ,硕士生;王飞(1962-),男 ,博士 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事天然产物化学 、生物质能源与化学品研究 , 通讯联
系人 , 025-85427273 ,hgwf@njfu.edu.cn。
　　生物柴油生产的最大瓶颈是原料问题 ,因此寻
找新的资源 ,开发潜在的生物柴油生产新原料成为
生物柴油产业发展的重要途径 。微藻尤其是海洋微
藻 ,不仅资源丰富 ,而且细胞内一般富含油脂 ,是一
种具有较好应用前景的生物柴油生产潜在新原料 。
利用微藻加工制备生物柴油的关键是如何通过
优化培养尽可能提高微藻细胞的油脂含量。在单细
胞微藻的培养过程中 ,培养基成分 、温度 、光照强度 、
pH 、培养方式 、通气量 、盐度等均会影响微藻的生长
以及其脂肪酸的含量与组成。温度 、光强能影响微
藻的光合作用和呼吸作用 ,从而对其生长及体内生
化成分产生影响[ 1-4] ,在极端高温或低温条件下 ,微
藻合成油脂的量都会减少[ 5-6] ,可能是相关的酶发
生不可逆损伤所致 ,文献[ 7-10] 报道证实了这一
点;培养基中氮源对微藻的生长及脂肪酸的影响也
极为显著 ,单胞藻对不同氮源的吸收速度与利用程
度是有差别的[ 11-12] ,可能是酶功能的差异造成了
各种微藻利用氮能力的差异 ,结果也支持了藻类对
氮盐喜好和利用能力存在差异的观点[ 13-18] 。为了
探讨用于生物柴油生产的微藻油脂富集培养 ,本文
对小球藻 Chlorella spp 在不同培养温度 、光照强度 、
氮源及氮含量条件下的生长状况和其油脂含量及脂
肪酸组成进行了研究 ,以得到富含油脂的微藻藻株
及其培养条件。
1　实验部分
1.1　实验用菌种
小球藻 Chlorella spp 购自中国科学院海洋研究所。
1.2　微藻的培养与采收
接种前 ,为防止藻种污染 ,培养用的工具与器皿
·36·
Oct.2008 现代化工 第 28卷增刊(2)
Modern Chemical Industry 2008年 10月
都经过严格的灭菌。将培养至对数生长期的微藻于
Allegra X-22R离心机中离心 ,弃去上清液后 , 在浓
缩藻液中加入少量新鲜培养基 ,混匀后量取一定量
的藻液转接至新鲜配置的培养基 ,培养基采用 BG11
培养基 ,并通过测定其吸光值来调控其初始接种密
度。将新鲜藻液置于光照培养箱中静置培养 ,每天
振摇 3 ～ 4 次 ,光暗周期为 12 h∶12 h ,培养温度有
20 、25 、30 、35℃4个水平 ,光照强度分 2 500 、3 500 、
4 500 lux 3 个水平 , 并分别添加氮源 NaNO3 或
NH2CONH2 ,使培养基的氮质量浓度分别为 0.062 5 、
0.125 、0.250 、0.375 g/L ,以探讨不同培养温度 、光照
强度及氮源添加量对微藻生长 、油脂含量及脂肪酸
组成的影响。
采用离心法采收微藻 , 3 500 r/min 转速下离心
5 min ,将下层浓缩藻泥预冻 30 min 后冷冻干燥 24
h ,取出后保存于 4℃冰箱中备用。
1.3　微藻生物量的测定方法
采用紫外可见分光光度仪测定微藻溶液在 540
nm处的吸光值(OD540)。比生长速率可用来评价微
藻在一定时期内的总体生长情况。该指标的计算以
浊度法测定的吸光值为基础 ,如公式:
μ=(lnNT -lnN 0)/ T
其中 μ为比生长速率 , N0 为接种时藻液在 540 nm
处的吸光值 , NT为培养 T 天后藻液在 540 nm 处的
吸光值。在该研究中 ,平均生长速率以微藻在 8天
内的平均比生长速率计 ,即 T=8 。
1.4　油脂的提取
采用溶剂浸提法 ,提取溶剂为石油醚 、乙醚混合
溶液(体积比为 2∶1),40℃条件下浸提 5 h。将充分
研磨的干燥粉加入提取溶剂 ,期间适当振荡混匀 ,待
提取结束后 ,加入质量分数 10%的氢氧化钾溶液沉
淀微藻细胞 ,摇匀静止一段时间后 ,将混合溶液在
