全 文 ：十六烷基三甲基氯化铵抑制小球藻生长的效应及作用
机制
许银1 ,葛飞1＊ ,陶能国2 ,朱润良1 ,王娜1
(1.湘潭大学环境科学与工程系 ,湘潭 411105;2.湘潭大学生物工程系 ,湘潭 411105)
摘要:以普通小球藻为受试生物 , 采用批量培养方法研究了阳离子表面活性剂十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)的抑藻效应 , 通
过营养元素吸收 、Zeta电位 、酸性磷酸酶和亚显微结构的测定探讨了其作用机制.结果表明 , CTAC 浓度在 0.1 ～ 1 mg L范围内
随浓度升高对小球藻的抑制作用增强 , 96 h 抑制小球藻生长的半效应浓度(96 h-EC50)为 0.18 mg L.0.3 mg L CTAC 作用 8 d
后 , 对小球藻生物量的抑制率为 70.7%, 对氮和铁单位吸收量的抑制率分别为 83.9%和 86.2%, 藻细胞 Zeta电位从-12.5
mV提高至-6.7 mV , 酸性磷酸酶相对活力降至23.1%, 藻细胞出现明显的质壁分离 、蛋白核扭曲和溶酶体膨胀等现象.根据
实验结果分析 , CTAC 提高了藻细胞 Zeta电位 ,抑制了小球藻对氮和铁的吸收 , 影响磷的代谢并引起亚显微结构的改变.
关键词:十六烷基三甲基氯化铵;小球藻;Zeta电位;酸性磷酸酶;亚显微结构
中图分类号:X171 文献标识码:A 文章编号:0250-3301(2009)06-1767-06
收稿日期:2008-07-12;修订日期:2008-09-24
基金项目:国家自然科学基金项目(20877065);湖南省教育厅优秀青
年基金项目(07B077);湘潭大学博士科研启动项目作者简介:许银(1985～ ), 女, 硕士研究生 , 主要研究方向为有机污
染物的环境行为及生态风险评价 , E-mai l:xuyin123 @
hotmail.com
＊通讯联系人 , E-mai l:gefei@xtu.edu.cn
Growth Inhibition and Mechanism of Cetyltrimethyl Ammonium Chloride on
Chlorella vulgaris
XU Yin
1 , GE Fei1 , TAO Neng-guo2 , ZHU Run-liang1 , WANG Na1
(1.Department of Environmental Science and Engineering , Xiangtan University , Xiangtan 411105 , China;2.Department of Biological
Engineering , Xiangtan University , Xiangtan 411105 , China)
Abstract:Growth inhibition of cetyltrimethyl ammonium chloride(CTAC), a cationic surfactants , on Chlorella vulgaris was investigated at
batch culture in laboratory.Furthermore , the corresponding mechanisms were studied by the determination of absorption capacity , Zeta
potential, activity of acid phosphatase and ultrastructure of algae.Results show that the growth inhibition by CATC is enhanced with its
concentration increasing from 0.1 mg L to 1 mg L , and 96 h-EC50 of CTAC is 0.18 mg L.In the presence of 0.3 mg L CTAC in 8 d , the
inhibition efficiency of biomass reaches 70.7%.Meanwhile , the absorption of nitrogen and iron is inhibited 83.9% and 86.2% respectively
with Zeta potential of algae cell increasing from -12.5 mV to -6.7 mV.Furthermore , the relative activity of acid phosphatase declines to
23.1% at the same time.Plasmolysis , distortion of pyrenoid and swelling of ly sosome is observed in the cell.Above phenomena indicates that
CTAC increases the Zeta potential of algae cell and thus inhibites the absorption of nitrogen and iron.In addition , CTAC may affect the
metabolism of phosphorus and change the ultrastructure of algae cell.
Key words:CTAC;Chlorella vulgaris;Zeta potential;acid phosphatase;ultrastructure
表面活性剂广泛用于纺织 、制药 、洗涤及化妆品
等领域.2005 年中国表面活性剂的消耗量达到
3.018×106 t , 位居世界第二 , 其用量呈逐年上升趋
势[ 1] .大量表面活性剂随工业废水和生活污水排放
进入水环境中 , 影响水生生物生长 , 导致生物种群
数量的变化和群落结构的改变 , 破坏生态系统的平
衡[ 2 ～ 4] .因此 ,研究表面活性剂对生态环境的影响
十分重要.
