全 文 ：生物柴油是生物能源中的重要产品， 而原料严
重不足已成为制约其发展的关键环节 [1]。 为此， 人
们对各种产油生物的油脂合成和代谢途径进行广泛
的研究， 以期能为生产生物柴油提供大宗原料。 微
藻因具有光合效率高、 含油量丰富和生长周期短等
特点， 被认为是最有潜力替代石油的生物资源 [2]。
热带作物学报 2011， 32（11）： 2029-2036
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2011-09-29 修回日期： 2011-10-10
基金项目： 国家自然科学基金项目（No. 30860028、 No. 31000117）；； 中央级公益性科研院所基本科研业务费（No. ITBBZX0941） 海南省工程技
术研究中心专项（No. GCZX2011006）。
作者简介： 蔡佳佳（1987年—）， 男， 硕士研究生。 研究方向： 能源藻类分子遗传及生理生化。 *通讯作者： 邓晓东， E-mail： xiaodong9deng@hotmail.com。
元素缺乏和外加碳源对小球藻（Chlorella sp
KMMCCFC-21）生长和油脂积累的影响
蔡佳佳1，2， 费小雯3， 李亚军2， 胡新文1， 郭建春2， 邓晓东2 *
1 海南大学农学院， 海南海口 571101
2 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室 海南海口 571101
3海南医学院基础医学部， 海南海口 571101
摘 要 从海南本地水域分离得到一株高含油藻， 通过 18S rDNA 鉴定其为 Chlorella sp KMMCC FC-21。 将其
培养在高碳培养基 HSM 和低碳培养基 BG11 和 SE 以及它们相应氮元素、 硫元素和磷元素缺乏的培养基中， 研
究上述三种元素缺乏对其生物量和油脂积累的影响。 结果表明： 氮元素和硫元素缺乏使其生物量大幅减少， 但
却能促进其油脂的积累， 在高碳情况下其促进作用更加明显， 而磷元素的缺乏只能小幅增加其含油量。 在低碳
硫元素缺乏的 SE 培养基中分别添加 30 mmol/L 乙酸钠和 25 mmol/L 葡萄糖时 ， 其生物量分别提高了 200％和
160％， 其油脂含量分别提高了 120％和 72.7％。 在 HSM、 HSM-N、 HSM-P 和 HSM-S 培养基中细胞组分分析表
明： 氮元素、 硫元素和磷元素缺乏促进其细胞内油脂积累的同时却使总糖和总蛋白的含量减少， 此外也使叶绿
素含量和光合效率降低。
关键字 小球藻； 元素缺乏； 生物量； 油脂积累； 碳源； 光合效率
中图分类号 TQ225.18 文献标识码 A
Nutrien Elements Deficiency and Carbon Source Addition Affect on the
Growth and Lipid Accumulation in Chlorella sp KMMCC FC-21
CAI Jiajia1，2, FEI Xiaowen3, LI Yajun2， HU Xinwen1, GUO Jianchun2, DENG Xiaodong2
1 College of Agronomy, Hainan University, Haikou, Hainan, 571101, China
2 Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology, Ministry of Agriculture, Institute of Tropical
Bioscience andBiotechnology, ChineseAcademy of Tropical Agriculture Science, Haikou,Hainan, 571101, China
3 Hainan Medical College, Department of Basic Medicine, Haikou, Hainan, 571101, China
Abstract A high oil microalgae strain collected from Hainan was defined as Chlorella sp KMMCC FC-21 through 18S
rDNA identification in the research. This strain was grown in the high carbon medium HSM, low carbon medium BG11 and
SE, and their nitrogen(N), sulfur (S)and phosphorus (P) free medium respectively to study the effects of these three elements
deficiency on the biomass and oil accumulation. Results showed that N and S starvation led to dramatically increase in
cellular lipid content, especially in high carbon medium, which was accompanied by remarkable decrease of biomass.
However, the starvation of P could only give rise to slight increase of lipid content. When cultured in SE-S with 30 mmol/L
sodium acetate and 25 mmol/L glucose respectively, the corresponding biomass of Chlorella sp KMMCC FC -21 was
increased by 200% and 160% compared to those in SE-S, and the corresponding lipid content was increased by 120% and
72.7%. Moreover, the component of cells was also detected. The results indicated that cells grown in HSM-N, HSM-S and
HSM -P contained higher lipid content but lower total protein, total carbohydrate content, chlorophyll content and
photosynthesis efficiency comparing to the control.
