全 文 ：摘 要:通过摇瓶实验研究了影响小球藻异养生长和叶黄素合成的 6个重要因子:接种量、通气量以及葡萄糖、KNO3、KH2PO4
和 MgSO4的起始浓度,并通过均匀设计实验建立了4种主要培养基组分浓度对细胞生长和叶黄素合成量影响的数学模型。
研究表明:在摇瓶实验中,培养液装量少或转速快有利于小球藻细胞生长和叶黄素合成,因此充足的通气量是必要条件;在
10～60g·L-1范围内,较高的葡萄糖起始浓度可提高小球藻的最终生物量和叶黄素产量,但抑制小球藻的细胞生长;在 2∶1～
12∶1范围内,较低的C∶N比有利于细胞中叶黄素含量的增加,而对小球藻细胞生长的影响较小。通过建立数学模型、对上述
参数进行优化,小球藻的比生长速率和细胞中叶黄素含量得到了显著提高,最大比生长速率和细胞中叶黄素含量分别达到
2.32d-1和3.18mg·L-1。
关键词:小球藻;异养培养;叶黄素;均匀设计;优化
中图分类号:TS2 文献标识码:A
OptimizationofCultureParametersforHeterotrophic
CultivationofChlorelapyrenoidosaandLuteinProduction
WUZheng-yun,QUChun-bo,SHIXian-ming
(DepartmentofFoodScienceandTechnology,BorLuhFoodSafetyCenter,
ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai201101,China)
Abstract:Theefectsofsixcultureparametersincludinginocula,aeration,initialconcentrationsofglucose,KNO3,KH2PO4and
MgSO4onboththeheterotrophicgrowthofChlorelapyrenoidosaandluteinproductionwereinvestigatedbasedonflaskexperi-
ments.Mathematicmodelsweredevelopedbymeansofuniformdesigntodescribetheefectsoffourmediumcomponentsoncel
growthandcelularluteincontent.Itwasfoundthatlowermediumvolumeorhigheragitationrateinflaskexperimentsfavoredboth
celgrowthandluteinformation,whichmeansthatsuficientaerationisthenecessity.Intherangebetween10~60g·L-1,higher
initialconcentrationofglucoseresultedinhigherfinalbiomassconcentrationandluteinyield,butinhibitedthecelgrowth.Inthe
rangebetween2∶1~12∶1,lowerC∶Nratioincreasedcelularluteincontentbuthadlessefectsonthecelgrowth.Significanteleva-
tionsofthespecificgrowthrateofChlorelaandcelularluteincontentwereobtainedbymodel-basedoptimization.Thehighest
specificgrowthrateandcelularluteincontentatainedas2.32d-1and3.18mg·L-1,respectively.
Keywords:Chlorelapyrenoidosa;heterotrophiccultivation;lutein;uniformdesign;optimization
小球藻（Chlorela）是一种含有多种营养成分的单细胞微藻，尤以富含叶黄素（lutein）而受到关注[1，2]。叶
黄素不仅是一种重要的天然色素，而且在某些疾病如年龄相关性视黄斑退化、心血管疾病和肿瘤等的防治
方面有显著效果[3]。
收稿日期:2006-08-14
基金项目:国家863计划资助项目(2006AA02Z226)
作者简介:吴正云（1970-),男，湖北宜昌人，工程师，博士生，研究方向：食品生物技术，E-mail:wzy5607@sina.com；史贤明为本文通讯作者，
E-mail：xmshi@sjtu.edu.cn
文章编号:1671-9964(2007)01-0006-06
小球藻异养生长及叶黄素合成量
影响因子的优化研究
吴正云,曲春波,史贤明
（ 上海交通大学 食品科学与工程系，陆伯勋食品安全研究中心，上海 201101）
上海交通大学学报(农业科学版)
JOURNALOFSHANGHAIJIAOTONGUNIVERSITY(AGRICULTURALSCIENCE)
Vol.25No.1
Feb.2007
第25卷 第1期
2007年2月
第 1期
小球藻规模培养的传统方式为开放光合自养，该培养方式存在光照限制、易污染和占地面积大等问
题，因而生产效率不高，而异养培养则可有效克服上述缺点[4，5]。在建立小球藻异养培养系统的过程中，环
