全 文 ：第 28卷　第 2期 海 洋 环 境 科 学 Vol.2 8 , No.2
2 0 0 9 年 4 月 MARINEENVIRONMENTALSCIENCE Apr. 2 0 0 9
NiO纳米颗粒对小球藻(Chlorelasp.)
细胞胁迫性的研究＊
李永仙 ,冯　威 ,巩　宁 ,孙野青 ,熊德琪
(大连海事大学 环境科学与工程学院 ,辽宁大连 116026)
摘　要:从小球藻生长及细胞微观结构方面对比研究了纳米 NiO与 Ni2+对小球藻(Chlorelasp.)的胁迫性。结果表明概率
单位法计算得纳米 NiO对小球藻 96hEC50为 31.4mg/L,而 Ni2+对小球藻 96hEC50为 1.73mg/L,利用扫描电子显微镜 、透
射电子显微镜研究了受纳米 NiO和 Ni2+胁迫前后小球藻细胞微观结构变化 ,结果表明 ,受Ni2+胁迫的小球藻多数出现细胞
缩小 、变形 、细胞器损坏 、空泡等细胞凋亡现象 ,而受纳米 NiO胁迫的细胞则部分表现细胞凋亡现象 ,表明 Ni2+对小球藻的
毒性远大于纳米 NiO。
关键词:NiO纳米颗粒;胁迫性;细胞形貌
中图分类号:Q945.78　　文献标识码:A　　文章编号:1007-6336(2009)02-0151-03
StudyofinhabitationofNiOnanoparticlestoChlorelasp.
LIYong-xian, FENGWei, GONGNing, SUNYe-qing, XIONGDe-qi
(ColegeofEnvironmentalScienceandEngineering, DalianMaritimeUniversity, Dalian116026, China)
Abstract:Thegrowthconditionandmicro-morphologywerestudiedtorevealtheinhibitionofNiOnanoparticlestoChlorelasp.by
contrastwithNi2+.TheEC50 valueofNiOnanoparticlestoChlorelasp.at96hwas31.4mg/Lbytheprobabilityunitmethod, but
theEC50 valueofNi2+was1.73mg/linthesamecondition.Thecelmicro-morphologyofChlorelasp.inhibitedbyNiOandNi2+
wereobserveredbyScanningElectronMicroscopy(SEM)andTransimisionElectronMicroscopy(TEM).Itshowedthatthecelof
Chlorelasp.inhibitedbyNi2+wasshrinked, distoredandthecelorganwasdestroyed.However, theoneinhibitedbyNiOpartly
showedaphenomenonofthecellanguishment.TheresultshowedthatNi2+wasfarmoretoxicthanNiOnanoparticles.
Keywords:NiOnanoparticles;inhibition;celmorphology
　　纳米微粒由于其巨大的比表面积 、量子尺寸效应 、小
尺寸效应及宏观量子隧道效应等特征而表现出与其它物
质截然不同的特性。这些特性使纳米科学已经成为当今
世界上的三大支柱科学(生命科学 、信息科学 、纳米科学)
之一 [ 1] 。纳米材料目前已经应用于染料 、涂料 、医药诊断
等传统产业中。但是 , 纳米科技在广泛应用的同时 , 游离
的纳米颗粒和纳米管可能会穿透生物细胞 , 产生毒性。
纳米尺度的物质与常规物质有很大的差异 , 因此纳米物
质对人类健康与自然环境的潜在的危害成为关系到人类
健康和生态健康的有待探索的新领域。
纳米 NiO作为一种功能材料 ,主要用作燃油催化剂 、
磁性材料 、和电子元件等 [ 2] 。近年来 , 我国沿海发达地区
临港 、临岸工业迅速发展 , 大型船舶修造企业产生的尾气
中含有大量的纳米 NiO粒子 , 进入水体后通过食物链造
成海洋环境的 NiO纳米污染。在海洋环境中 , 藻类作为
其它浮游动物的食物及氧气来源占据着重要位置 , 以海
