全 文 ：小球藻培养条件的优化
季 祥 , 张智慧 , 张雪艳 , 蔡禄＊　(内蒙古科技大学生物工程与技术研究所 ,内蒙古包头 014010)
摘要　[目的 ]优化小球藻培养条件 ,以提高小球藻生物量。 [方法 ]在无菌培养条件下 , 对影响小球藻生长的主要营养因素Na2CO3、NaNO3、KH2PO4和 MgSO4等进行了单因素和正交试验优化。 [结果]微量元素和pH值对小球藻的生长有非常明显的影响 ,优化培养基
配方为:Na2CO3 0.02g/L, NaNO3 2.0g/L, KH2PO4 0.02g/L, MgSO4 0.1g/L,环境条件为pH值 6.0。 [结论 ]该研究为扩大培养小球藻提供依据。
关键词　小球藻;有机氮;优化
中图分类号　S188　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)34-16763-02
CultureofChlorelasppandOptimizationofGrowthCondition
JIXiangetal　 (InstituteofBioengineeringandTechnology, InnerMongoliaUniversityofScienceandTechnology, Baotou, InnerMongolia
014010)
Abstract　 [ Objective] ThegrowthconditionofChlorellasppwasoptimizedtoincreaseitsbiomass.[Method] Undertheasepticculturecondi-
tion, majornutritionalfactorsforChlorelasppgrowth, suchasNa2CO3 , NaNO3 , KH2PO4 andMgSO4wereoptimized.[ Result] TraceelementsandpHvaluehadaprominentinfluenceonthegrowthofChlorella.Optimizedculturemediumprogramwasasfolows:Na2CO3 0.02g/L, NaNO3 2.0g/L, KH2PO4 0.02g/L, MgSO4 0.1g/LandambientconditionsofpHvalue6.0.[Conclusion] TheresearchcouldprovidebasisfortheextensionofthecultivationofChlorelaspp.
Keywords　Chlorelaspp;Organicnitrogen;Optimization
基金项目　教育部春晖计划(Z2007-1-01020);内蒙古自治区高等学校
科学研究项目(NJzy08233);内蒙古包头市科技攻关项目
(2008y1002-2)。
作者简介　季祥(1978-),男 ,内蒙古包头人 ,硕士 ,讲师 ,从事生物质
能 、生物制浆方面的研究。 ＊通讯作者。
收稿日期　 2009-07-27
　　小球藻为绿藻门小球藻属(Chlorelaspp)普生性单细胞
绿藻 ,以光合自养生长繁殖 ,分布极广 ,以淡水水域种类最
多 ,生物量大。小球藻类似于多个 “细胞工厂 ” ,通过光合作
用将 CO2转化为生物燃料 、食物 、饲料和高价值的生物活性
物质 [ 1] 。包括小球藻和其他微藻类对生物治理(净化环境)
发挥很大作用 [ 2] ,且可以作为混合氮源来使用 [ 3] 。以小球藻
为原料 ,可以生产几种可再生生物燃料 ,如通过小球藻生物
质的厌氧消化生产沼气 [ 4] ;小球藻油脂提炼生物柴油 [ 5] ;光
生物学上的生物产氢等 [ 6] 。另外 ,小球藻具有多种保健和药
理作用 ,是目前保健食品开发应用较理想和研究较多的微藻
之一 [ 7] 。为了更好地利用小球藻 ,首先要获得大量的小球藻
藻体 。笔者通过优化小球藻培养条件来提高小球藻生物量 ,
为其扩大培养提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料　供试小球藻藻种由内蒙古科技大学生物工程与
技术研究所保存。
1.2　方法
1.2.1　球藻培养 。在 BG11培养基基础上进行优化。培养
温度为 28 ℃,光强为 4.5 ×103 lx,转速为 140 r/min下培
养 [ 8] 。
1.2.2　正交试验。球藻生长中 C、N、P是主要营养元素 [ 9] 。
小球藻营光自养生长 ,可直接利用空气中的 CO2 ,因此 CO3 2-
可直接作为小球藻生长的碳源。硝酸盐是培养小球藻的一
种氮源。微量元素(如 Mg)是影响藻类生长代谢过程的重要
因子。利用正交试验优化培养基中 Na2 CO3、MgSO4、NaNO3
和 KH2PO4的浓度 ,采用 L9 (34 )正交表(表 1)进行 4因素 3
水平正交试验 。
1.2.3　生物量的测定 [ 10] 。采用浊度比色法 ,用 722分光光