境因子和培养基组分的优化是十分重要的方面。为此，本文对小球藻异养生长和叶黄素含量的6个重要影
响因子进行了优化研究。
1 材料与方法
1.1 藻株与培养条件
小球藻藻株为Chlorelapyrenoidosa15-2070。所用培养基为改进的 Basal培养基[6]。除文中另外指出
外，均添加40g·L-1葡萄糖和7g·L-1KNO3。培养条件为：250mL三角瓶，培养基装量50mL，摇床转速
180r·min-1，接种量 10%(V/V)，pH6.1，28℃黑暗条件下培养。每个试验条件均进行3次重复。
1.2 测定方法
小球藻生物量用细胞干重法测定[6]，葡萄糖浓度用二硝基水杨酸法（DNS)测定[7]，KNO3浓度的测定采
用酚二磺酸法[8]，小球藻中的叶黄素采用甲醇提取后用高效液相法测定[9]。叶黄素标准品购自美国Sigma公
司。
1.3 数据分析
动力学模型参数通过四阶龙格-库塔算法（thefourthorderRunge-Kutaalgorithm）结合单纯形（Sim-
plex-Search）优化进行估计，模拟分析采用四阶龙格-库塔算法，使用Matlab6.5软件进行。统计和回归分
析采用SAS8.0软件。
2 结果与分析
2.1 接种量及通气量对小球藻生长和叶黄素合成的影响
接种量在0.5%至 25%(V/V)的范围内，小球藻的细胞生长随接种量的提高而加快，当接种量低于
5%时细胞生长存在明显延迟（图1a）。不同接种量的叶黄素细胞含量和总量见图1b，经Q检验，不同接
种量分别对细胞中叶黄素含量和培养液中叶黄素产量的影响不明显（p>0.05）。
在250mL三角瓶中分别加入50、100和150mL培养基，摇床转速为150r·min-1和180r·min-12
组。结果显示，较少的培养基装量和高的转速对细胞生长、细胞的叶黄素含量和产量的提高均有利（图2），
这表明小球藻生长和叶黄素积累均要求足够的通气量。
2.2 主要培养基组分浓度对小球藻生长和叶黄素合成量的影响
图1在不同接种量时小球藻的生长曲线及叶黄素合成量
Fig.1GrowthofC.pyrenoidosaandluteinproductionwithvariousinocula
注:a,▲,0.5%;△,2.5%;■,5%;□,10%;●,15%;○,25%;b,黑,细胞的叶黄素含量(blackbarsshowcelularluteincontent);
白,叶黄素产量(whitebarsshowluteinyield)
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1 5 10 20 25 50
接种量Inocula/%
吴正云，等:小球藻异养生长及叶黄素合成量影响因子的优化研究 7
上海交通大学学报(农业科学版) 第 25卷
葡萄糖起始浓度为10~60g·L-1的实验结果（添加10g·L-1的KNO3以避免氮源限制）显示，随着葡萄
糖起始浓度的增加，小球藻的最终生物量和叶黄素产量提高，但小球藻的细胞生长减慢，同时细胞中叶黄
素含量也降低(图3)。这表明较高起始浓度的葡萄糖可以提高最终生物量和叶黄素产量，但对小球藻的细
胞生长和叶黄素的积累存在一定的抑制作用。
KNO3起始浓度在0.5~25g·L-1范围内对小球藻生长和叶黄素合成量均有明显影响。KNO3浓度为0.5和
1g·L-1时的最终生物量偏低，显示氮源的不足限制了小球藻的生长(图4a)。当KNO3起始浓度高于10g·L-1
时，细胞生长随KNO3浓度的提高而减慢，表明较高的KNO3起始浓度对细胞生长的抑制作用(图4a)。细胞的
叶黄素含量和产量均在起始KNO3浓度为10g·L-1时达到最高，而当KNO3起始浓度较低使细胞生长受到限
制时，叶黄素的合成量则明显减少(图4b)。
图2 不同培养基装量和摇床转速下小球藻的生长和叶黄素合成量
Fig.2GrowthofC.pyrenoidosaandluteinproductionwithvariousmediumvolumeandshakingspeed
注:a,▲,50mL/180r·min-1;△,100mL/180r·min-1;■,150mL/180r·min-1;□,50mL/150r·min-1;●,100mL/150r·min-1;
○,150mL/150r·min-1;黑,细胞的叶黄素含量(blackbarsshowcelularluteincontent);白,叶黄素产量(whitebarsshowluteinyield)
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50/180100/180150/18050/150100/150150/150
培养基装量 (mL)/转速 (r·min-1)
Volumeofmedium(mL)/shakingspeed(r·min-1)
图3 不同葡萄糖起始浓度下小球藻的生长和叶黄素合成量
Fig.3GrowthofC.protothecoidesandluteinproductionwithvariousinitialglucoseconcentrations
注:a,▲,10g·L-1;△,20g·L-1;■,30g·L-1;□,40g·L-1;●,50g·L-1;○,60g·L-1;黑,细胞的叶黄素含量