藻为受试物研究重金属的生物毒性作用在国内外已被广
泛关注。本文选取小球藻 (Chlorelasp.)作为研究对象 ,
对比研究了纳米 NiO和 Ni2+对小球藻的生长情况和细胞
变化的影响 , 并以此确定纳米 NiO对小球藻的胁迫性。
1　试验材料及方法
1.1　试剂及仪器
Ni(NO3)2· 6H2O、尿素 、聚乙二醇和乙醇。均为分
＊ 收稿日期:2007-04-27,修订日期:2007-07-18
　基金项目:国家自然科学基金资助项目 (40476046 /D0608);交通部基础研究项目(2007329225040)
　作者简介:李永仙 (1982-),女 ,山西省太原市人 ,硕士研究生,主要从事环境污染控制工程方面的研究。
152　 海　洋　环　境　科　学 第 28卷
析纯;恒温水浴锅(HH-51型)、恒速搅拌器(DW-1型)、过
滤装置 、数控电烘箱(AB104-N型)、马弗炉(KSJ-10-11
型)、光照培养箱(MGC-BP型)、紫外-可见分光光度计
(JASCOV-550型)、扫描电子显微镜(JEM-2000FX型)、透
射电子显微镜(H-800型), X射线衍射仪(7000S/L型)。
1.2　小球藻(Chlorellasp.)的培养
藻种来源于国家海洋环境监测中心。经煮沸 、冷却 、
过滤后的海水作为培养液 , 用 f/2营养盐(1L海水中加 1
mL),在 250 mL的锥形瓶中接种 100 mL, 于恒温光照培
养箱中进行自养培养 , 定时摇晃瓶 , 培养条件为:光暗比
为 12h∶12 h, 光照强度为 4 000 lx, 培养温度为(23 ±
1)℃。每隔 24 h用紫外分光光度计(UV-vis)于 540 nm
处测定吸光度值。
1.3　均匀沉淀法制备纳米 NiO
配置尿素与硝酸镍的摩尔比为 1∶4的溶液 , 混合搅
拌并加热到一定温度(90℃),反应一定的时间(10h),离
心分离出前驱体 Ni(OH)2 ,并将其洗涤(用乙醇)至中性 ,
在温度为 70℃下干燥 12 h, 最后将其前体置于马弗炉中 ,
在特定温度下(400 ℃)煅烧 1 h即得纳米 NiO[ 3] , 粒径大
小约为 20nm。
1.4　纳米 NiO悬浊液的配制
向一定量的去离子水中加入制备好的纳米 NiO粉
末 , 进行超声分离 , 使之充分均匀分散到水中 , 用 GB/T
11910-1989对 Ni浓度进行了标定 [ 4] 。配制了浓度为2.19
g/L的纳米 NiO悬浊液。
1.5　纳米 NiO对小球藻的生物胁迫性研究
将上述配制好的纳米 NiO悬浊液按 0、0.8、1.4、2.0、
2.6mL分别加入到 100mL处于对数生长期的藻液中 ,每
隔 24h测定一次吸光度。
为了与 NiO纳米颗粒的胁迫性做对比 , 配制 0.2 g/L
的硝酸镍水溶液 , 并将配制好的硝酸镍溶液按 0、 0.5、
1.0、 1.5、2.0 mL分别加入到 100 mL处于对数生长期的
藻液中 , 每隔 24 h测定一次吸光度。
1.6 　小球藻生长抑制率的计算 [ 5]
半数致死浓度 EC
50
采用概率单位法求得。
2　结果及讨论
2.1　纳米 NiO的表征
图 1为纳米 NiO的 TEM照片 , 由图可见 ,制得的纳米
NiO粒子呈球状 ,分散性较好 , 平均粒径在 20 nm左右 ,选
区电子衍射结果表明制备的 NiO纳米粒子呈多晶状态。
插图中 XRD的测试结果表明制备的 NiO为纯相的 NiO,
根据布拉格公式计算得晶粒尺寸约为 20 nm, 与 TEM结
果相一致。
2.2　纳米 NiO及 Ni2+对小球藻生长情况的影响
图 2为纳米 NiO不同浓度对小球藻的生长情况的影
响 , 由图可见随着纳米 NiO浓度的增加 ,对小球藻生长的
抑制程度不断增加。在抑制作用的初期(t<48 h), 不同
纳米 NiO浓度对小球藻的胁迫作用差别不大 , 随着生长
时间的延长 , 抑制作用差别明显。 NiO的加入量对小球藻
的生长影响较大 ,随着加入量的增大 , 小球藻的生长越缓
慢。当浓度为 18mg/L时 ,小球藻只是受到比较弱的抑制
作用 , 抑制率为 15.8 %,当浓度达到 57 mg/L时 , 小球藻
的生长基本停滞 , 抑制率达 83 %。用概率单位法计算
NiO纳米粒子对小球藻 96 hEC50为 31.4 mg/L。