Key words Chlorella vulgaris； Element restriction； Biomass； Lipid content； Carbon source； Photosynthetic efficiency
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2011.11.007
第 32 卷热 带 作 物 学 报
20 世纪 80 年代初， 美国国家可再生能源实验
室（NREL）联合多个单位对微藻资源进行调查和筛
选， 以期能找到适于生产生物柴油的优良藻株 [3]，
从硅藻和绿藻中筛选出了 300多种微藻， 其含油量
占生物量的一半以上。 除筛选优良藻种外， 利用分
子生物学对藻种进行遗传改良以提高其产油率也是
当前微藻产油研究的一大热点。 美国可再生资源国
家实验室通过现代生物技术所获得的一类 “工程小
环藻”， 在实验室培养可使油脂含量达 60％， 户外
培养也能达 40％[4]。 侯李君等构建 PEPC 基因的反
义载体转入聚球藻， 使反义 PEPC 聚球藻油脂合成
增加了 42.9％[5]。
小球藻为绿藻门（Chlorophyta）小球藻属（Chlorella）
的一种单细胞绿藻， 自然界广泛分布， 目前已知的
小球藻约有 15 种， 加上变种数目达上百种[6]。 小球
藻是一种富含油脂的微藻 [7]， 生长速度快， 被认为
是有可能成为生产生物柴油的重要藻株 [8]。 张正洁
等[9]在无菌条件下对影响自养小球藻生长的主要因
素进行了优化， 优化结果对小球藻生长有显著影
响 。 郑洪立等 [10]考察了 3 种无机碳源 （Na2CO3、
NaHCO3和CO2）及其初始浓度对小球藻产油特性的
影响， 发现 CO2是最佳无机碳源， 当 CO2浓度为
6％时， 小球藻生长最快， 生物量达 2.42 g/L， 产油
量最高达 0.72 g/L。 周玉娇等[8]通过紫外诱变使小球
藻的含油量提高了 24.58％。
本文通过研究氮、 磷和硫元素缺乏和外加碳源对
分离得到的小球藻 Chlorella sp KMMCCFC-21生物
量、 油脂积累、 糖、 蛋白、 色素以及光合效率的影
响， 为改良小球藻 Chlorella spKMMCCFC-21的培养
基， 同时提高其生物量和油脂积累含量提供参考。
1 材料与方法
1.1 藻株与培养基
实验藻株采自海口周边热带淡水水域， 通过平
板分离纯化获得， 藻株接种在 HSM固体培养基上
进行继代培养， 测定生理指标时则被接种到50mL的
BG11、 HSM和SE微藻培养基上， 根据其中碳含量， 将
BG11和SE归类为低碳培养基， 而HSM为高碳培养基。
为研究氮、 磷和硫元素缺乏对小球藻生长和油脂积
累的影响， 以此 3种常用培养基作基础， 对上述三
种元素进行限制， 根据微藻在高碳全元素培养基中
油脂积累量不明显但生物量却显著增加的情况， 设
计在低碳硫元素缺乏的 SE培养基中添加不同浓度
和种类的额外碳源， 以获得油脂积累和生物量最佳
的培养基配方。 微藻在恒温摇床以220 r/min， 26 ℃，
全日光照进行培养， 光照强度为110 μmol/m2·s（表 1）。
培养基名 成份 培养液/（mg/L） -N -P -S
BG11
NaNO3 250 172（NaCl） 250 250
K2HPO4·3H2O 40 40 13（KCl） 40
MgSO4·7H2O 75 75 75 16.5（MgCl2·H2O）
CaCl2·2H2O 36 36 36 36
Citric acid 6 6 6 6
FeC6H5O7 6 6 6 6
EDTA 1 1 1 1
NaCO3 20 20 20 20
SE
NaNO3 250 172（NaCl） 250 250
K2HPO4·3H2O 75 75 49（KCl） 500
MgSO4·7H2O 75 75 75 16.5（MgCl2·H2O）
CaCl2·2H2O 25 25 25 10
KH2PO4 175 175 96（KCl） 1 440
NaCl 25 25 25 720
FeCl3·6H2O 5 5 5 5
Fe-EDTA 10 10 10 10
A5+Co solution/ mL 1 1 1 1