藻类对环境污染物非常敏感 , 通过测定和评价
外源污染物对藻类生长的影响 ,可以反映整个水生
生态可能的综合效应[ 5, 6] .表面活性剂对生态系统
的影响已引起国内外学者的广泛关注[ 7 ～ 9] .研究表
明阳离子表面活性剂(cationic surfactant , CS)对藻类
具有较强的抑制作用[ 10 ～ 12] , 但主要集中在其对藻
类生物量和叶绿素的影响 , 而从细胞外吸附到细胞
内应答方面研究 CS抑制藻类生长的作用机制鲜见
报道.
通常情况下 , 研究化学污染物对生物生长的影
响及机制常采用生物量 、细胞表面特性 、酶活性和细
胞亚显微结构等指标[ 13 ～ 16] .本研究以十六烷基三
甲基氯化铵(cetyltrimethyl ammonium chloride , CTAC)
作为CS的代表 , 在考察其对典型淡水藻-普通小球
藻(Chlorella vulgaris)生物量影响的基础上 , 重点研
第 30 卷第 6期
2009 年6 月 环 境 科 学ENVIRONMENTAL SCIENCE
Vol.30 , No.6
Jun., 2009
DOI :10.13227/j.hjkx.2009.06.030
究CTAC抑制小球藻生长的生理机制 ,包括 CTAC 对
小球藻吸收营养物质氮 、磷和铁以及藻细胞 Zeta 电
位 、酸性磷酸酶(ACPase)活性及亚显微结构的影响.
研究结果可初步揭示 CS 抑藻效应的作用机制 ,以期
为评价其生态风险提供理论依据.
1 材料与方法
1.1 实验材料
普通小球藻购自中科院武汉水生生物研究所国
家淡水藻种库(FACHB).CTAC(分析纯 , 纯度 ≥
98%)购自南京旋光科技有限公司 , 性质见表 1.对
硝基苯磷酸酯(p-NPP , 分析纯 , 纯度≥98%)购自
上海生物科技有限公司.
表 1 CTAC的理化性质
Table 1 Physical-chemical properties of CTAC
物质 CTAC
分子式 C19H42ClN
化学结构式
亲水亲油指数 12.2
相对分子质量 319.95
临界胶束浓度 mol·L-1 1.3×10-3
1.2 实验方法
小球藻的培养:用照度计(TES 1330A , 台湾)测
定光照强度 , 调节光照强度达到2 500 lx , 光暗比 L∶
D=12 h∶12 h , 设定温度为(25±1)℃, 每天人工摇
瓶3次 , 培养基为OECD培养液[ 17] .实验前藻种扩
大培养7 d后 , 取一定体积的藻液离心弃去上清液 ,
用碳酸氢钠溶液洗涤 , 再离心 , 重复 3次 , 用无菌
水稀释后计数.取100 mL实验起始浓度为3.5×105
个 mL 的藻液 , 加入培养液 , 分别加入 CTAC 使其
浓度达到 0.1 、0.2 、 0.3 、 0.5 、 0.8 、 1.0 mg L , 调节
pH到 8.0 , 设置 3组平行 , 每天定时测定生物量 , 8
d后测定单位氨氮 、总磷和总铁含量 , Zeta电位 , 酸
性磷酸酶活性和观察亚显微结构.
1.3 分析测定方法
(1)生物量测定
采用显微镜下血球计数板进行计数 , 并在波长
680 nm下测定小球藻光密度 , 建立不同藻细胞浓度
和光密度之间的线性关系[ 18] .根据实验数据运用几
率单位法计算 96 h半抑制浓度(96 h-EC50)[ 19 , 20] , 为
了保证计算结果的可信度 , 对 CTAC 浓度对数与几
率单位之间的剂量反应方程进行了 X 2检验。
(2)Zeta电位测定
将培养 8 d含有不同浓度 CTAC 的藻液 , 调节
pH 到 7.0 , 用 Zeta电位仪(Delsa 440SX , 美国)测定
小球藻的Zeta电位 , 重复 3次 , 结果取平均值.
(3)亚显微结构测定
一组加入 CTAC , 另一组不加 CTAC作为对照 ,
培养8 d , 离心 , 获得藻细胞依次进行如下处理:3%
戊二醛前固定 2 h , OsO4 在 4℃下后固定 2 h , 0.1
mol L磷酸缓冲液冲洗 2次 , 1%乙酸铀酰染色 1 h ,
梯度酒精脱水 , 用丙酮包埋剂浸透1 h , 纯包埋剂浸
透过夜 , 60℃固化 48 h , 降温切片 , 透射电镜(JEM-
1230 , 日本)观察藻细胞亚显微结构.
