全 文 ：收稿日期:2004-02-18;修订日期:2004-03-16
基金项目:教育部留学归国人员基金(2003),江苏省教育厅自然基金资助(2003)
作者简介:李建宏(1963—),男 ,浙江温岭人;博士;研究方向:微藻生理生化
Cd2+胁迫条件下椭圆小球藻的生理应答
李建宏　浩云涛　翁永萍
(南京师范大学生命科学学院 ,南京　210097)
摘要:研究了一株高重金属抗性的椭圆小球藻在 Cd2+胁迫下的生理变化 , 结果显示 , 在 10—240μmol/L浓度的 Cd2+
胁迫下 , 随着金属离子浓度提高 , 叶绿素的总量减少 , 光合放氧受到抑制。 Cd2+离子浓度的提高 , 导致了氧自由基
的大大增加 ,同时脯氨酸 、SOD(超氧化物歧化酶)以及 POD(过氧化物酶)水平均大大提高。结果提示这些与消除自
由基有关的代谢产物的积累 ,有利于细胞减少胁迫造成的损伤。CAT(过氧化氢酶)对 Cd2+离子是敏感的 , 其活性
与胁迫浓度呈负相关。
关键词:小球藻;镉;自由基;SOD;POD
中图分类号:Q94　　文献标识码:A　　文章编号:1000-3207(2004)06-0659-05
　　重金属是重要的环境污染物质 ,重金属排放导
致的水环境恶化正日益加剧 ,探寻有效去除重金属
污染的方法已为很多研究者所关注 。微藻具有富积
重金属离子的特性 ,利用藻类修复重金属污染的水
体已受到关注 ,利用微藻净化含重金属废水具有一
定的应用前景。小球藻对环境的适应能力较强 ,易
于批量培养 。一些早期研究证明 ,小球藻具有良好
的选择富积重金属的能力 ,可用于含重金属废水的
净化。从电镀废水中分离到的一株椭圆小球藻 ,对
重金属有较高的耐受性 ,对Cd2+、Cu2+、Zn2+和 Ni2+
离子都有很好的吸附去除能力[ 1] ,研究其在重金属
胁迫条件下的生理应答机制 ,探索其抗重金属的机
理 ,可为将其更好地运用于重金属废水的处理提供
参考依据 。
有关动物研究的结果表明 ,重金属胁迫可诱导
活性氧产生导致氧化伤害[ 2] 。对微藻在重金属胁迫
条件下 ,谷胱苷肽的代谢及抗氧化的作用也有一些
报道[ 3 ,4] ,但对于其他相关的酶尚未见深入研究 。
本研究主要从 SOD 、POD等方面 ,研究 Cd2+离子胁
迫条件下小球藻的生理反应。
1　材料与方法
1.1　藻种及培养方法　椭圆小球藻(Chlorella ellip-
soidea)由本研究组分离获得。所用基本培养基为
BG-11。藻种预培养 3d 接入含有 200mL 培养液的
500mL 烧瓶中 ,接种浓度为 OD560nm0.1左右 。两支
40W日光灯于培养瓶两侧提供连续光照 ,室温下静
置培养 72h ,每天定时摇动数次 。依实验设置加入
不同浓度的 CdCl2。
1.2　叶绿素含量及叶绿素 a和 b 比值的测定　用
N ,N-二甲基甲酰胺法提取测定叶绿素[ 5] 。所有测
定均重复 3 次 ,所得结果为 3次测定的平均值(下
同)。
1.3　光合速率的测定　参照李德耀等的薄膜氧电
极法[ 6] 。
1.4　脯氨酸含量的测定　参照 Bates 等的方法测
定[ 7] 。藻细胞用 3%磺基水杨酸为介质 , 经 GAS-
COL 型挤压式细胞破碎仪(美国 Bio-RAD)破碎提取
后测定 。
1.5　O-2 含量的测定　参照王爱国和罗广华的方
法[ 8] ,采用南京建成生物工程研究所活性氧测定试
剂盒测定O-2 相对含量。
1.6　SOD特性鉴定和活性的测定　离心收集的藻
体 ,用 0.1mol/L、pH7.8的磷酸缓冲液重悬浮 。挤压
破碎仪破碎细胞 。破碎液 4℃下 10 000r/min 离心
30min ,上清液即为粗酶液用以测定(下同)。
参照罗广华等的方法[ 9]用聚丙烯酰胺凝胶电泳
法测定 。SOD活性采用南京建成生物工程公司超氧
化物岐化酶(SOD)试剂盒进行测定。
1.7　POD活性的测定　参照 Maehly的愈创木酚氧
第 28卷　第 6 期 水 生 生 物 学 报 Vol.28 , No .6
2 0 0 4 年 1 1 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA Nov ., 2 0 0 4　
化法测定[ 10] 。
1.8　CAT活性的测定　采用南京建成生物工程公
司过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒测定。
2　结果
2.1　Cd2+胁迫对椭圆小球藻叶绿素的影响
培养藻的叶绿素含量明显受到 Cd2+的影响 ,总
叶绿素含量与 Cd2+浓度呈显著的负相关(R =
-0.94 , P<0.01)。但低浓度Cd2+对叶绿素的合成有