A5 solution/ mL 1 1 1 1
表 1 本研究所涉及的培养基配方
2030- -
第 11期 蔡佳佳等： 元素缺乏和外加碳源对小球藻（ChlorellaspKMMCCFC-21）生长和油脂积累的影响
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
细
胞
干
重
/（
g/
L）
y = 1.099 2 x + 0.026 2
R2= 0.994
OD490
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
图 1 OD490与小球藻 KMMCCFC-21干重线性关系图
培养基名 成份 培养液/（mg/L） -N -P -S
SE
HSM
Sodium acetate（hydrate） 2 000 2 000 2 000 2 000
NH4Cl 500 546.7（NaCl） 500 500
MgSO4·7H2O 20 20 20 16.5（MgCl2·H2O）
CaCl2·2H2O 10 10 10 10
K2HPO4 1 440 1 440 1 234（KCl） 1 440
KH2PO4 720 720 163（KCl） 720
Trace/ mL 1 1 1 1
A5 solution/ mL 1 1 1 1
续表 1 本研究所涉及的培养基配方
1.2 油脂的测定
以尼罗红荧光法计算实验藻株的油脂含量[11-13]。
首先设置不同浓度的三酰甘油， 测定其荧光值， 制
作三酰甘油含量标准曲线。 再用终浓度为 0.1μg/mL
的尼罗红给藻细胞染色 10min， 使用 GloMax R-Multi
Detection System（Promega， USA） 测定其荧光值， 激
发光和发散光的波长分别为 470 nm 和 570 nm。 荧光
值的计算方法为FD（470/570） = （F2-F1）。 F2 为实验藻株
被尼罗红染色后所测的数值； F1 为染色前所测数
值。 细胞油脂含量计算公式为： y=0.000 4×FD（470/570）
－0.003 8， R2=0.999 2。
1.3 生物量的测定
微藻培养至一定浓度后取样， 用 ddH2O 进行
稀释， 用酶标仪（BIO-TEK Elx800）测定490 nm 波
长处各稀释样品的吸光值； 同时取各稀释样品测定
其干重， 并制作标准曲线（图 1）。
1.4 微藻总 DNA的提取
用改良 Glassbeeds 法提取微藻总 DNA[14]： 取
1.5 mL 处于对数生长期的微藻培养液， 9 000 r/min
离心 1 min收集沉淀。 150 μL无菌去离子水冰上重
悬细胞后加入 350 μL SDS-EB提取缓冲液（含 5 μL、
20 μg/μL RNase）和 0.1 g 酸洗玻璃珠（sigma）， 室温
下充分涡旋 15 min。 14 000 r/min 离心 5 min 后取
上清， 加入 500 μL 酚 ∶ 氯仿 ∶ 异戊醇（25 ∶ 24 ∶ 1）
抽提。 14 000 r/min 离心 10 min 后取上清 ， 加入
500 μL 氯仿 ∶ 异戊醇（24 ∶ 1）抽提。 14 000 r/min 离
心 10 min 后取上清， 加入 2 倍体积无水乙醇于冰
上沉淀 30 min。 再以 14 000 r/min 离心 10 min 后弃
上清， 加入 70％乙醇洗涤沉淀 2 次。 真空干燥后
用 40 μL TE 溶解沉淀， 通过 1％琼脂糖凝胶电泳
检测 DNA 分子质量。
1.5 18S rDNA 基因克隆及序列分析
采用降落 PCR方法扩增 1 078 bp 的 18S rDNA
基因部分片段。 PCR反应体系（25 μL）为 DNA 模板
2 μL， 引物各 1 μL， Taq polymerase 0.5 U， 10×Taq
Buffer 2.5 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL， DMSO 1μL
（Sigma）， 5 mol/L Betain 2.5 μL， ddH2O 13.1 μL。 上
游引物序列为： 5-CAGCMGCCGCGGTAATWC-3；