(blackbarsshowcelularluteincontent);白,叶黄素产量(whitebarsshowluteinyield)
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a b
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10 20 30 40 50 60
葡萄糖浓度 Glucoseconcentration/(g·L-1)
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图4 不同KNO3起始浓度下小球藻的生长和叶黄素合成量
Fig.4GrowthofC.protothecoidesandluteinproductionwithvariousinitialKNO3concentrations
注:a,▲,0.5g·L-1;△,1g·L-1;■,4g·L-1;□,10g·L-1;●,20g·L-1;○,25g·L-1;黑,细胞的叶黄素含量
(blackbarsshowcelularluteincontent);白,叶黄素产量(whitebarsshowluteinyield)
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0.5 1 5 10 20 25
KNO3浓度 KNO3concentration/(g·L-1)
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第 1期
KH2PO4和MgSO4起始浓度在0.25~8g·L-1范围内对小球藻生长均无明显影响（详细结果略）。不同
KH2PO4起始浓度下细胞的叶黄素含量及产量见图 5a，Q检验显示叶黄素产量之间的差异不显著（P>
0.05），而细胞的叶黄素含量则随KH2PO4起始浓度的提高略有降低（P<0.05）。由图5b可见，不同的MgSO4
起始浓度对细胞的叶黄素含量及产量均无明显影响（P>0.05）。
2.3 主要培养基组分的均匀设计试验及数学模型
为进一步研究主要培养基组分浓度对小球藻生长和叶黄素合成量的影响及其交互作用，进行了4因
素6水平 (12拟水平)的均匀设计试验。试验因素和水平见表1。
表1 均匀设计试验因素和水平
Table1Thefactor-levelsofuniformdesignexperiments
试验设计及结果见表2。表中的最大比生长速率μm及最高生物量Xm通过用 Logistic模型对试验数
据进行拟合而得到。
(1)
式中X为生物量 (g·L-1)，t为培养时间(d)。
表2 均匀设计U12*(1210)及试验结果
Table2TheresultsofuniformdesignU12*(1210)experiments
注:NG-无生长;Note:NG-Nogrowth
1 1 6 2 4 2.26 43.59 0.85
2 2 6 3 1 1.83 8.59 0.79
3 3 5 5 4 1.44 11.86 0.65
4 4 5 6 1 1.24 14.69 0.92
5 5 4 1 5 1.11 18.16 1.17
6 6 4 3 2 0.94 20.84 0.67
7 1 3 4 5 2.27 4.51 1.10
8 2 3 6 2 1.17 8.79 1.89
9 3 2 1 6 1.46 11.67 2.14
10 4 2 2 3 1.21 14.00 2.88
11 5 1 4 6 0.56 21.16 1.82
12 6 1 5 3 NG NG NG
实验序号
Exp.No.
因子Factor
μm/d-1 Xm/(g·L-1)
细胞的叶黄素含量
Celularluteincontent/(mg·g-1)x1 x2 x3 x4
因子
Factorxi
因子描述
Factordescription
水平Level
1 2 3 4 5 6
x1
葡萄糖浓度
Glucoseconcentration/(g·L-1) 10 20 30 40 50 60
x2 C∶N比 C∶Nratio 2∶1 4∶1 6∶1 8∶1 10∶1 12∶1
x3
KH2PO4浓度
KH2PO4concentration/(g·L-1)
0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2
x4
MgSO4浓度
MgSO4concentration/(g·L-1)
0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.2
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0.25 0.5 1 2 4 8
KH2PO4浓度 KH2PO4concentration/(g·L-1)
b4
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0
0.25 0.5 1 2 4 8
MgSO4浓度 MgSO4concentration/(g·L-1)
图5 KH2PO4(a)和MgSO4(b)不同起始浓度下的叶黄素合成量
Fig.5LuteinproductionwithvariousinitialconcentrationsofKH2PO4(a)andMgSO4(b)