图 3为 Ni2+不同浓度对小球藻生长情况的影响。当
第 2期 李永仙 ,等:NiO纳米颗粒对小球藻(Chlorellasp.)细胞胁迫性的研究 153　
Ni2+浓度为 1mg/L时 , 对小球藻的生长影响很小 , 随着浓
度的增加 , Ni2+对小球藻的抑制作用明显。 Ni2+浓度为
2.0 mg/L时 , 小球藻的生长明显受到抑制 , 抑制率达
80 %, 并且在第 4～ 5 d生物量有所下降 , 说明 Ni2+对小
球藻的抑制作用主要在此阶段发生 , 之后趋于平缓。用
概率单位法计算 Ni2+对小球藻 96 hEC50为 1.73 mg/L。
比较可知 , Ni2+对小球藻的抑制性要大于纳米 NiO, 毒性
也强于纳米 NiO。
2.3　小球藻的形貌变化
图 4为不同条件下小球藻的 SEM影像 , 梯度脱水的
处理过程使小球藻细胞出现了凹陷的现象。从图 4a可以
看出 , 空白对照组的小球藻细胞表面光滑饱满 ,细胞生长
状态良好。吸附纳米 NiO后(图 4b), 细胞的体积由原来
的 4 μm减小到了 2 μm左右 ,同时细胞表面出现剧烈皱
变 , 生长受到抑制 , 这主要是由于小球藻受到胁迫后 , 支
撑细胞的细胞器流失所致。吸附 Ni2+的小球藻细胞体积
同样缩小至 2 μm左右 , 细胞外形变化显著 ,出现了空泡 、
内陷等细胞凋亡现象(图 4c)。这与重金属离子与细胞间
发生的络合 、鳌合及离子交换作用等改变了细胞的渗透
压 , 导致细胞微观结构畸变有关 [ 6] 。
图 4　不同条件下小球藻 96 h的 SEM影像
Fig.4SEMimagesofChlorelasp.at96 h
a:空白对照组;b:受 cNi=31.4mg/LNiO胁迫的小球藻;c:受 cNi2+=2.0mg/LNi2+胁迫的小球藻
　　图 5是不同条件下小球藻的 TEM影像。从空白对
照组可以清晰地看到小球藻细胞的纤毛 、细胞壁以及细
胞核 、叶绿体等细胞器 ,细胞结构完整(图 5a)。吸附纳
米 NiO或 Ni2+的小球藻 , 其细胞壁出现了不同程度的皱
褶 ,受试细胞普遍发生缩小和形变 , 细胞壁脱离 , 细胞核
损坏 ,甚至缺失 , 细胞质流失。 相比较而言 , 吸附 NiO的
小球藻细胞少量是处于分裂期 , 这可能是处于分裂期的
细胞对 NiO纳米颗粒抗性较强 , 才使其能保持相对较完
整的细胞结构(图 5b), 而吸附 Ni2+的小球藻未观察到
处于分裂期的细胞 , 其变形较严重 , 都发生了不同程度
的畸变 , 细胞破碎 , 细胞器模糊不清(图 5c)。 说明 Ni2+
对小球藻的毒性远大于 NiO纳米粒子的毒性 , 这与前述
的结果是一致的。
图 5　不同条件下小球藻 96h的 TEM影像
Fig.5 TEMimagesofChlorellasp.at96 h
a:空白对照组;b:受 cNi=31mg/LNiO胁迫的小球藻;c:受 cNi2+=2.0mg/LNi2+胁迫的小球藻
(下转第 163页)
第 2期 吕　达 , 等:上海崇明岛沉积物重金属污染的磁学研究 163　
大量样品的重金属含量以及磁性特征的分析 , 探讨了应
用磁测量技术研究沉积物重金属污染的可行性 , 主要得
出以下结论:
(1)上海崇明岛沉积物中重金属 Pb、Cr、Cu、Zn的污
染 , 用地质积累指数 Igeo法评价 ,一般介于轻度污染和偏
中度污染之间。
(2)上海崇明岛沉积物中 ,除了瀛南以不完整的反铁
磁性矿物主导外 , 其余各点均以亚铁磁性矿物主导样品
的磁性特征 , 其中亚铁磁性矿物晶粒以假单畴-较粗的多
畴晶粒为主 , 并且还存在着一定量的超顺磁晶粒。
(3)通过重金属和磁参数的相关性分析 ,表明重金属
与磁性参数存在密切的相关性 , 因此磁性测量可作为沉
积物重金属污染记录信息提取的辅助手段 , 但不同的磁
性参数对重金属的指示程度不同 , 由于本研究中以较粗
的多畴亚铁磁性矿物为主 , 同时 χ、χARM/ SIRM对重金属
元素含量变化比较敏感 , 因而 χ、χARM/ SIRM可作为重金
属含量的替代指标。
(4)在重金属元素和磁性参数相关性的基础上建立
了磁诊断线性回归模型。
参考文献:
[ 1] NEDWELLDB, TAFFAELLIDG.Advancesinecologicalre-
search:Estuaries[ M] .London:AcademicPress, 1999.