下游引物序列为 ： 5 -ACGGGCGGTGTGTRC-3。
PCR反应完成后利用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒
（Sangon）对目的基因片段进行回收纯化， 然后连接
到 p-MD18-T 质粒载体（Takara）上， 将其转化大肠
杆菌 DH5α并筛选阳性转化子进行测序， 测序由上
海生工完成。 通过 NCBI 搜索同源序列， 以 MEGA
软件进行聚类分析。
1.6 微藻总蛋白和总糖测定
取对数生长期实验株藻细胞离心， 无菌纯水重
悬， 按 10％的接种量各自接种到 HSM 系列培养基
（HSM、 HSM-N、 HSM-P和 HSM-S）中。
总蛋白的测定： 先取 5 mL 藻液， 5 000 r/min
离心 5 min， 去上清， 后加入 0.9％ NaCl， 冰浴破
碎 3 min， 定容至 10 mL， 再参照《生物化学实验》
中凯氏定氮法进行蛋白质测定， 消化待测样品， 然
后蒸馏， 最后进行滴定[15]。
总糖含量的测定： 测定前对微藻进行细胞破碎，
取 10mL培养物， 冰浴超声波破碎5min， 5 000 r/min
离心， 收集上清并定容至 15 mL， 参照《生物化学
实验》进行总糖测定 [15]。 葡萄糖浓度标准曲线y=
82.31 4×A+0.426 2， R2=0.9911（A表示在630 nm处读
取的吸光值）。
2031- -
第 32 卷热 带 作 物 学 报
1.7 叶绿素及光合效率的测定
叶绿素含量测定： 参照潘欣等 [16]的方法， 稍作
修改。 取 5 mL培养物， 5 000 r/m离心收集藻细胞，
弃上清， 加入 5 mL 80％丙酮， 用超声波破碎细胞 4
min， 暗处理 5 min， 10 000 r/min 离心 10 min 收集
上清， 并用 80％丙酮定容至 10 mL。 在波长为 663
nm 和 646 nm 下测定吸光值， 按 Lichtenthaler 公式
计算叶绿素含量[17]。
光合效率测定： 通过 Oxygraph 型液相氧电极
（Hansatech Instruments Ltd., UK）， 测定样品含氧
量和氧气变化率。 测定前向样品通入一定量氮气，
使样品饱和氧含量降到 50％。 黑暗条件下 5 min 记
录耗氧效率以测定呼吸作用。 通过调节光源形成不
同光照强度， 样品在每个光照强度下光照 3 min，
记录放氧效率， 测定光合作用。 光合效率为光饱和
时相应的放氧效率加上耗氧效率[18]。
2 结果与分析
2.1 实验藻株的 18S rDNA结果
实验藻株31.2-7 的 18S rDNA通过 NCBI blast
搜索同源序列并进行聚类分析后的结果表明， 实验
藻株31.2-7 与 Chlorella sp（KMMCC FC-21）的 18S
rDNA 基因的相似度为 99％， 因此确定实验藻株
31.2-7为 Chlorella sp KMMCCFC-21。
2.2 不同培养基中 Chlorella sp KMMCCFC-21
的生长曲线和油脂积累情况
Chlorella sp KMMCCFC-21藻株在 HSM 和 SE
培养基中的最大生物量分别为 （0.77±0.02）g/L和
（0.63±0.05）g/L， 均显著高于 BG11 培养基中的
（0.28±0.01）g/L（p<0.01）， 而当培养基中元素缺乏
时， 小球藻的生物量大幅下降， 尤其是在氮元素和
硫元素缺乏时。 在 BG11-N、 BG11-S 中， 小球藻
的最大生 物量分别比 对照组下降 了 72.3％ 、
74.7％， 在SE -N 和 SE-S 中最大生物量的降幅更
是达到 88.8％和 85.9％， 而在 HSM-N 和 HSM-S
中最大生物量的降幅为 64.3％和 54.9％， 显著小于
上述两组的降幅 （p<0.01）。 而磷元素在 BG-P 和
HSM-P 中降幅则为 51.1％和 43.5％。 上诉结果说
明元素缺乏在高碳情况下， 藻株的最大生物量降幅
要显著低于在低碳情况下（p<0.01）， -N 和-S 对藻
株生长的抑制作用要大于-P（图 2）。
由图 2还可看出， 油脂积累方面， Chlorella sp
KMMCCFC-21在 HSM 培养基中油脂含量最大， 为
