全 文 ：第38卷 第3期 水 生 生 物 学 报 Vol. 38, No.3
2 0 1 4 年 5 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA May, 2 0 1 4
收稿日期: 2013-01-28; 修订日期: 2013-10-17
基金项目: 国家 973计划前期研究专项(No. 2012CB723106); 宁夏环境科学研究项目(No. 20100803)资助
作者简介: 牛海亚(1987—), 女, 宁夏固原人; 硕士研究生; 主要研究方向为生物质能源。E-mail: bixinyuhu@qq.com
通信作者: 马玉龙(1966—), 男, 回族, 博士后, 教授; 主要研究方向为生物质冶炼与高值转化。E-mail: nxylma@163.com
doi: 10.7541/2014.67
不同营养方式对小球藻 FACHB 484生长的影响及其
非自养生长机理研究
牛海亚1 马玉龙1, 2 石勋祥1 牛 芮1
(1. 宁夏大学能源化工国家重点实验室培育基地, 宁夏 750021; 2. 宁夏大学化学化工学院, 宁夏 750021)
摘要: 系统研究了小球藻 FACHB 484 在含有葡萄糖的不同营养方式下的生长情况, 并通过抑制试验探讨葡
萄糖在小球藻 FACHB 484光异养和兼养生长条件下所起的作用以及小球藻 FACHB 484是否存在氧化呼吸
系统的关键酶类。结果表明: 小球藻 FACHB 484可利用葡萄糖进行化能异养、光激活异养、光异养及兼养
生长, 其生长速率大小为: 兼养＞光异养＞光激活异养＞化能异养＞光合自养。兼养培养的最大生物量和比
生长速率分别是自养培养的 8.6和 3.4倍, 其比生长速率接近于光合自养和光异养培养下的比生长速率之和。
葡萄糖主要作为小球藻 FACHB 484兼养和光异养培养的碳源, 而能量主要源自光。小球藻 FACHB 484存在
氧化呼吸链代谢途径, 其细胞中有琥珀酸脱氢酶和细胞色素氧化酶。
关键词: 小球藻; 异养生长; 兼养生长; 代谢机理
中图分类号: S968; Q949.2 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2014)03-0474-06
小球藻(Chlorella)为绿藻门、小球藻属的单细胞
绿藻[1]。与高等植物相比, 小球藻不仅可利用光能和
CO2 进行光合自养(Photoautotrophy)生长, 而且可以
利用有机碳进行异养 (Heterotrophy)和兼养生长
(Mixotrophy)[2]。光合自养的光抑制性是限制微藻生
物量增加的主要原因之一。异养培养以外加有机碳
为碳源和能源 [3], 能够降低或消除光合自养培养的
不足。异养培养和兼养培养不仅能提高微藻的生物
量 [4], 而且微藻的细胞结构和生化组分也发生了变
化。缪晓玲等[5]通过异养转化细胞工程技术获得了
油脂含量高达 57.9%的异养小球藻, 使油脂含量在
化合自养的基础上提高了 4倍。
目前, 关于微藻异养、兼养的生长机理还不清
楚。一些微藻尽管有代谢有机碳所必须的酶系, 但
对有机碳却不能同化吸收, 如小定鞭藻(Prymnesium
parvum) 和 杜 氏 盐 藻 (Dunaliella tertiolecta)[6] 。
Gladue[7]对一些微藻没有异养生长能力的原因提出
了三种假说: 通透性障碍、相关酶的缺乏和限制性
的呼吸能力。但不同微藻或同一种微藻不同品系间
的异养、兼养生长机理可能存在差异。吴庆余等[8]
对小球藻(Chlorella protothecoides)的两种品系(中国
品系 C与美国品系 A)在高浓度葡萄糖、低浓度有机
氮的条件下进行异养培养, 发现两株小球藻在生长
速率、叶绿素含量及细胞内腺苷酸能荷值(AEC)方