[ 2] OLDFIELDF.Environmentalmagnetismapersonalperspective
[ J] .QuatSciRev, 1991, 10:73-85.
[ 3] SCOULLOSM, OLDFIELDF, THOMPSONR.Magneticmo-
nitoringofmarineparticulatepolutionintheElefsisGulf,
Greece[ J].MarPollutBul, 1979, 10:287-291.
[ 4] HUNTA, JONESJM, OLDFIELDF.Magneticmeasurements
andheavymetalsinatmosphericparticulatesofanthro-pogenic
origin[ J] .PhysEarthPlanetInt, 1984, 33:129-139.
[ 5] WILLIAMSTM.Asedimentaryrecordofthedepositionofheavy
metalsandmagneticoxidesintheLochDeebasin[ J] .TheHol-
ocene, 1991, 1(2):142-150.
[ 6] HUTCHINSONSM.Themagneticrecordofparticulatepolu-
tioninsaltmarshDeeEstuary[ J] .TheHolocene, 1993, 3(4):
342-350.
[ 7] PLATERAJ, RIDGWAYJ, APPLEBYPG, etal.Historical
contaminantfluxesintheTeesEstuary[ J] .MarPolutBul,
1998:37(3-7):343-360.
[ 8] OLDFIELDF, YUL.Theinfluenceofparticlesizevariations
onthemagneticpropertiesofsedimentsfromthenorth-easternI-
rishSea[ J] .Sedimentology, 1994, 41:1093-1108.
[ 9] MULLERG.IndexofgeoaccumulationinsedimentsoftheRhine
River[ J] .geojournal, 1969, 2(3):108-118.
[ 10] 腾彦国 ,庹先国 , 倪师军 , 等.应用地质累计指数评价沉积
物中重金属污染:选择地球化学背景的影响 [ J].环境科学
与技术 , 2002, 25(2):7-9.
[ 11] 许世远 ,陶 静 ,陈振楼 , 等.上海潮滩沉积物重金属的动力
学累积特征 [ J] .海洋与湖沼 , 1997, 28(5):509-515.
[ 12] MAHERBA.Magneticpropertiesofsomesyntheticsubmicron
magnetites[J].Geophys, 1988, 94:83-96.
[ 13] OLDFIELDF, YUL.Theinfluenceofparticlesizevariations
onthemagneticpropertiesofsedimentsfromthenorth-easternI-
rishSea[ J] .Sedimentology, 1994 , 41:1093-1108.
[ 14] 张卫国 ,俞立中.长江口潮滩沉积物的磁学性质及其与粒度
的关系 [ J] .中国科学 , 2002, 32(9):783-790.
(上接第 153页)
3　结　论
通过纳米 NiO与 Ni2+对小球藻的毒性试验相比较 ,
纳米 NiO对小球藻 96hEC50为 31.4 mg/L, 而 Ni2+对小球
藻 96hEC50为 1.73 mg/L,表明纳米 NiO对小球藻的毒性
远小于 Ni2+。
由于 Ni2+与小球藻细胞间存在络合 、鳌合及离子交
换作用 , 使得受迫细胞出现严重的细胞畸变和细胞致死
现象。与 Ni2+相比 , 由于 NiO纳米粒子中镍原子与氧原
子结合 , 其与细胞间的相互作用存在明显不同。与纳米
粒子特性相关的毒性机制将成为下一步的研究重点。
参考文献:
[ 1] 汪 冰 ,丰伟悦 ,赵宇亮 ,等.纳米材料生物效应及其毒理学研
究进展 [ J] .中国科学· B辑:化学 , 2005, 35(1):1-10.
[ 2] 杨建湘 ,李朝晖 ,高德淑 ,等.纳米NiO的制备和表征 [ J] .精
细化工中间体 , 2003, 33(6):53-55.
[ 3] 郭广生 ,郑东华 , 王志华 ,等.均匀沉淀法制备纳米 NiO[ J].
北京化工大学学报 , 2004, 31(3):74-76.
[ 4] GB/T11910-1989.水质 镍的测定丁二酮肟分光光度法[ S] .
[ 5] 高 会 ,张硕慧 ,熊德琪 ,等.苯酚 、苯胺对两种海洋生物的急
性毒性研究 [ J] .海洋环境科学 , 2006, 25(1):33-36.
[ 6] 何宝燕 ,尹华 ,彭辉 ,等.酵母菌吸附重金属铬的生理代谢机理
及细胞形貌分析 [ J].环境科学, 2007, 28(1):194-198.