6 000 r/min转速下离心 10 min ,收集上清液于已恒
重的离心管中 , 于 60℃水浴中迅速蒸去多余的溶
剂 ,称量 ,计算油脂含量。
1.5　脂肪酸组成分析
(1)气相色谱-质谱联用定性分析
微藻样品经提取油脂后 ,采用氢氧化钾-甲醇
室温甲酯化法进行油脂甲酯化 ,所得脂肪酸甲酯进
行气-质联用分析 ,以确定微藻中主要脂肪酸组成。
采用FinniganGC-MS Trace DCQ进行分析 ,色谱
柱为 DB-5(0.25 mm×30 m×0.25 μm),程序升温:
150℃恒温 1 min ,以 3℃/min升温速率升至 250℃并
保留 2 min 。进样口温度为 250℃, 气化室温度为
250℃,离子源温度为 250℃,载气为氦气 ,流速 0.8
mL/min ,分流比为 1/10 ,进样量 1μL。
(2)气相色谱定量分析
采用氢氧化钾-甲醇法进行油脂甲酯化后 ,利
用气相色谱法定量分析脂肪酸组成百分含量 。气相
色谱仪为 SHIMADZU GC-14B ,采用色谱柱为 DB-5
毛细管柱(30 m ×0.32 mm , 0.25 μm), 程序升温:
150℃恒温 1 min ,以 3℃/min升温速率升至 250℃并
保留 2 min。进样口温度为 250℃,氢火焰离子检测
器(FID),载气为高纯氮 ,氮气压力 1 kg/cm2;氢气流
量50 mL/min ,空气流量 50 mL/min ,分流比为 1/10 ,
进样量1μL。各脂肪酸组成百分含量按照面积归一
化法计算 。
2　结果与讨论
2.1　微藻脂肪酸组成的确定
气相-质谱联用技术用于确定微藻脂肪酸组
成 ,将微藻进行油脂提取后的样品 ,采用氢氧化钾-
甲醇室温甲酯化法进行油脂甲酯化 ,所得样品进行
气质联用分析 ,结果如图 1所示 ,各个色谱峰的保留
时间与其所对应的脂肪酸种类如表 1所示 。
图 1　微藻甲酯化产品 ,脂肪酸甲酯的
气质联用气相色谱图
从图 1可以看出 ,微藻的脂肪酸组成很复杂 ,但
主要的脂肪酸组成有 10种 ,由表 1 可知 ,主要的饱
和脂肪酸有C14∶0 ,C16∶0 ,C18∶0(“∶”前的数字是脂
肪酸的碳数 ,之后的数字为含的碳碳双键数 ,下同),
其中还有极其微量的 C15∶0 , C17∶0;不饱和脂肪酸
主要为C16∶1 ,C16∶2 ,C16∶3 ,C18∶1 ,C18∶2 ,C18∶3 ,
C20∶5。据研究报道(Wood 1988 , Dunstan 1992 ,
Zhukova &Aizdaicher 1995), 绿藻纲微藻常含有
　　　　　表 1　气相色谱中主要脂肪酸所对应的相对保留时间
脂肪酸种类 C14∶0 C16∶0 C16∶1 C16∶2 C16∶3
相对保留时间/min 8.34 13.36 12.75 12.4 12.53
脂肪酸种类 C18∶0 C18∶1 C18∶2 C18∶3 C20∶5
相对保留时间/min 18.88 18.09 17.88 18.04 22.45
·37·2008年 10月 齐沛沛等:制备生物柴油用小球藻的油脂富集培养研究
高浓度的 C16和C18脂肪酸 ,而 C20和 C22不饱和
脂肪酸则缺乏 ,本研究的结果与之相一致。
2.2　温度和光照强度对微藻生长 、油脂含量与脂肪
酸组成的影响
温度和光照强度是影响微藻生长的极为重要的
环境因子 ,不同的培养温度和光照强度下所得到的
微藻平均生长速率 、油脂含量和其脂肪酸组成如图
2和表2所示。
图2　培养温度和光照强度对小球藻
Chlorella spp生长的影响
小球藻 Chlorella spp 在培养温度为 25℃时 ,达
到了最大的平均生长速率 。由图 2可知 ,小球藻在
20 ～ 35℃均能够正常生长 ,在同一光照强度下 ,小球
藻的平均生长速率随着温度的升高而先增加后降
低 ,在 25℃得到了最大的平均生长速率 ,即为其生
长的适宜温度。
在培养温度为 25℃时 ,小球藻 Chlorella spp 的
平均生长速率均随光照强度的增加而增大 ,适宜的