(4)氮 、磷和铁测定
将培养 8 d 含有不同浓度 CTAC 的藻液(100
mL)离心 20 min(5 000 r min), 取上清液.采用纳氏
试剂光度法 、磷钼杂多酸光度法和改进的二氮杂菲
实验方法[ 21] 分别测定上清液中氨氮 、总磷和总铁
含量.
(5)酸性磷酸酶活性
参照 Josson等[ 22] 的方法进行测定.
2 结果与讨论
2.1 CTAC 对小球藻生物量的影响
随着 CTAC浓度的增加 , 小球藻受到了不同程
度的抑制作用(图 1).从中可以看出 , 小球藻的生
长周期:0 ～ 2 d为延滞期 , 2 ～ 9 d为生长期 , 9 ～ 12
d为平稳期.不同浓度的 CTAC对延滞期藻细胞的
生长影响不大 , 但在生长期 CTAC 对小球藻抑制作
用明显 , 并随CTAC浓度的增大而增强.当CTAC为
0.1 mg L时 ,随着培养时间的增加 ,小球藻继续生
长 ,但对小球藻的生长有一定的抑制作用.当 CTAC
浓度达到0.3 mg L , 小球藻生长受到显著抑制 , 细
胞密度趋于稳定.当 CTAC 浓度超过 0.3 mg L ,
CTAC完全抑制小球藻的生长 , 培养数日出现负
增长.
当 CTAC 浓度处于 0.1 ～ 0.3 mg L 时 , 作用 4 d
后对小球藻生长的抑制率有明显的上升趋势 , 0.3
mg L CTAC对小球藻的抑制率达 70.7%.当 CTAC
浓度达到 1.0 mg L , 小球藻的生长受到完全抑制.
通过浓度对数(x)与几率单位(y)进行一元回归 , 得
到剂量方程 y =11.348-1.217 2 x , 当几率单位为 5
时 , 通过换算得到 CTAC的 96 h-EC50为 0.18 mg L.
1768 环 境 科 学 30 卷
图 1 CTAC对小球藻的生物量的影响
Fig.1 Effect of CTAC on the biomass of Chlorella vulgaris
对上述剂量反应方程进行 X2 检验 , 计算的 X2 值为
1.22
CTAC对小球藻的毒性作用与 Riess等[ 13] 研究 CTAC
对 Chlorella fusca是一致的.
表 2 剂量反应方程及 X2 检验
Table 2 Dose response equation and its X 2 test result
CTAC浓度对数(x) 4.61 5.3 5.7 6.21 6.68
计算几率单位(y) 5.77 4.79 4.46 3.88 3.15
剂量反应方程 y = 11.348-1.217 2x (r 2 = 0.992 9)
反应率(p) 0.78 0.42 0.29 0.13 0.03
对照反应率(k) % 100 100 100 100 100
实际反应率(r) % 76.9 45.9 27.8 11.3 3.7
(r-kp)2 [ kp(1-p)] 0.05 0.69 0.11 0.28 0.09
X2 1.22
2.2 CTAC对藻细胞吸收氮 、磷和铁的影响
氮 、磷为藻类生长的重要营养物质[ 23 , 24] , 而铁
是藻类生长的一种重要性元素[ 25 , 26] .图 2为培养 8
d后不同浓度 CTAC 对藻细胞吸收氮 、磷和铁的影
响.溶液中氮 、磷和铁源分别以氨氮 、磷酸盐和铁离
子形式存在.对照组溶液中氮 、磷和铁的单位吸收量
分别为0.31 mg 、 0.06 mg 和 11.06 μg.从图 2中可
以看出 , CTAC 在浓度<0.3 mg L时 ,对小球藻吸收
氮和铁的抑制作用明显 , 而基本不影响磷的吸收.
如0.3 mg L CTAC作用下 , 小球藻对氮和铁的单位
吸收量分别为 0.05 mg 和 1.53 μg , 与对照组比较计
算得到对氮和铁的抑制率分别为 83.9%和 86.2%.
当CTAC浓度增大到 0.3 mg L以上时 , 小球藻生长
完全受到抑制并呈现衰亡状态 , 导致小球藻不能吸
收营养物质因此对其吸收氮 、铁和磷的抑制作用是
一致的.