面存在很大的差异性。近年来, 关于小球藻培养的
研究报道主要集中在自养培养和异养培养方面[9], 但
对小球藻的自养、化能异养 (Chemoheterotrophy)、
光激活异养 (Light-activated heterotrophic growth,
LAHG)、光异养 (Photoheterotrophy)和兼养培养的
系统比较研究报道较少, 尤其在利用葡萄糖代谢机
理方面的研究报道甚少。本研究针对以上两个方面
进行试验, 为小球藻的基础研究及利用小球藻进行
生产研究的其他领域提供相关数据。
1 材料与方法
1.1 藻种
小球藻 FACHB 484(Chlorella sp. 484)购自中国
科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(FACHB)。
3期 牛海亚等: 不同营养方式对小球藻 FACHB 484生长的影响及其非自养生长机理研究 475
1.2 培养基与试剂
SE基础培养液(1L), 其配方如下: NaNO3 250 mg,
K2HPO4 75 mg, MgSO4·7H2O 75 mg, CaCl2·2H2O
25 mg, KH2PO4 175 mg, NaCl 25 mg, FeCl3·6H2O
5 mg, EDTA-Fe 1 mL, Trace mental solution 1 mL,
土壤提取液 40 mL, 蒸馏水 958 mL。
试剂: 葡萄糖, 3-(3, 4-二氯苯基)-1, 1-二甲脲
(DCMU, 购于 Sigma 公司), 2, 4-二硝基苯酚, 叠氮
化钠, 丙二酸钠, 头孢噻肟钠。
1.3 培养条件
将配置分装好的培养基在高压灭菌锅中 121℃
灭菌 20min, 灭菌后冷却至室温, 添加头孢噻肟钠
至 0.5 mg/L防止染菌。在超净台中将生长至对数期
的微藻接种于含 150 mL培养基的 250 mL锥形瓶中
(接种量 20, v/v), 温度 30℃、平均光强 5000 lx的培
养箱中培养, 光暗比 12h 12h∶ 。
1.4 试验设计
小球藻 FACHB 484 不同营养方式比较 光
合自养培养: 将微藻接种于 SE基础培养基中, 在光
照条件下培养。设置三个平行, 每隔 24h 测定其生
物量及 pH变化。兼养培养: 在 SE培养基中添加碳
浓度 200 mg/L的葡萄糖, 于光照条件下培养。设置
三个平行, 每隔 24h测定其生物量及 pH变化。化能
异养: 在 SE培养基中添加碳浓度 200 mg/L的葡萄
糖, 将锥形瓶用黑色布袋包裹, 于完全黑暗条件下
培养。设置三个平行 , 每隔 24h 测定其生物量及
pH 变化。光激活异养: 在 SE 培养基中添加碳浓度
200 mg/L 的葡萄糖, 将锥形瓶用黑色布袋包裹, 于
完全黑暗条件下培养, 每 24h 取下布袋, 以 5000 lx
脉冲式短波照射 10min。设置三个平行, 每隔 24h
测定其生物量及 pH变化。光异养: 在 SE培养基中
添加碳浓度 200 mg/L的葡萄糖, 并添加 10–6 mol/L
3-(3, 4-二氯苯基)-1, 1-二甲脲(DCMU), 于光照条件
下培养。设置三个平行, 每隔 24h 测定其生物量及
pH变化。
兼养与光异养碳源试验 在自养、兼养、和光
异养、培养基中分别添加 5.0×10–7和 5×10–5 mmol/L
的 2, 4-二硝基苯酚(DNP), 设置三个平行, 每隔 24h
测定其生物量。
呼吸链抑制剂对小球藻 FACHB 484 生长的影响
在自养和兼养培养基中分别添加 0.1和 1 mmol/L的
丙二酸钠, 光照培养, 设置三个平行, 每隔 24h测定
其生物量。
在自养和兼养培养基中分别添加 1和 10 μmol/L