微藻 Chlorella spp 生长的光照强度为 3 500 ～ 4 500
lux 。
表 2　温度和光照强度对微藻 Chlorella spp 油脂含量
和脂肪酸组成的影响
2500 lux 3500 lux 4500 lux
20℃ 25℃ 30℃ 35℃ 20℃ 25℃ 30℃ 35℃ 20℃ 25℃ 30℃ 35℃
油脂含
　量/ %
5.5 32.6 10.0 18.0 5.6 43.7 8.4 39.0 6.7 28.9 6.3 8.0
　
C14∶0 1.6 1.6 1.7 2.1 1.2 1.5 1.5 1.0 1.1 1.6 1.9 1.7
C16∶0 30.3 25.6 21.1 16.1 34.8 27.8 26.7 27.9 40.3 48.1 37.2 26.8
C16∶1 9.4 8.5 10.3 7.4 8.8 5.3 12.5 2.3 10.5 4.9 7.0 3.0
C16∶2 — 7.4 21.6 18.7 0.9 6.9 8.1 10.9 3.6 5.8 12.0 12.3
C16∶3 — 10.8 — — 3.8 8.1 2.0 — 0.9 — — —
C18∶0 33.9 26.8 29.1 25.8 32.9 30.6 35.8 30.3 35.8 37.3 37.9 35.9
C18∶1 — 2.7 — — 2.2 3.0 — — — — — —
C18∶2 15.7 10.8 4.3 21.3 9.1 9.8 3.3 21.0 2.1 1.1 1.1 15.6
C18∶3 7.5 3.1 11.6 7.6 4.9 5.1 9.8 5.3 3.7 — 2.7 4.7
C20∶5 1.6 2.7 0.2 1.0 1.3 2.0 0.2 1.3 2.0 1.2 0.2 1.6
　　注:表中“ —”表示脂肪酸含量极微或未检测出 ,下表同。
由表 2可知 ,藻株 Chlorella spp 的油脂含量受温
度的影响是极其显著的。相同光照强度下 ,在 20 ～
35℃的范围内 ,都呈现出先增大后减小的趋势 ,在
25℃时微藻的油脂含量最高。早期研究报道[ 6 , 19] ,
在极端高温或低温的情况下 ,微藻油脂的合成量会
减少 ,研究指出极端温度下合成受限可能是相关的
酶发生不可逆损伤所致。
在微藻油脂含量最高的培养温度 25℃下 ,藻株
Chlorella spp 亦随光照强度的变化而改变 ,当光照强
度为 3 500 lux 时 ,其油脂含量达到了最大值 , 在
2 500 lux 处的油脂含量也略大于其在4 500 lux处的
油脂含量 。
同时 ,由表 2可知 ,藻株 Chlorella spp 的脂肪酸
组成以C16∶0和 C18∶0为主 ,即以饱和脂肪酸为主 。
随着温度的变化 ,主要脂肪酸的种类不变 ,而含量会
有所增减。随着温度的升高 ,饱和脂肪酸的百分含
量略有减小 ,而不饱和脂肪酸 C16∶2 、C18∶2 、C18∶3
所占的比例则略有增加 。随着光照强度的增加 ,饱
和脂肪酸C16∶0和 C18∶0 的含量均有明显的增加 ,
而不饱和脂肪酸 C18∶2 、C16∶1 、C16∶2 、C16∶3 、C20∶5
等的比例都有减小 , 这与李荷芳等的报道相
一致[ 20] 。
2.3　氮源及其含量对微藻生长 、油脂含量与脂肪酸
组成的影响
氮元素是单细胞微藻生长发育必需的元素之
一 ,微藻通常可以利用铵盐 、硝酸盐及尿素等作为其
氮源。单胞藻虽对这些盐类都能吸收与利用 ,但在
吸收的速度与利用的程度上是有差别的[ 11-12] 。
在该研究中 ,首先选取 NaNO3 和 NH2CONH2 作
为氮源来考察其对小球藻 Chlorella spp生长和油脂
含量 、脂肪酸组成的影响 ,结果如图 3和表 3所示 。
图 3　氮源及其氮含量对小球藻 Chlorella spp
生长的影响
·38· 现代化工 第 28卷增刊(2)
由图 3 可以看出 ,添加氮源的小球藻 Chlorella
spp的平均生长速率均大于不添加氮源的藻液 。以