一般认为 , 化学污染物对生物体产生影响主要
通过以下步骤:①污染物溶于水中;②污染物被细
胞壁或细胞膜吸附;③污染物通过被动吸收跨膜进
入细胞内[ 27] .CTAC表面带正电荷并具有长疏水链 ,
比氨氮和铁离子更容易吸附于带负电荷的小球藻细
胞膜表面 , 从而抑制了以阳离子形式存在的氨氮和
铁离子的吸收.王修林等[ 28] 和周律等[ 29] 指出正离
子头基的双季胺盐和十六烷基三甲基溴化铵可吸附
于细胞膜表面 , 改变细胞膜的通透性 , 破坏营养物
质到达细胞的正常流动 , 导致细胞死亡.肖琳等[ 30]
报道附生假单胞菌信号分子对微囊藻有抑制作用 ,
但对细胞内磷的积累无影响 , 本研究也得到类似的
结果 , CTAC 对小球藻有抑制作用 , 但对细胞内磷
的积累无影响.
图 2 CTAC对藻细胞吸收氮 、磷和铁的影响
Fig.2 Effect of CTAC on the absorption of nitrogen , iron and
phosphorus by algae cell
2.3 CTAC 对藻细胞 Zeta 电位的影响
CTAC抑制了小球藻吸收阳离子型营养物质 ,
进一步通过测定藻细胞表面 Zeta 电位来推断其影
响机制.图 3 为 CTAC对藻细胞 Zeta 电位的影响.
对照组的小球藻 Zeta电位为-12.5 mV.随着 CTAC
浓度的增大 , 小球藻 Zeta 电位逐渐上升.在 0.3
mg L CTAC 作用下 , 小球藻 Zeta 电位提高到 -6.7
mV , 与对照组相比增大了 46.4%.0.5 mg L CTAC
使小球藻 Zeta 电位提高到 -4.9 mV , 增大了
60.8%.
17696 期 许银等:十六烷基三甲基氯化铵抑制小球藻生长的效应及作用机制
Zeta电位值的高低能衡量藻细胞表面所带电荷
量的多少.根据CTAC 作用下藻细胞表面电荷量变
化 , 可初步探讨其抑藻机制.小球藻的表面同时存
在有亲水位点和疏水位点 , 亲水性位点主要是带电
荷的基团 , 例如羧基 、磷酸基团;疏水性位点主要
是脂类 、脂多糖与蛋白质.细胞壁上的这些化学成
分使小球藻表面带有负电荷 , 对阳离子有强烈的吸
附作用[ 31] .Thomas等[ 32] 研究表明 , 褐藻的羧基基团
是其吸附重金属的机制之一.阳离子表面活性剂含
有烷基疏水基和带正电荷的亲水基团 , 在液固界面
易吸附于负电荷的表面 ,使表面变为憎水性.CTAC
分子结构中氮原子所带正电荷与带负电荷的小球藻
产生静电吸附作用 , 稳定地被吸附在小球藻表面 ,
引起小球藻表面电负性的降低.随着 CTAC 浓度的
增大 , 藻细胞 Zeta电位逐渐升高.已有研究表明消
毒剂戊二醛能与细胞壁肽聚糖结构中肽链上亚氨基
和自由氨基发生酰化作用 , 使细菌的 Zeta 电位升
高 , 从而达到杀菌的作用[ 33 , 34] .
结合2.2和2.3的数据可以推断 , CTAC 在小球
藻上发生吸附作用 , 提高了小球藻表面 Zeta电位 ,
从而抑制小球藻对以阳离子形式存在的营养元素的
吸收.
图 3 CTAC对藻细胞 Zeta电位的影响
Fig.3 Effect of CTAC on Zeta potential of algae cell
2.4 CTAC对藻细胞ACPase的影响
由图 2可知当浓度<0.3 mg L时 , CTAC基本不
影响磷的吸收.为进一步探讨抑制机制 , 从磷的代
谢方面研究 CTAC 对小球藻 ACPase的影响.从图 4
可以看出 , CTAC 对小球藻 ACPase 具有明显的抑制
作用 , 在浓度为0.1 ～ 0.3 mg L时 , 随 CTAC浓度的
增加 , 小球藻 ACPase 活性迅速下降.与对照组相
比 , CTAC 浓度从 0.1 mg L增加到 0.3 mg L时 ,
ACPase相对活力从80.0%降低到 23.1%.当浓度>
0.5 mg L后 , ACPase 的相对活力趋于稳定.利用
SPSS软件进行单因素方差分析得到当 CTAC 浓度<
0.3 mg L , ACPase 活力有明显的差异性(p<0.05),
当 CTAC 浓度>0.5 mg L , ACPase 活力的差异性不
明显(p>0.05).