10.4％， 其次是 BG11， 为10.3％， 而在 SE 培养基
细
胞
干
重
/（
g/
L）
0 2 4 6 8 10
时间/d
0.6
0.2
0.15
0.10
0.05
0
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
油
脂
含
量
/（
g/
g）
0 2 4 6 8 10
时间/d
B-1 B-2
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
细
胞
干
重
/（
g/
L）
0 2 4 6 8 10
时间/d
0 2 4 6 8 10
时间/d
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
油
脂
含
量
/（
g/
g）
A-1 A-2BG11
BG11-N
BG11-P
BG11-S
BG11
BG11-N
BG11-P
BG11-S
2032- -
第 11期
中的含油量最少， 为 9.5％。 当培养基中元素缺乏时，
油脂积累量就发生了明显变化。 缺乏的元素不同，
油脂积累情况也不相同， 其中最显著的是氮元素缺
乏， HSM-N 培养基中 ， 油脂含量占细胞干重的
47.2％， 比对照提高了 350％； 在 SE-N 中， 油脂
含量提高了 320％， 在 BG-N 中油脂含量提高了
300％。 其次是硫元素缺乏， 在 HSM-S 培养基中，
油脂含量占细胞干重的 40.3％， 比对照组提高了
340％； 在 SE-S 中， 油脂含量提高了 300％， 在
BG-S 中含油量则提高了 240％。 而 Chlorella sp
KMMCCFC-21藻株在 HSM-P、 SE-P 和 BG-P 中油
脂含量比各自的对照组分别提高了 78.8％、 71.9％
和 70.0％。 上述数据显示， -N 和-S 能显著地促进
藻株的积累， 相较而言， -P 只能小幅提高藻株的
含油量， 同时， 在高碳情况下， 元素缺乏对实验藻
株油脂积累的促进作用更明显。
2.3 Chlorella sp KMMCCFC-21在 HSM、 HSM-
N、 HSM-S和 HSM-P中油脂、 总蛋白和总糖的含
量
因进行总蛋白、 总糖、 叶绿素和放氧效率的测
定需要一定的生物量， 而藻株在 HSM、 HSM-N、
HSM-P 和 HSM-S 中的生物量较符合测定需求， 测
定结果也较准确， 因而将接种到 HSM、 HSM-N、
HSM-P 和 HSM-S 中培养至第 8 天的实验藻株为对
象， 测定其油脂、 总蛋白和总糖含量（表 2、 图 3）。
结果表明， 与 HSM 培养基相比， 实验藻株在氮元
素和硫元素缺乏培养基中大量积累油脂时， 而总糖
和总蛋白的含量却在降低， 其中在-N 时总糖的含
量比对照组降低了 41.6％， 总蛋白的含量比对照组
培养基名 油脂/％ 总蛋白/％ 总糖/％ 其它/％
HSM 9.19 A 48.88 37.35 4.58
HSM-N 43.43 B 30.89 21.81 3.87
HSM-P 18.18 C 42.77 35.65 3.40
HSM-S 40.27 D 32.56 27.22 1.95
表 2 Chlorella sp KMMCCFC-21 在 HSM 缺氮、 缺硫
和缺磷培养基中油脂、 总蛋白和总糖的含量
说明： 1、 其它是指除了油脂、 总蛋白和总糖以外的藻细
胞内其它物质； 2、 a、 b、 c 和 d 代表显著差异（p<0.01）。 下同。
左图为小球藻在显微明场下的图片； 右图为在显微暗场下的图片。 使用 Nikon 80i， 放大倍数 40×10。
图 3 Chlorella sp KMMCCFC-21 藻株在 HSM-N 中培养至第 8 天油脂的荧光分析
（A）Chlorella sp KMMCCFC-21在BG11、BG11-N、BG11-P和 BG11-S中的生长情况以及油脂占细胞干重的百分比 ； （B）Chlorella sp
KMMCCFC-21在SE、 SE-N、 SE-P和 SE-S中的生长情况以及油脂占细胞干重的百分比； （C）Chlorella sp KMMCCFC-21在 HSM、 HSM-N、