NaNO3为氮源时 ,小球藻 Chlorella spp的平均生长速
率随着氮含量的增加而减小 ,而在含氮质量浓度为
0.0625 g/L与 0.125 g/L时 ,微藻的平均生长速率基
本相当;以 NH2CONH2 为氮源时 ,小球藻 Chlorella
spp的平均生长速率随着氮含量的增加而先增大后
减小 , 在氮质量浓度为 0.125 g/L 时达到最大值 。
在同一氮含量的条件下 , 小球藻 Chlorella spp 在以
NH2CONH2 为氮源时的生长速率更大 , 这也说明
NH2CONH2是更为适宜的氮源 ,其最适宜的氮质量
浓度为0.125 g/L。
表 3　氮源及其氮含量对小球藻 Chlorella spp 的
油脂含量及脂肪酸组成的影响
脂肪酸
氮源及其氮含量/g·L-1
无添加
氮源
硝酸钠
0.0625
硝酸钠
0.125
硝酸钠
0.25
硝酸钠
0.375
尿素
0.0625
尿素
0.125
尿素
0.25
尿素
0.375
油脂含
　量/%
45.0 42.0 34.0 43.7 28.5 30.3 33.7 24.6 21.4
　
C14∶0 0.7 0.6 0.9 2.6 1.6 1.9 2.5 5.4 8.3
C16∶0 44.5 37.4 41.0 30.2 38.4 33.7 29.5 21.3 46.9
C16∶1 12.2 7.7 5.2 9.4 9.4 9.1 8.9 9.8 11.3
C16∶2 0.1 0.4 0.7 2.9 0.7 3.0 4.3 3.7 0.9
C16∶3 — 8.1 — 1.5 0.7 1.3 1.7 9.2 0.3
C18∶0 12.1 22.2 34.5 28.9 33.1 27.8 24.9 26.7 56.7
C18∶1 0.2 0.2 0.5 4.3 0.9 10.5 10.3 7.7 16.0
C18∶2 29.6 20.9 13.4 12.9 10.6 8.5 13.6 12.6 23.9
C18∶3 0.2 1.0 1.0 2.0 2.6 1.9 2.1 2.1 1.7
C20∶5 0.5 1.5 2.9 5.4 2.1 2.2 2.2 1.7 6.6
由表 3可知 ,在不添加氮源的情况下 ,微藻的油
脂含量均最大 ,且达到了 45%,在曹春晖等[ 21] 关于
小球藻的油脂含量研究中小球藻的油脂含量一般为
8%～ 27%,而该研究出现的高脂肪含量可能正是由
于低氮培养条件造成的脂肪积累现象。
微藻 Chlorella spp以硝酸钠为氮源的油脂含量
均高于以尿素为氮源的油脂含量 ,其中当硝酸钠的
添加质量浓度为 0.25 g/L 时 ,微藻的油脂含量最
高;而添加尿素为氮源的 4 个水平中 ,以添加量为
0.125 g/L 时的油脂含量最高 。故与其适宜的生长
条件相结合 ,选择添加硝酸钠 ,氮质量浓度为 0.25
g/L。
同时 ,由表 3可知 ,藻株 Chlorella spp 的主要脂
肪酸组成为C16∶0 、C18∶2 、C18∶0 、C16∶1。当不添加
氮源时 ,其主要脂肪酸为 C16∶0和 C18∶2 ,两者所占
总脂肪酸的 70%以上;以硝酸钠为氮源时 ,其主要
脂肪酸为 C16∶0和 C18∶0 ,即以饱和脂肪酸为主 ,而
不饱和脂肪酸以 C16∶1 、C18∶2为主;而以尿素为氮
源时 , 其主要脂肪酸亦为 C16∶0 和 C18∶0 , 但其
C18∶0的比例有所下降 ,而不饱和脂肪酸中 C18∶1
所占的比例有所增加。而在所有考察的条件中 ,
C20∶5所占的比例均很小 ,但随着添加氮量的增加
而会略有增加。
3　结论
(1)将微藻生长的最适条件与富集油脂的最佳
条件综合考虑 , Chlorella spp 适宜的培养条件为:温
度25℃、光照强度 3 500 lux 、添加氮源硝酸钠并使其
含氮质量浓度为 0.25 g/L , 此时的油脂含量可达
43.7%。
(2)通过在不同培养条件下对微藻脂肪酸组成
的研究发现 ,培养条件对脂肪酸主要组成成分的种
类没有明显影响 ,但是各个主要组分的百分含量会