一定的刺激作用。培养 72h后 ,叶绿素 a在 10μmol/L
Cd2+作用下含量有所增加 ,比对照提高了 30%。虽
然叶绿素 b的含量有所下降 ,但总叶绿素的量略有提
高。随着Cd2+浓度的进一步增大 ,叶绿素的生物合
成受阻 ,含量一直呈下降趋势 ,经 240μmol/L Cd2+处
理的总叶绿素和叶绿素 a 含量已分别降为对照的
26.01%和 34.70%。叶绿素 b含量随 Cd2+浓度增加
而迅速下降 。叶绿素 a/b值经Cd2+处理后均高于对
照组 ,说明叶绿素b对 Cd2+更为敏感 。
综合上述结果可见 ,在 0—240μmol/L 的浓度范
围内 ,对椭圆小球藻有明显的胁迫毒害作用 ,并且显
示出剂量相关效应 ,因此在下面的实验中均选择该
浓度范围进行实验。
2.2　Cd2+胁迫对椭圆小球藻光合速率的影响
用薄膜氧电极测定藻细胞的光合放氧速率。结
果显示 ,在 Cd2+胁迫下 ,藻细胞的光合作用受到明
显抑制 ,光合放氧速率随 Cd2+浓度的增加而逐渐降
低 ,两者间呈极显著的负相关(R =-0.91 , P <
0.01)。在 10μmol/L 低 Cd2+浓度下 ,虽然总叶绿素
合成增加 ,但并未提高光合作用能力 ,光合放氧速率
为对照的 83.62%, 当 Cd2+浓度增大到 240μmol/L
时 ,仅为对照的 31.01%。
2.3　Cd2+胁迫对椭圆小球藻脯氨酸含量的影响
比较不同浓度 Cd2+处理 72h后椭圆小球藻脯
氨酸含量的变化(图 1),随着 Cd2+浓度的加大 ,藻细
胞内脯氨酸含量也相应地增高 。在 0—120μmol/L
范围内脯氨酸含量与 Cd2+浓度显著正相关(R =
0.83 , P<0.01),10μmol/L时已是对照组的 1.89倍 ,
120μmol/L 时达到对照组的 2.86 倍。 240μmol/L
Cd2+处理组含量虽略有回落 ,但仍高于对照 , 为对
照的 2.33倍 。脯氨酸含量的变化常作为植物逆境
生理的一个指标 ,其含量的增加有利于保持原生质
与环境的渗透平衡 ,抵御 Cd2+的影响。
2.4　Cd2+胁迫对椭圆小球藻 O-2 含量的影响
　　不同浓度Cd2+处理下 ,藻细胞的O-2 含量发生
图 1　不同浓度 Cd2+对脯氨酸含量的影响
Fig.1　Effect of different Cd2+ concentration on proline content
显著变化(图 2), 随着 Cd2+浓度的增加而增加 ,
90μmol/L时达到最高值(R =0.97 , P <0.01),为对
照组的 2.07 倍 , 120μmol/L 和 240μmol/L 时虽略有
下降 ,但仍分别相当于对照组的 1.85倍和 1.63倍。
Cd
2+胁迫造成了藻细胞内 O-2 含量的剧升 ,从而影
响细胞的正常生理代谢活动 。
图 2　不同浓度Cd2+对O -2 含量的影响
Fig.2　Effect of different Cd2+concentration on O-2 Content
2.5　Cd2+胁迫对椭圆小球藻 SOD活性及同工酶谱
的影响
　　聚丙烯酰胺凝胶电泳可以清楚地显示椭圆小球
藻具有4条SOD同工酶带(图3),它们均可被氯仿-乙
图 3　椭圆小球藻 SOD同工酶的电泳鉴定
Fig.3　Patterns of SOD isozymes in C.ellipsoidea on.polyacrylamide
gel electropherograms
1.KCN;2.对照;3.氯仿-乙醇;4.H2O2
660　 水　　生　　生　　物　　学　　报 28卷
醇所抑制 ,但是又都对 KCN不敏感 ,四条带中迁移
速率最快的一条带又可被 H2O2 抑制 ,为 Fe-SOD。
其余三条带则不被抑制 ,均为Mn-SOD[ 9] 。
SOD酶是生物体内重要的保护酶之一 ,可有效
清除生物体内的氧自由基 。图 4表明 , Cd2+浓度低
于90μmol/L 时 ,总 SOD活性较对照略有下降 ,随后
开始上升 ,至 120μmol/L 时达到最高值(R =0.77 ,
P <0.05),为对照的 130%。可能是由于在 Cd2+胁
迫下 ,藻细胞内可能产生较多氧自由基 ,诱导了 SOD
酶活性的增加 ,以抵御和适应逆境 。
图 4　不同浓度 Cd2+小球藻对 SOD活性的影响
Fig.4　Effect of different Cd2+ concent ration on SOD activity
取等克鲜重的椭圆小球藻粗酶液通过聚丙烯酰
胺凝胶电泳(图 5),可以清楚显示在 Cd2+的影响下 ,
椭圆小球藻的同工酶带发生了改变。经过不同浓度
Cd2+处理后 ,四条带中迁移速率最快的 Fe-SOD同工酶
带均消失 ,而另三条Mn-SOD同工酶的量略有增加。