HSM-P 和 HSM-S 中的生长情况以及油脂占细胞干重的百分比。 ﹡表示差异显著（p<0.05），﹡﹡表示差异极显著（p<0.01）。
图 2 Chlorella sp KMMCCFC-21在 BG11、 SE 和 HSM 及相应缺氮、 缺磷
和缺硫培养基中的生长曲线以及油脂占细胞干重的百分比
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10
时间/d
细
胞
干
重
/（
g/
L）
0 2 4 6 8 10
时间/d
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
油
脂
含
量
/（
g/
g）
C-1 C-2
蔡佳佳等： 元素缺乏和外加碳源对小球藻（ChlorellaspKMMCCFC-21）生长和油脂积累的影响 2033- -
第 32 卷热 带 作 物 学 报
降低了 36.8％， 在-S 时， 总糖的含量比对照组降
低了 27.1％ ， 总蛋白的含量比对照组降低了
23.2％， 在-P时， 藻株油脂含量小幅增加的同时总
糖和总蛋白的含量比对照组有所减少。
从表 3可见， 元素缺乏时， 微藻的叶绿素含量
显著降低， 尤其是在-N 的情况下（p<0.01）， 叶绿
素 a 的含量仅为原来的 4％。 在-P 和-S 情况下，
叶绿素的含量都有不同程度的降低。 同时， 微藻的
光合效率也受到了影响， 均低于对照组。
2.4 缺硫 SE培养基中额外添加乙酸钠和葡萄糖对
Chlorella spKMMCCFC-21生物量和油脂积累的影响
乙酸钠和葡萄糖是微藻培养常用的碳源， SE培
养基是碳浓度极低的培养基， 在此培养基中添加乙
酸钠和葡萄糖， 能更加清晰地展现外加碳源对微藻
生物量和油脂积累的影响， 而 HSM 本身就是高碳
培养基， 小球藻在 SE-S 中的生物量比在 BG11-S
中更低一些。 因此以 SE-S为基础培养基进行改良。
当乙酸钠和葡萄糖的浓度分别达到 30 mmol/L
和 25 mmol/L， 培养至第 8 天时 ， Chlorella sp
KMMCCFC-21 藻株生物量和油脂含量均达到最大
值， 与对照组比较 ， 当乙酸钠浓度为 30 mmol/L
时 ， 其生物量和油脂含量分别提高了 200％和
120％， 当葡萄糖浓度为 25 mmol/L 时， 其生物量
和油脂含量分别提高了 160％和 72.7％。 当乙酸钠
和葡萄糖的浓度分别超过 30 mmol/L 和 25 mmol/L，
其生物量和油脂含量则降低。 说明在元素缺乏情况
下， 外加碳源能在一定范围内促进微藻生物量的增
加和油脂的积累（图4）。
A-1 A-2
B-1 B-2


0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 2 4 6 8
时间/d
细
胞
干
重
/（
g/
L）
0 mmol/L
7 mmol/L
15 mmol/L
30 mmol/L
60 mmol/L
0 2 4 6 8
时间/d


0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
油
脂
含
量
/（
g/
g）
0 mmol/L
7 mmol/L
15 mmol/L
30 mmol/L
60 mmol/L


细
胞
干
重
/（
g/
L）
0 2 4 6 8
时间/d
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 mmol/L
25 mmol/L
50 mmol/L
100 mmol/L
200 mmol/L


油
脂
含
量
/（
g/
g）
0 2 4 6 8
时间/d
0 mmol/L
25 mmol/L
50 mmol/L
100 mmol/L
200 mmol/L
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
（A）Chlorella spKMMCCFC-21在添加不同浓度乙酸钠 SE-S培养基中生长情况及油脂占细胞干重的百分比； （B）Chlorella spKMMCCFC-21在添