的叠氮化钠, 光照培养, 设置三个平行, 每隔 24h测
定其生物量。
1.5 样品测定
藻细胞生物量测定。采用紫外可见分光光度仪
测定微藻溶液在最大吸收波长λ690 处的吸光度值
(A690), 并采用血球计数板计数微藻细胞个数, 建立
微藻细胞个数与吸光度值 A690 之间的拟合曲线, 曲
线方程如下:
Chlorella sp.: y＝3×10–8x＋0.0719 R2＝0.9902 (1)
式中 y为微藻吸光度值 A690, x为藻细胞个数。
微藻比生长速率(Specific growth rate): 微藻比
生长速率是依据细胞密度值通过最小二乘法拟合得
到, 用来评价微藻的日生长情况及平均比生长速率,
即其在一定时期内的总体生长情况。公式如下[10]:
μ＝(lnNT-lnN0)/ΔT (2)
式中μ为微藻比生长速率(/d), N0为接种时微藻细胞
密度, NT为培养 T天后微藻细胞密度, ΔT为微藻接
种到 T天时的时间间隔。
2 结果
2.1 小球藻 FACHB 484营养方式比较
由图 1可知: 小球藻 FACHB 484能利用葡萄糖
进行化能异养、光激活异养、光异养和兼养生长。
在化能异养和光激活异养条件下, 小球藻 FACHB
484颜色依然为绿色, 但生长缓慢。在添加了 DCMU
的光异养条件下小球藻 FACHB 484 生长状况优于
化能异养和光激活异养, 但在培养 12d 以后因葡萄
糖耗尽而死亡。小球藻 FACHB 484在兼养条件下的
生长状况最好。并且所试微藻兼养比生长速率(0.33)
与光合自养比生长速率(0.13)和光异养比生长速率
(0.19)之和(0.32)非常接近, 说明小球藻 FACHB 484
兼养培养比生长速率等于光异养培养与自养培养比
生长速率之和。
2.2 在不同营养方式下小球藻FACHB 484体系 pH
变化
由图 2可知: 小球藻 FACHB 484在加入葡萄糖
进行化能异养、光激活异养、光异养和兼养生长时,
体系 pH都首先有一个小幅的下降, 之后又升高, 且
升高的幅度与小球藻 FACHB 484 生物量增加的幅
度相一致。而在自养生长条件下, 小球藻 FACHB
484体系 pH保持了一个小幅的波动上升趋势。推测
476 水 生 生 物 学 报 38卷
图 1 小球藻 FACHB 484在不同营养方式下的生长情况
Fig. 1 The growth performance of Chlorella sp. FACHB 484
under different trophic conditions
图 2 小球藻 FACHB 484在不同营养方式下体系 pH变化
Fig. 2 The change of medium pH of Chlorella sp. 484 under
different trophic conditions
小球藻 FACHB 484 在利用葡萄糖生长的初期, 代
谢产生了一些小分子的酸类物质[11]。之后由于葡萄
糖浓度下降, SE培养基中 NaNO3为一种生物性碱,
随着微藻细胞对 3NO− 的吸收, 培养基中 Na+过剩,
微藻细胞泵出的 OH–占优势, 使溶液 pH不断升高,
而在光合自养生长过程中微藻生长缓慢 , 且由于
藻液中昼夜 CO2含量的不同, 使 pH 保持了一个小
幅波动上升的趋势。小球藻 FACHB 484能够利用
葡萄糖进行化能异养、光激活异养、光异养和兼养
生长, 说明小球藻 FACHB 484 中存在一些正常代
谢的酶类。
2.3 兼养与光异养碳源试验
上述研究表明: 小球藻 FACHB 484能利用葡萄
图 3 2, 4-二硝基苯酚对不同培养方式下小球藻 FACHB 484生
长的影响
Fig. 3 Effects of 2, 4-dinitrophenol on the growth of Chlorella sp.