图 5　不同浓度 Cd2+对小球藻 SOD同功酶条带的影响
Fig.5　Effects of different Cd2+concentration on SOD isozymes bands;条带
1—6自左向右依次为240—10μmol/ L Cd2+处理样本;7.为对照组
2.6　Cd2+胁迫对椭圆小球藻 POD活性的影响
POD是一种卟啉环含铁蛋白酶 ,其主要功能是
减轻有机氢过氧化物对机体的伤害 ,其活性的应激
性变化被广泛作为反映植物受逆境胁迫程度的一个
重要指标。图 6所示为不同浓度 Cd2+处理 72h 后
POD的活性 ,由图可见 ,藻细胞 POD活性强烈地受到
Cd
2+的诱导 ,10μmol/L 时就提高了 71%。随着 Cd2+
浓度的增高 ,POD活性大幅度上升 ,至 90μmol/L 达到
最高值 ,为对照的 4.84倍 ,在此范围内 POD 活性与
Cd2+浓度呈极显著的正相关(R =0.97 , P <0.01)。
之后 POD 活性略有下降 , 但是仍远高于对照 ,
120μmol/L和 240μmol/L时分别为对照组的 4.10倍
和 3.63倍 。
图 6　不同浓度 Cd2+对 POD活性的影响
Fig.6　Effect of different Cd2+ concentration on POD activity
2.7　Cd2+胁迫对椭圆小球藻过氧化氢酶(CAT)活
性的影响
　　CAT 是植物细胞内另一个重要的抗氧化酶 ,其
主要功能也是清除细胞内过量的过氧化氢 。与
POD 、SOD不同的是 , 随着 Cd2+处理浓度的升高 ,
CAT活性不断下降(图 7),30μmol/L 时为对照组的
64.96%,90μmol/L 时降到最低 , 仅达到对照组的
23.36%,CAT活性与 Cd2+浓度呈极显著的负相关
(R=-0.71 , P<0.01)。
图 7　不同浓度 Cd2+对 CAT 活性的影响
Fig.7　Effect of diff erent Cd2+concentration on CAT activity
3　讨论
10μmol/L Cd2+引起了藻细胞叶绿素含量的增
加 ,可能是由于低浓度 Cd2+在一定程度上刺激了藻
体叶绿素的生物合成。随着Cd2+浓度的继续升高 ,
叶绿素含量呈不断下降的趋势。镉导致叶绿素含量
下降与镉抑制叶绿素酸酯还原酶和影响氨基-γ-戊
6期 李建宏等:Cd2+胁迫条件下椭圆小球藻的生理应答 661　
酮酸的合成有关[ 11] ,也可能是镉直接破坏了叶绿体
结构及功能和干扰植物对营养元素的吸收 、转
移[ 12] 。镁是组成叶绿素正常结构所必需的元素 ,在
Cd2+胁迫下 ,藻细胞对Mg2+的吸收和运输受到干扰
和影响 , 同时 Cd2+进入藻细胞后可能直接竞争
Mg2+的结合位点或与叶绿体蛋白质的巯基相结合 ,
使其失活 。测定叶绿素 400—700nm 范围内的吸收
光谱发现 ,实验中经过不同浓度 Cd2+处理的叶绿素
吸收峰值与对照组相一致 ,而并未发生明显的漂移
现象(数据未列出),表明 Cd2+并不是通过这种机制
影响藻体叶绿素的结构。单细胞藻类通过光合作用
将光能转化为化学能 ,是保证其进行正常生理代谢
的能量基础 ,光合色素含量的降低必然导致其光合
作用能力的下降 ,从而抑制藻细胞的生长。伴随着
叶绿素含量的降低 ,椭圆小球藻的光合速率也与
Cd
2+浓度呈极显著的负相关 ,随着 Cd2+浓度的增大
相应降低 。
逆境胁迫导致生物体内产生大量的活性氧。实
验结果显示 ,随着 Cd2+浓度的增高 ,藻细胞的 O-.2
含量也不断地上升 。McCord 和 Fridovich[ 13] 提出的
自由基伤害学说 ,已广泛用于需氧生物抗逆境伤害
机理的研究 。在逆境条件下 ,植物体内 O-.2 、OH·、
1O2 等自由基产生的 H2O2 含量增加 ,过量的自由基
与质膜和生物大分子反应 ,导致脂质过氧化 ,蛋白质
降解 ,DNA突变 ,对生物体造成伤害。然而 ,生物体
在正常的代谢过程中 ,可通过酶促和非酶促保护系
统 ,使自由基的产生和消除维持动态平衡。植物体
内的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过
氧化氢酶(CAT)等抗氧化保护酶系统能清除逆境胁
迫所诱导产生的过多的自由基 ,保护细胞免受伤
害[ 14] 。实验结果表明 , Cd2+胁迫使藻细胞 SOD 、
POD活性上升 ,其中 POD活性上升幅度更为显著 。
SOD具有清除 O-.2 的能力 ,它能催化 O-.2 发生歧化
反应:2O-.2 +2H+→H2O2+O2 ,从而清除植物体内的
O-2 。POD则能清除细胞内过多的 H2O2 等过氧化