加不同浓度葡萄糖 SE-S培养基中生长情况及油脂占细胞干重的百分比。 “﹡” 表示差异显著（p<0.05），“﹡﹡” 表示差异极显著（p<0.01）。
图 4 Chlorella spKMMCCFC-21在添加不同浓度乙酸钠和葡萄糖 SE-S培养基中的的生长曲线以及油脂占细胞干重的百分比
培养
基名
叶绿素
a/（μg/mL）
叶绿素
b/（μg/mL）
光合效率/[(μmol O2/mg
chla·h) /(μmol photon/m2·s)]
HSM 13.70 A±1.30 4.72±0.14 1.67a±0.01
HSM-N 0.54 B±0.02 0.21±0.07 1.55b±0.03
HSM-P 2.21 C±0.07 0.73±0.02 1.40c±0.06
HSM-S 1.71 D±0.04 0.65±0.01 1.02d±0.10
表 3 Chlorella sp KMMCCFC-21 在 HSM 缺氮、 缺硫
和缺磷培养基中叶绿素的含量和光合效率
2034- -
第 11期
从表 4可知， 藻株的叶绿素含量和光合效率在
一定范围内随着乙酸钠和葡萄糖浓度的升高而升
高， 叶绿素和光合效率的变化趋势与其生物量和油
脂含量的变化趋势较为一致。
3 讨论
微藻作为未来制备生物柴油的优良原料日益受
到关注。 本文研究了 N、 P 和 S 缺乏及外加碳源对
从海南本地分离得到的小球藻的生物量和油脂积累
情况的影响， 同时分析了其总糖、 总蛋白和油脂含
量。 实验结果表明， Chlorella sp KMMCCFC-21 藻
株在高碳培养基 HSM 的最大生物量显著高于在低
碳培养基 BG11 和 SE 中的， 说明高碳培养基有利
于微藻的生长。 这可能是由于微藻可以同时利用空
气中的二氧化碳和高碳培养基中的乙酸钠进行兼养
生长。 而当元素缺乏时， 微藻的生物量急剧下降，
Chlorella sp KMMCCFC-21 藻株在 SE 培养基中最
大生物量为（0.63±0.05）g/L， 而在 SE-N 中则降至
原来的 1/10。 微藻在正常培养基中也会积累一定
量油脂， 结果显示， 在高碳培养基 HSM 中， 微藻
的含油量为 10.4％， 在 SE 和 BG11 也分别达到
9.5％和10.3％， 说明微藻在生长状况良好的情况下
并不会大量积累油脂， 它可能将光合作用固定的能
量和合成的产物用于生长。 而当培养基中营养元素
缺乏时， 微藻开始大量积累油脂， 尤其是在氮素和
硫元素缺乏时。 在低碳培养基 BG11 和 SE 中， 氮
素缺乏分别使藻株的油脂含量提高了 300％和
320％， 硫元素缺乏分别使微藻的含油量提高了
240％和300％。 而在高碳培养基 HSM 中， 氮素缺
乏可使 Chlorella sp KMMCCFC-21 藻株中的油脂
含量提高 350％， 硫元素的缺乏也可使其油脂含量
提高 340％。 众多研究认为， 氮缺乏会导致微藻油脂
的积累[19-20]。 核蛋白小球藻（Chlorella pyrenoidosa）[21]
和隐甲藻（Crypthecodinium cohnii） [22]在氮元素缺乏
时油脂含量增加。 Otsuka在对小球藻（Chlorella sp.）
进行硫酸盐缺乏培养时发现其总脂质含量提高 [23]，
与本实验结果相符。 这可能是因为元素缺乏对微藻
来说是一种环境胁迫， 它刺激微藻启动了抗逆生理
反应， 即通过过量积累油脂来渡过不利环境。 元素
缺乏在高碳情况下， 微藻通过吸收培养基中的乙酸
钠作为碳源， 经乙醛酸途径生成乙酰辅酶 A， 为油
脂合成提供原料， 而在元素缺乏培养基中， 微藻的
光合作用受到抑制， 加上低碳培养基中无其它碳
源， 碳源来源减少， 因而这可能是造成微藻在低碳
元素缺乏培养基中合成的油脂量小于在高碳元素缺
乏培养基中的原因。
细胞组分测定结果表明， 在 HSM-N 和 HSM-S
培养基中， 当藻细胞开始积累油脂的同时， 细胞内
总糖和总蛋白的含量则下降， N 和 S 是蛋白质的主
要组分， 二者的缺乏会使细胞内蛋白质的合成受到
影响， 进而影响参与光合作用的重要蛋白和酶类的
含量， 使藻细胞的光合作用受到抑制， 糖类的合成
也受到影响， 因而碳流向会更多地向油脂合成倾
斜。 叶绿素含量和光合效率的测定结果表明， 元素