度计测定培养液在波长 680 nm处的吸光度(OD680)。
表 1　因素水平
Table1　Levelsoffactors g/L
水平
Levels
A
(NaNO3)
B
(KH2PO4)
C
(MgSO4)
D
(Na2CO3)
1 1.0 0.02 0.050 0.015
2 1.5 0.04 0.075 0.020
3 2.0 0.06 0.100 0.025
2　结果与分析
2.1　pH值对小球藻生长的影响　pH值是影响小球藻生长
的重要因素之一。 pH值影响光合作用中 CO2的可用性 ,在
呼吸作用中影响微藻对有机碳源的利用效率 ,并影响培养基
中微藻细胞对离子的吸收 、利用以及代谢产物的再利用 、毒
性 [ 11] 。由图 1可知 ,当 pH值在 6.0时小球藻生长情况较好;
当 pH值为 5.0和 7.0时 ,小球藻的生长明显较差。因此 , pH
值 6.0为小球藻生长的适宜环境条件。
图 1　初始 pH值对小球藻生长的影响
Fig.1　EffectsofinitialpHvalueonthegrowthofChlorelaspp
2.2　NaNO3对小球藻生长的影响　氮元素是单细胞微藻生
长发育必需的元素之一。微藻通常可以利用铵盐 、硝酸盐及
尿素等氮源。为了对氮源水平作进一步的探索 ,该试验对氮
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(34):16763-16764, 16834 责任编辑　刘月娟　责任校对　卢瑶
源水平作了单因素试验 。由图 2可知 ,随着 NaNO3浓度的升
高 ,小球藻的生物量逐渐增加;当 NaNO3浓度达到 0.08 g/L
时 ,小球藻的生物量达到最大值;当继续提高 NaNO3浓度时 ,
小球藻的生物量减小 。由此可知 , NaNO3 最适浓度
为 0.08 g/L。
图 2　NaNO3对小球藻生长的影响
Fig.2　EfectsofsodiumnitrateonthegrowthofChlorelaspp
2.3　KH2PO4 对小球藻生长的影响　由图 3可知 ,随着
KH2PO4浓度的升高 ,小球藻的生物量逐渐增加;当 KH2 PO4
浓度达到 1.5 mg/L时 ,小球藻的生物量达到最大值;当继续
增加 KH2PO4时 ,小球藻的生物量减小。这可能是由于过高
的磷浓度抑制了小球藻的生长。由此可知 , KH2PO4的最适
浓度为 1.5 mg/L。
图 3　KH2PO4对小球藻生长的影响
Fig.3　EffectsofphosphorsourcesonthegrowthofChlorela
spp
2.4　接种量对小球藻生长的影响　取 5个 250 ml三角瓶 ,
装液 100ml,接种量分别为 5%、10%、20%、30%、40%,摇床
培养 ,每 12 h取样 1次 ,测定 OD值。由图 4可知 ,接种量为
5%时生物量增加缓慢 ,而后迅速增加 ,接种量低时细胞浓度
增加缓慢;而接种量为 30%时 ,细胞浓度增加较快 ,但需种量
大 ,增加了制种过程工作量;接种量为 20%时 ,培养相同时间
后最终 OD与接种量为 30%时的相当;接种量为 40%时 ,藻
液则因初始接种密度过大 ,生长后期营养供给不足而导致平
均生长速率依次减小。因此 ,接种量为 25%对于小球藻的生
长是最为有利的。
2.5　有机氮对小球藻生长的影响　以尿素为有机氮源 ,考
查尿素对小球藻生长的影响。尿素浓度为 0、0.2、0.4、0.6、
0.8 g/L,在光照培养箱中培养。研究表明 ,尿素是一种很好
的有机氮源 ,并且在小球藻的培养过程中 ,培养基 pH值一直
非常稳定。由图 5可知 ,当尿素浓度为 0.4 g/L时小球藻生
长最好 ,而浓度为 0.8g/L时小球藻长势明显不好 ,说明氮源
量太大反而会抑制小球藻的生长。有研究表明 ,在藻类的生
长过程中消耗等量的氮 ,以尿素作为氮源则比硝酸盐产生较
多的生物量 ,并引起培养基较小的 pH值变化。
图 4　接种量对小球藻生长的影响
Fig.4　EffectsofinoculationamountonthegrowthofChlorela
spp
图 5　尿素对小球藻生长的影响
Fig.5　EfectsofureaonthegrowthofChlorelaspp
2.6　营养盐浓度和微量元素(Mg)对小球藻生长的影响　
按表 1设计的 4因素 3水平正交试验 ,在光照培养箱中
培养。由表 2可知 ,第 7组试验小球藻长势最好 ,当 Na2 CO3
浓度低于 0.02 g/L时 ,小球藻生物量随 Na2 CO3浓度的升高
而增加 ,但超过 0.02 g/L时 ,小球藻的生物量又随之下降。
由此可知 ,较好的水平组合为 A3 B1C3D2 。比较 4个因素的极
差 R,发现影响小球藻生长因素的主次顺序为 B>C>A>D,
说明磷源浓度对小球藻生长的影响最大 ,其次是氮源浓度 。
表 2　正交试验及结果
Table2　 Orthogonalexperimentsandresults
序号SerialNo.