物 ,保护细胞的膜结构。两者在 Cd2+胁迫下活性相
应的升高 ,作为应激性反应有利于清除藻细胞内由
Cd2+诱导所产生的过多的自由基 ,提高藻细胞对
Cd2+的耐性能力。这也说明在逆境胁迫下 ,藻细胞
试图通过增加其 SOD等抗氧化防御系统成分的能
力来削弱活性氧的影响 ,这与 Buonaurio 等[ 15]研究
植物对病原菌作用产生的氧化应激的结果相类似 。
而CAT活性则随Cd2+浓度的增大而减小 ,均明显低
于对照组 ,表明 CAT 对 Cd2+的毒害很敏感 ,因此在
抗氧化过程中作用不大;由于 Fe-SOD活性受到抑
制 ,实验中所测定的总 SOD活性与对照相比 ,虽然
有所增高但幅度不是很大。
Cd2+引起了藻细胞脯氨酸的累积 ,其含量随着
Cd2+胁迫程度的加剧而相应升高 ,脯氨酸作为重要
的渗透调节物质 ,它的积累有着对逆境积极的适应
意义[ 16] 。同时 , 脯氨酸也参与消除自由基的消
除[ 17] 。
通过本研究的结果可见 , Cd2+胁迫可导致椭圆
小球藻O-.2 含量增加 ,细胞通过提高SOD 、POD以及
脯氨酸含量来消除自由基的危害 ,从而提高小球藻
对重金属胁迫的抗性。
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PHYSICAL RESPONSES TO Cd2+ STRESS IN CHLORELLA ELLIPSOIDEA
LI Jian-Hong ,HAO Yun-Tao andWENG Yong-Ping
(Life Science College , Nanjing Normal University , Nanjing　210097)
Abstract:A high heavy metal resistant Chlorella ellipsoidea strain was isolated from the electroplating waste water.Former re-
searches had showed the alga had high tolerance to heavy metals and was able to eliminate Cu2+ ,Zn2+ ,Ni2+and Cd2+effectively
from water.So it could be used for decreasing heavy metal pollution.To understand the physical mechanisms of the alga against
the toxicities of heavy metals ,we studied the physical responses of the alga to Cd2+ stress.In this research ,we focused on the
physical reactions to radical injuring in cells caused by Cd2+.
Methods:Photosynthesis O2 release was measured by membrane oxygen electrode;Superoxide anion radical was measured by xan-
thine oxidase and NBT system;Superoxide dismutase (SOD)activity is determined by hydroxylamine assay-developed from xan-
thine oxidase assay;Catalase(CAT)was measured by molybdic acid method;Peroxidase(POD)was determined by method of guaia-
col oxidation;Proline was measured by the method of Sulosalicylic acid.
Results:Chlorophyll content and photosynthetic O2 release were measured as indicators of cadmium toxicities.Results showed
that , between 10 to 240μmol/L Cd2+ , total chlorophyll content and photosynthesis O2 release decreased when the ion concentra-