缺乏使藻株的叶绿素含量和光合效率降低， 这正好
验证了元素缺乏对微藻光合作用产生不利影响。
前期试验表明， 外加碳源能促进微藻生长， 符茹
等[24]在培养三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）
时添加乙酸钠促进了其生物量和油脂的增加， 而硫
元素缺乏促进微藻积累油脂。 本文针对碳源的种类
和浓度梯度设计实验以优化微藻的培养基来达到既
保证微藻大量积累油脂又获得较大生物量的目的。
培养基名 叶绿素 a/（μg/mL） 叶绿素 b/（μg/mL）
光合效率/[(μmolO2/mg
chla·h)/(μmolphoton/m2·s)]
乙酸钠浓度
/（mmol/L）
0 2.54±0.10 1.22±0.11 1.03±0.02
7 2.56±0.07 1.26±0.03 1.09±0.01
15 2.94±0.14 1.03±0.04 1.12±0.10
30 3.31±0.09 1.71±0.05 1.30±0.12
葡萄糖浓度
/（mmol/L）
0 2.54±0.14 1.22±0.24 1.03±0.02
25 3.03±0.01 1.69±0.02 1.18±0.26
50 2.75±0.03 1.13±0.05 1.15±0.02
100 2.63±0.04 1.07±0.14 1.08±0.03
200 2.57±0.05 1.23±0.05 1.05±0.23
60 3.20±0.13 1.59±0.11 1.27±0.14
表 4 SE-S 额外添加乙酸钠和葡萄糖对 Chlorella sp KMMCCFC-21 藻株叶绿素和光合效率的影响
蔡佳佳等： 元素缺乏和外加碳源对小球藻（ChlorellaspKMMCCFC-21）生长和油脂积累的影响 2035- -
第 32 卷热 带 作 物 学 报
以低碳 SE-S 培养基为基础， 额外添加乙酸钠和葡
萄糖时， 藻株的生物量和油脂积累量在一定范围内
随着二者浓度的增加而增加， 当添加 30 mmol/L 乙
酸钠培养至第 8天， 其生物量和油脂含量分别提高
了 200％和 120％， 当葡萄糖浓度为 25 mmol/L 时，
其生物量和油脂含量分别提高了 160％和 72.7％。
而超过此浓度， 生物量和油脂含量则都降低。 从表
4 可知， 添加碳源也能促进叶绿素含量和光合效率
的提高。 其原因可能是微藻利用培养基中的乙酸钠
经乙醛酸循环生成乙酰辅酶 A， 至于葡萄糖， 微藻
将其作为直接碳源， 经糖代谢途径生成乙酰辅酶
A， 而乙酰辅酶 A 进入三羧酸循环， 其中间代谢产
物琥珀酰辅酶 A 是叶绿素 a 生物合成的原料之一，
其具体过程为琥珀酰辅酶 A 和甘氨酸缩合成 δ-氨
基乙酰丙酸， 两个 δ-氨基乙酰丙酸缩合成吡咯衍
生物胆色素原， 然后再由 4个胆色素原聚合成一个
卟啉环──原卟啉Ⅳ， 原卟啉Ⅳ是形成叶绿素和亚
铁血红素的共同前体， 与亚铁结合就成亚铁血红
素， 与镁结合就成镁原卟啉。 镁原卟啉再接受一个
甲基， 经环化后成为具有第Ⅴ环的原脱植醇基叶绿
素， 后者经光还原、 酯化等步骤而形成叶绿素 a。
随着外加碳源浓度的升高， 其合成的叶绿素也相应
增多， 但是当外加碳源达到一定浓度后， 其叶绿素
含量反而随着浓度的升高而降低， 这可能是叶绿素
合成存在反馈调节。 随着叶绿素的增多， 微藻的光
合效率也会随之升高， 此外碳源的加入也会促使微
藻细胞代谢的总水平提高从而使细胞的光合放氧速
率有显著的提高。 汪晶等 [25]在研究有机碳源对转
hTNF2α 基因聚球藻生长和光合作用的影响时发
现， 在混合营养培养条件下添加有机碳源与光自养
培养相比， 有机碳源的加入使藻的最大净光合放氧
速率提高了近 1倍， 该结果与本文的结果一致， 但
是其提高的幅度也是有限的。 综上所述， 在元素缺
乏情况下添加碳源是同时提高微藻生物量和油脂积
累量的一种可行手段， 并且使用乙酸钠的效果要优
于葡萄糖， 同时也为改良微藻培养基提供了一个新
视角。
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责任编辑： 叶庆亮
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