图 4 CTAC 对藻细胞酸性磷酸酶活性的影响
Fig.4 Effect of CTAC on acid phosphatase activity of algae cell
ACPase能够催化磷酸单酯的水解及无机磷酸
的释放 , 是生物磷代谢的重要酶类 , 同时也是溶酶
体中的标志酶 , 酶活性的强弱可以表征生物体中的
磷水解速率和细胞活性[ 35] .Guilherminoaa等[ 12] 研究
得到十二烷基硫酸钠能抑制藻细胞的乙酰胆碱酯酶
的活力 , 同时 Josson等[ 22] 也表明十二烷基苯磺酸钠
类似于汞离子能抑制藻细胞 ACPase 的活力.重金
属汞引起酶分子结构中色氨酸 、酪氨酸残基的微环
境产生变化 ,导致酶活性中心的构象发生改变 , 从
而抑制酶的催化活性[ 36] .CTAC 类似于重金属可能
破坏酶蛋白二维结构中盐键 、氢键和疏水键 , 缩短
活性基团之间的距离.CTAC 干扰了溶酶体的功能 ,
进一步影响细胞相关生理代谢过程.
2.5 CTAC 对藻细胞亚显微结构的影响
CTAC对小球藻亚显微结构的影响如图 5所示.
对照组小球藻大小为 2 ～ 3 μm , 蛋白核位于叶绿体
的中央 , 被内囊体包围.蛋白核形状为椭圆形或球
形.细胞内囊体结构清晰 , 片层连续.每个小球藻
细胞仅有 1 个蛋白核 , 蛋白核被一层淀粉鞘所保
1770 环 境 科 学 30 卷
护 , 淀粉鞘为椭圆形 , 横切面为两片船形结构 ,合
夹着蛋白核 , 溶酶体是由 6 ～ 8 nm 厚的单层膜所围
着直径为 0.4μm的颗粒或小泡[图 5(a)] .加入 0.3
mg L CTAC后 , 藻细胞受到不同程度的破坏.虽然
小球藻的细胞核没有受到损害 , 但大部分的小球藻
蛋白核扭曲变形 , 蛋白核髓部电子密度减小[图 5
(b)] , 部分小球藻明显出现质壁分离现象[ 图 5
(c)] , 少数小球藻变形严重 , 细胞膜完全脱落 , 部
分细胞质浓缩在一起 , 内含物模糊不清 , 溶酶体出
现膨胀[图 5(d)] .
放大倍数 40000.(a):对照组;(b)～ (d):0.3 mg L CTAC
作用下的小球藻.N 为细胞核;P为蛋白核;CW为细胞壁;
CM 为细胞膜;L为溶酶体;S为淀粉粒
图 5 CTAC对藻细胞亚显微结构的影响
Fig.5 Effect of CTAC on the ultrastructure of algae cell
CTAC的疏水基团与膜脂结构结合 , 引起小球
藻质壁分离并破坏其亚显微结构.膜中的蛋白质分
子是季胺盐离子极好的附着点 , 引起细胞膜中膜蛋
白亲脂键的破裂 , 从而破坏半透膜完整性引起质壁
分离甚至膜结构的破坏[ 37] .质膜的收缩使破损的细
胞器残体集中于细胞中央位置 , 影响细胞间的物质
运输和信息传递 , 导致细胞死亡.这种抑制机制与
李锋民等[ 15] 研究 2-甲基乙酰乙酸乙酯对藻细胞亚
显微结构的影响机制相一致.CTAC 抑制了小球藻
ACPase活性 , 酶蛋白功能丧失并发生变异 , 导致底
物在溶酶体中大量贮积 , 引起小球藻的溶酶体出现
膨胀现象.
3 结论
(1)CTAC 抑制了小球藻的生长 , 其 96 h-EC50
为0.18mg L.CTAC浓度>0.3 mg L , 能完全抑制小
球藻的生长.
(2)0.3 mg L CTAC作用 8 d下 , 小球藻对氮和
铁单位吸收量的抑制率分别为 83.9%和 86.2%, 藻
细胞 Zeta电位从-12.5 mV提高至-6.7 mV , 小球
藻酸性磷酸酶的相对活力降至 23.1%.
(3)CTAC 使藻细胞出现明显的质壁分离 , 蛋
白核扭曲和溶酶体膨胀.
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