tion increased.The lower concentration of Cd2+ , 10μmol/L induced higher chlorophyll-a , it was 130%of the control.Cadmium
caused the ratio of chlorophyll-a/b rising.When Cd2+was over 30μmol/L , the ratio of chla/b rose from 1.22 to 2.61.These
showed Cd2+ in this concentration range could cause toxicities to the C.ellipsoidea .So this concentration range of Cd2+was used
as stress to induce radicals and observe the physical responses of the alga.Results showed Cd2+ produced more O2-.in algal
cells.When Cd2+was 90μmol/L ,O2-.was 2.07 times as much as the control in 72hrs after incubated.Meanwhile ,POD was in-
duced strongly and reached the highest level.It s content was 4.84 times concentration of the control.But for 120μmol/L and
240μmol/L Cd2+ ,POD content was 4.10 and 3.63 times respectively;There were four SOD isoenzyme bands in the electrophore-
sis gel.The least molecular band was Fe-SOD , and the other three wereMn-SOD.Highest SOD content was induced by 120μmol/
L Cd2+ , reached 1.3 times as much as the control.Two types of SOD showed different responses to cadmium stress.Mn-SOD ob-
viously increased.That caused total amount of SOD increasing.But Fe-SOD decreased;Proline content and Cd2+ concentration in
algal cells was correlated.When Cd2+was 10μmol/L , proline content was 1.89 times of the control.Proline reached highest lev-
el , 2.86 times of the control in 120μmol/L Cd2+.These results suggested that increasing of free radical elimination enzymes and
substances was helpful to the algae to resistant cadmium injuring.However , as one of the most important anti-oxidation enzymes ,
CAT showed an opposite response to the Cd2+.Its content went down with Cd2+going up.When Cd2+was 90μmol/L ,CAT activi-
ty was 23.36%of the control.This meant CAT was very sensitive to Cd2+.
Conclusion:Cd2+could induce radicals which were toxic to algal cell.The high heavy metal resistant C.ellipsoidea strain could
produce more SOD ,POD and proline to decrease the injuries.
Key words:Chlorella;Cadmium;Radical;SOD;POD
6期 李建宏等:Cd2+胁迫条件下椭圆小球藻的生理应答 663