A(NaNO3)
B(KH2PO4)
C(MgSO4)
D(Na2CO3) OD680
1 1 1 1 1 0.109
2 1 2 2 2 0.097
3 1 3 3 3 0.079
4 2 1 2 3 0.109
5 2 2 3 1 0.081
6 2 3 1 2 0.064
7 3 1 3 2 0.115
8 3 2 1 3 0.056
9 3 3 2 1 0.079
R 0.012 0.037 0.019 0.011
3　结论
pH值是影响小球藻生长的重要因素 ,通过影响小球藻
光合作用强度而影响小球藻的生长。小球藻可以利用尿素
(下转第 16834页)
16764 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
2.3.3　最长叶片长度增长 、叶片数增加差异。李氏禾的最
长叶片长增长和叶片数增加在试验设定的 3个温度条件下
差异显著。其中 , 25 ℃时最长叶片生长速度 、叶片增加数明
显较快(0.18 mm/d, 0.23片 /d),自然温度下居中(0.10
mm/d, 0.11片 /d), 15℃时最慢(0.07 mm/d, 0.08片 /d)。
3　结论与讨论
3.1　高富集铬李氏禾种群的筛选　筛选试验中的 3个李氏
禾种群对 Cr3+具有较强的耐受能力 ,各组李氏禾生长状况良
好 。不同种类的重金属对李氏禾的毒性不同 ,培养期间 Cr3+
污染条件下生长的李氏禾生物量与对照相比无显著减少 。
各样品的地上部分重金属含量与地下部分之比平均值为
1.24>1,证明李氏禾对重金属 Cr3+有较强的转运能力。 3个
李氏禾种群对 Cr3+的富集能力均超过 1 000 mg/kg,符合超
富集植物的 3个特征 [ 10-12] ,其中 ,荔浦种群李氏禾富集特征
尤其明显 ,所以选定为后期试验对象。
3.2　光照强度对李氏禾生长的影响　光照强度对植物细胞
的增长和分化 、体积的增长和重量的增加有重要影响 ,在一
定范围内光合作用速率与光照强度呈正比 ,但达到一定强
度 ,若继续增加光强 ,光合作用速率不但不会增加 ,反而会下
降 [ 1] 。该试验时间为盛夏 ,光照强度较高 ,在透光率为 50%
和 100%的光照强度(5 000 ～10 000 lx)下 ,李氏禾出现 “光饱
和 ”甚至 “光抑制 ”现象 ,叶片生长缓慢或停滞。
3.3　温度对李氏禾生长的影响　任何一种生物 ,其生命活
动中每一生理生化过程都有酶系统的参与。然而 ,每一种酶
的活性都有它的最高温度 、最低温度和最适温度。在 15 ℃
条件下 ,李氏禾生长速度极为缓慢;在 25 ℃条件下 ,李氏禾
叶片显绿色 ,分蘖数多 ,分蘖后的新植株生长速度很快 ,为生
长的最适温度。这一研究结果与学者们对藻类的研究结果
基本一致 [ 13-14] 。
参考文献
[ 1] 李博.生态学[ M].北京:高等教育出版社, 2004:21-31.
[ 2] 王琪,马树庆,郭建平,等.温度对玉米生长和产量的影响 [ J].生态学
杂志, 2009, 28(2):255-260.[ 3] 王帆,严红 ,曲霞.水分、光照与硼互作对大豆生长发育及产量的影响
[ J].大连大学学报, 2006, 27(2):16-20.
[ 4] 毛炜光.水分和光照对厚皮甜瓜苗期植株生理生态特性的影响 [ J] .应
用生态学报 , 2007, 18(11):2475-2479.