随培养条件的改变而有相应的改变 。Chlorella spp
的主要脂肪酸为 C16∶0 、C18∶0 、C18∶2 ,表明小球藻
的主要脂肪酸组成为 C16和 C18脂肪酸。
参考文献
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　　 (下转第 41页)
·39·2008年 10月 齐沛沛等:制备生物柴油用小球藻的油脂富集培养研究
体 ,其分子量在 5万～ 20万之间 ,相当于 200 ～ 1 200
个葡萄糖分子聚合而成。支链淀粉是以 α-1 ,4 糖
苷键连接为主 ,同时还有 2%～ 4%通过 α-1 ,6糖苷
键连接而成的 D-葡萄糖的聚合体 ,其中 α-1 , 4糖
苷键连成的链作主链 ,在主链上通过 α-1 ,6糖苷键
形成众多的侧链。支链淀粉的分子量在 20万 ～ 60
万之间 ,相当于 1 300 ～ 36 000个葡萄糖聚合而成 。
直链淀粉分子和支链淀粉分子的侧链趋向平行
排列 ,相邻羟基间经氢键结合成散射状结晶性“束”
(micelles)的结构 ,称为双螺旋结构 。颗粒中水分子
也参与氢键结合 ,淀粉分子间有的是由水分子氢键
结合 ,水分子介于中间 ,有如架桥。氢键的强度虽然
不高 ,但数量众多 ,结晶束具有一定强度 ,故淀粉具
有较强的颗粒结构。结晶束间区域分子排列没有平
行规律 ,较杂乱 ,为无定形区。支链淀粉分子庞大 ,
串过多个结晶区和无定形区 ,为淀粉颗粒结构起到
骨架作用。淀粉颗粒中结晶区为颗粒体积的
25%～ 50%,其余为无定形区 。结晶区和无定形区
并没有明确的界限 ,变化是渐进的 。
1895年Meyer 最早提出的淀粉颗粒模型 。1969
年Nikuni[ 7]根据直链淀粉是和支链淀粉结合而存在
的设想提 出淀粉 粒的单分 子主张 。 1984 年
Lineback
[ 8]在此基础上进行改进 ,主要是基于支链淀
粉分子为“簇”的概念 ,而直链淀粉则随机或呈螺旋
结构而存在 ,这取决与颗粒中脂类物质 ,因为大多数
谷类淀粉存在着这类物质。而 Ostergetel 和 van
Bruggen[ 9]认为 ,结晶区是由连续的超分子螺旋结构
的支链淀粉组成 ,螺旋结构中有许多空隙 ,可以容纳
直链淀粉分子。尽管直链淀粉的分支有时出现在无
定形区 ,但科学家发现支链之间极易形成双螺旋结
构。1997年 Gallant 等[ 10] 提出淀粉颗粒中有晶体
(坚固的壳体)颗粒状结构物(blocklets),根据不同的
淀粉类型及在颗粒中的定位 ,其直径范围为 20 ～
500 nm ,这种结构与半晶体(软壳体)小颗粒状结构
物(20 ～ 50 nm)交替出现。小颗粒(约 9 nm 厚)又由
交替出现的晶型和非晶型层组成。
笔者认为 ,淀粉颗粒内存在两种组成及性质不
同的能量结构 ,一种是淀粉分子链间通过氢键形成
的链链能量结构 ,另外一种是淀粉分子链和水分子
间通过氢键形成的链水结晶结构 ,它们在 X射线衍
射曲线上对应着不同的衍射峰。这对 DSC 曲线上
出现的双峰熔融现象作出很好的解释。当淀粉颗粒
含水量在平衡水分以下时 ,随着含水量的改变 ,链链
衍射晶峰的强度和面积基本保持不变 ,而链水衍射
晶峰的强度和面积则随着含水量的增减而增减。另
外当淀粉颗粒分散在常温水分散系中时含水量在平
衡水分以上时 ,尽管只发生了轻度的可逆溶胀 ,其分
子团簇的能量结构性质发生了根本性质变化 ,导致
但淀粉颗粒原有的结晶结构已收到很大程度的破
坏 ,而且这种破坏作用对链链结晶结构和链水结晶
结构的影响基本上是一致的。因此如果在特定的酶
作用而无势垒的情况下可以进行常温下的水解。
　　(上接第 39页)
[ 8] Seto A ,Wang H L , Hesseltine C W , et al.Culture conditions affect e-
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·41·2008年 10月 刘锦超等:红薯淀粉浆在水解过程中的黏度