FACHB 484 under different conditions
3期 牛海亚等: 不同营养方式对小球藻 FACHB 484生长的影响及其非自养生长机理研究 477
糖进行化能异养、光激活异养、光异养和兼养生长,
为了进一步探明葡萄糖在小球藻 FACHB 484 光异
养和兼养生长中的作用, 本实验以 DNP 为解偶联剂,
对葡萄糖光异养培养和兼养培养条件下的小球藻
FACHB 484生长状况进行研究。从图 3中可知, 在
光异养培养和兼养培养条件下, 添加 5×10–7和 5×
10–5 mmol/L DNP对小球藻 FACHB 484生长未产生
显著影响。
2.4 呼吸链抑制剂对小球藻 FACHB 484生长的影响
大多数微藻为光合自养生物 , 但许多微藻也
能利用有机碳进行兼养和异养生长。只有少数微藻
可以在完全黑暗的条件下利用有机碳进行异养生
长。本试验已证明小球藻 FACHB 484 能够利用葡
萄糖进行生长。为了进一步验证小球藻 FACHB 484
是否存在呼吸代谢途径和末端氧化系统的酶 , 采
用丙二酸钠和叠氮化钠对小球藻 FACHB 484 进行
抑制试验。由图 4、图 5 可知, 在自养培养和兼养
培养条件下, 小球藻 FACHB 484 对丙二酸钠和叠
氮化钠的抑制都敏感, 随抑制剂浓度的增加, 抑制
效果明显增强。
3 讨论
许多微藻具有利用
有机碳进行兼养和异养
生长的能力 , 如鱼腥藻
HB1017 能利用果糖、葡
萄糖和蔗糖为底物进行
化能异养生长[12, 13]。集胞
藻 (Synechocystis sp.)
PCC6803 可以在每天一
个短时光照 (5min)条件
下利用葡萄糖进行光激
活异养[14, 15], 三角褐指藻
具有兼养生长的能力[16]。
本 试 验 对 小 球 藻
FACHB 484 进行了自
养、兼养和异养的系统
试验。结果表明 , 在含
葡萄糖的培养基中 , 小
球藻 FACHB 484 在不
同营养方式下的生长情
况为: 兼养生长>光异养生长>光激活异养生长>化
能异养生长>光合自养(图 1)。在光异养条件下培养
小球藻 FACHB 484, 12d 以后死亡, 是由于 DCMU
是光合作用抑制剂, 在培养基中加入 DCMU 以后,
微藻细胞光系统Ⅱ的活性被抑制, 阻断了非环式电
子传递, NADPH 不再产生, CO2不能被微藻同化吸
收[17—19]。所以当葡萄糖被耗尽时, 如不再添加碳源,
微藻细胞由于缺少生长所必须的碳源而死亡。文献
报道, 大多数微藻兼养的比生长速率等于异养培养
与自养培养比生长速率之和(μ 兼养=μ 异养+μ 自养), 兼养培
养兼有光合自养与异养代谢的性质, 在光合自养条
件下, CO2作为唯一碳源维持微藻生长, 在光异养条
件下, 非环式电子传递被阻断, CO2不能被同化吸收,
微藻只能利用有机碳进行生长。本试验研究结果表
明, 小球藻 FACHB 484兼养的比生长速率等于光合
自养培养与光异养培养比生长速率之和, 兼养培养
是获得小球藻 FACHB 484高密度、高产量、短周期
培养的最佳营养方式。
本实验以 DNP为解偶联剂, 进一步探明葡萄糖
在小球藻 FACHB 484光异养和兼养生长中的作用。
图 4 丙二酸钠对小球藻 FACHB 484生长的影响
Fig. 4 Effects of sodium malonate on the growth of Chlorella sp. FACHB 484
图 5 叠氮化钠对小球藻 FACHB 484生长的影响
Fig. 5 Effects of sodium azide on the growth of Chlorella sp. FACHB 484
478 水 生 生 物 学 报 38卷
生物体的磷酸化有代谢连接的磷酸化和呼吸链连接
的磷酸化两种类型, 即底物水平磷酸化和氧化磷酸
化。氧化磷酸化的作用是有机物在分解过程中释放
的能量用于 ATP的合成。DNP是一种疏水性质子载
体, 作为氧化磷酸化的解偶联剂, DNP 能轻易扩散
穿过线粒体内膜, 以质子化的形式将膜间隙的 H+带
回线粒体并释放到基质中, 从而消除了线粒体内膜
两侧的H+浓度梯度, 破坏了激活ATP合成酶的质子
驱动力[20], ATP 不能被合成, 使氧化和磷酸化脱偶
联, 氧化释放的能量全部以热的形式散发。DNP 对
小球藻 FACHB 484 生长未产生显著影响(图 3), 因
此可以排除小球藻 FACHB 484 在光异养和兼养培
养条件下主要通过葡萄糖氧化磷酸化提供能量的途
径。这说明小球藻 FACHB 484在光异养和兼养培养
条件下的能量来源是光 , 而葡萄糖主要为小球藻
FACHB 484生长起提供碳源的作用。
为了进一步验证小球藻 FACHB 484 是否存在
呼吸代谢途径和末端氧化系统的酶, 采用丙二酸钠
和叠氮化钠对小球藻 FACHB 484进行抑制试验。琥