[ 5] 刘春光.光照与磷的交互作用对两种淡水藻类生长的影响[ J].中国环
境科学 , 2005, 25(1):32-36.
[ 6] 于萍,张前前 ,王修林,等.温度和光照对两株赤潮硅藻生长的影响
[ J].海洋环境科学, 2006, 25(1):38-40.
[ 7] 姜宏波 ,董双林 ,包杰,等.温度和光照强度对鼠尾藻生长和生化组成
的影响 [ J] .生态学报 , 2009, 20(1):185-189.[ 8] 张学洪 ,罗亚平 ,黄海涛,等.一种新发现的湿生铬超积累植物———李
氏禾(LeersiahexandraSwartz)[ J].生态学报, 2006, 26(3):950-953.
[ 9] 陈俊,王敦球,张学洪 ,等.李氏禾修复重金属(Cr, Cu, Ni)污染水体的
潜力研究[ J].农业环境科学学报, 2008, 27(4):1514-1518.
[ 10] BENNICELLIR, STEZPNIEWSKAZ, BANACHA, etal.Theabilityof
Azolacarolinianatoremoveheavymetals(Hg(II), Cr(II), Cr(VI))
frommunicipalwastewater[J].Chemosphere, 2004, 55:141-146.
[ 11] BROOKSRR, LEEJ, REEVESRD, etal.Detectionofnickeliferous
rocksbyalysusofherbariumspeciesofindicatorplants[ J].JournalofGeochemicalExploration, 1977, 7:49-57.
[ 12] TORRESDEYJLG, VIDEAJRP, MONTESM, etal.Bioaccumula-
tionofcadmium, chromiumandcopperbyConvolvulusarvensisL.:im-
pactonplantgrowthanduptakeofnutritionalelements[J].Bioresource
Technology, 2004, 92:229-235.
[ 13] 张学成,孟振 ,时艳侠 ,等.光照、温度和营养盐对三株盐生杜氏藻生长
和色素积累的影响 [ J].中国海洋大学学报:自然科学版, 2006, 36(5):
756-762.
[ 14] 周洪琪, RENAUDSM,PARRYDL,等.温度对新月菱形藻、铲状菱形
藻和巴夫藻的生长、总脂肪含量以及脂肪酸组成的影响 [ J].水产学报 , 2002, 22(3):8-12.
(上接第 16764页)
作为氮源。研究表明 ,小球藻的优化培养基配方为:Na2CO3
0.02 g/L, NaNO3 2.0 g/L, KH2PO4 0.02 g/L, MgSO4 0.1 g/L,
尿素量为 0.8 g/L,接种量为 25%左右 ,环境条件为 pH
值 6.0。
参考文献
[ 1] WALTERTL,PURTONS, BECKERDK, etal.Microalgaeasbioreactor
[J].PlantCelRep, 2005, 24:629-641.
[ 2] MUNOZR, GUIEYSSEB.Algal-bacterialprocessesforthetreatmentof
hazardouscontaminants:areview[J].WaterRes, 2006, 40:2799-2815.
[ 3] VAISHAMPAYANA, SINHARP, HADERDP, etal.Cyanobacterial
biofertilizersinriceagriculture[ J].BotRev, 2001, 67:453-516.[ 4] SPOLAOREP,JOANNIS-CASSANC, DURANE, etal.Commercialappli-
cationsofmicroalgae[J].JBiosciBioeng, 2006, 101:87-96.
[ 5] GAVRILESCUM, CHISTIY.Biotechnology-asustainablealternativefor
chemicalindustry[J].BiotechnolAdv, 2005, 23:471-499.
[ 6] KAPDANIK, KARGIF.Biohydrogenproductionfromwastematerials[J].
EnzymeMicrobTechnol, 2006, 38:569-582.
[ 7] 胡月薇 ,史贤明.新食品资源小球藻的生理活性与保健功能 [ J].中国
食品学报, 2002, 2(2):69-72.[ 8] 于贞,王长海.小球藻培养条件的研究 [ J].烟台大学学报, 2005, 18(3):
206-211.
[ 9] 王波.不同营养盐对小球藻培养的影响 [ J] .现代渔业信息, 2006, 21
(5):11-16.
[ 10] BECKEREW.Measurmentofalgalgrowthinmicroalgaebiotechnology＆
microbiology[M].Cambridge:CambridgeUniversityPres, 1994:56-62.
[ 11] 余若黔,刘学铭,梁世忠,等.小球藻的异养生长特性研究[ J].海洋通
报, 2000, 19(3):57-62.
16834 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年