注:黑,细胞的叶黄素含量(blackbarsshowcelularluteincontent);白,叶黄素产量(whitebarsshowluteinyield)
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吴正云，等:小球藻异养生长及叶黄素合成量影响因子的优化研究 9
上海交通大学学报(农业科学版) 第 25卷
对μm及 Xm进行线性回归，对细胞的叶黄素含量进行逐步回归，得到方程以下方程：
μm=2.47209-0.28707x1+0.04621x2-0.04847x3-0.02406x4 (2)
r2=0.9335
Xm=-0.73989+3.45079x1-0.03640x2+0.31401x3+0.32432x4 (3)
r2=0.9912
细胞的叶黄素含量 =3.87746-0.46454x2-0.04687x3x4-0.02253x12 (4)
r2=0.8521
由方程（2）及（3）中的系数看，影响小球藻生长的主要因素为葡萄糖浓度。随葡萄糖起始浓度的提高，
小球藻的最终生物量增加而比生长速率减小。由方程（4）中的系数看,影响细胞的叶黄素含量的主要因素
为 C∶N比，细胞的叶黄素含量随C∶N比增加而减少。此外，在方程（4）中x12项的系数虽然相对较小，但由
于其以二次方的形式出现且x1的取值范围在1～6之间，提示在葡萄糖浓度较高时可能会明显减少细胞的
叶黄素含量。
2.4 优化与验证
基于方程(2)(4)，对各指标进行优化计算（叶黄素产量=Xm×细胞的叶黄素含量），结果见表3。由计算结
果可见，采用较低的葡萄糖起始浓度可提高比生长速率和细胞的叶黄素含量，但二者对C∶N比的要求相
反；要达到较高的最终生物量和叶黄素产量，则需要采用较高的葡萄糖起始浓度和较低的C∶N比（即相对
较高的氮源浓度）。
表3 对各优化指标的计算结果
Table3Thecalculatedresultsfordiferentoptimizationobjects
为分析以上优化方案的可行性，将相应
的因素水平编码分别代入方程（2）和（3）计
算μm及 Xm，然后用Logistic模型（1）进行模
拟计算（图6）。模拟结果显示，对比生长速率
μm和细胞的叶黄素含量的优化方案是可行
的，在此方案下2d左右时间可达到最高生
物量；但对最高生物量Xm和叶黄素产量的
优化方案则会造成细胞生长缓慢，因而缺乏
实际意义。对前2种方案进行实验验证，小
球藻的最大比生长速率和细胞的叶黄素含
量平均值分别为2.32d-1和3.18mg·L-1，与
理论计算结果接近。
3 讨论
3.1 培养液中葡萄糖起始浓度和C∶N比是影响小球藻细胞生长和叶黄素合成量的重要因素。本研究表
优化指标
Optimizationobject
水平编码 Codedlevel 理论值
Theoreticalvaluex1 x2 x3 x4
μm/d-1 1 6 1 1 2.39
Xm/(g·L-1) 6 1 6 6 23.76
细胞的叶黄素含量
Celularluteincontent/(mg·g-1) 1 1 1 1 3.34
叶黄素产量
luteinyield/(mg·L-1) 6 1 1 6 98.21
图6小球藻在不同优化方案下的生长曲线
注:实线,最大μm;短虚线,最大Xm;点划线,最
高的细胞中叶黄素含量;长虚线,最大叶黄素产量
Fig.6GrowthofC.protothecoideswithdiferentoptimalschemes
Note:Solidline,forthehighestμm;dotline,forthehighestXm;dot-dashedline,
forthehighestcelularluteincontent;dashline,forthehighestluteinyield
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第 1期
明，起始葡萄糖浓度的增加可提高小球藻的最终生物量和叶黄素产量，但抑制小球藻的细胞生长。
通常认为，氮源限制（即高C∶N比）有利于类胡萝卜素的积累[10~12]。但本研究显示C∶N比的提高（即氮
源限制）减少了小球藻叶黄素的合成量，这与文献[13]中的报道结果相似。最近 DelCampo等对虾青素和叶
黄素在 Chlorelazofingiensis中积累的比较研究显示，氮源限制在增加虾青素积累的同时减少了细胞中的
叶黄素含量，提示不同的类胡萝卜素在合成调控机制上可能有所不同[14]。
3.2 通气量和葡萄糖浓度对小球藻比生长速率和细胞的叶黄素含量的影响趋势大体相同，即有利于提高
小球藻比生长速率的条件也同时有利于增加细胞的叶黄素含量，这可能是由于叶黄素为初级类胡萝卜素
（primarycarotenoids）[15]，其合成在很大程度上与细胞生长相关。
3.3 在分批培养中，通过培养基组成的优化可在一定程度上提高小球藻的比生长速率和细胞的叶黄素含
量，但要提高生物量和叶黄素产量则比较困难，因为葡萄糖和氮源起始浓度的提高会严重抑制小球藻的细
胞生长从而降低生产效率。因此，通过流加培养方式，在培养过程中维持较低的底物浓度和较高的底物总
量，可能是解决这一问题的最佳途径。
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