珀酸脱氢酶是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之
一, 具有严格的立体专一性。丙二酸是琥珀酸的类
似物 , 是琥珀酸脱氢酶的强有力的竞争性抑制物 ,
可以阻断三羧酸循环。细胞色素氧化酶是电子传递
链末端的酶。细胞色素 aa3和 P450辅基中的铁原子可
以与叠氮化合物形成一个配位键, 阻断呼吸链的电
子传递。小球藻 FACHB 484对丙二酸钠和叠氮化钠
的抑制都敏感, 随抑制剂浓度的增加, 抑制效果明
显增强(图 4、图 5)。这说明小球藻 FACHB 484 线
粒体内膜存在琥珀酸脱氢酶和细胞色素氧化酶系
统。因此可见, 小球藻 FACHB 484中存在氧化呼吸
系统的一些关键酶系。
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STUDY ON THE EFFECTS OF DIFFERENT NUTRITION MODES ON THE
GROWTH OF CHLORELLA SP. FACHB 484 AND THE MECHANISM OF
HETEROTROPHIC GROWTH
NIU Hai-Ya1, MA Yu-Long1, 2, SHI Xun-Xiang1 and NIU Rui1
(1. State Key Laboratory Cultivation Base of Energy Resources & Chemical Engineering, Ningxia University, Yinchuan 750021,
China; 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Ningxia University, Yinchuan 750021, China)
Abstract: Here we systematically studied the growth of Chlorella sp. FACHB 484 in glucose-containing medium in
different nutrition modes. We also conducted the inhibition tests to investigate the effects of glucose on the growth of
Chlorella sp. FACHB 484 in heterotrophic and mixotrophic conditions, as well as to identify the key enzyme in oxida-
tion respiratory system. We observed that Chlorella sp. FACHB 484 could utilize glucose as the source of nutrition in all
the test nutritional modes and showed different growth rates in the order mixotrophy > photoheterotrophy >
light-activated heterotrophy > chemoheterotrophy > photoautotrophy. The maximum biomass and specific growth rate
(SGR) of the tested algae in mixotrophy were 8.6 and 3.4 times higher than those in photoautotrophy. The value of SGR
of Chlorella sp. FACHB 484 in mixotrophy was close to the sum of the values of SGRs in photoautotrophy and photo-
heterotrophy. In mixotrophic and photoheterotrophic modes, Chlorella sp. FACHB 484 used glucose and light as the
sources of carbon and energy respectively. The cells of Chlorella sp. FACHB 484 expresses succinic dehydrogenase and
cytochrome oxidase which are most likely the key enzymes of the oxidation respiratory chain.
Key words: Chlorella sp.; Heterotrophic growth; Mixotrophic growth; Metabolic mechanism