全 文 ：小球藻油脂不同提取方法的比较
刘宪夫1，2，孙利芹2，王长海1，*
（1.南京农业大学海洋生物学重点实验室，江苏南京 210095；2.烟台大学生命科学学院，山东烟台 264005）
摘 要：小球藻因其高的油脂含量和生长特性成为生物柴油研究的重要微藻资源之一，而研究表明油脂提取方法的
不同通常直接关系到生物柴油的质量。研究了索氏提取、有机溶剂浸提两种油脂提取方法及不同细胞前处理方法对
小球藻油脂提取率的影响，并比较了不同方法提取的油脂组成成分差异。结果表明，在不同的提取方法中，油脂得率、
油脂中中长链脂肪酸（C14-C22）占总脂肪酸比例及脂肪酸提取纯度各不相同。其中，氯仿-甲醇浸提法是一种简便快捷
高效的油脂提取方法，其油脂得率为（22.40±0.89）%，中长链脂肪酸（C14-C22）比例为 85.84 %；索氏提取法中无水乙醇
作为提取溶剂获得的得率最高为（24.37±0.21）%，石油醚提取的油脂脂肪酸成分最多，达到 10种。
关键词：小球藻；油脂提取；气相色谱
The Comparison of Different Extraction Method of Lipin from Chlorella
LIU Xian-fu1，2，SUN Li-qin2，WANG Chang-hai1，*
（1. Nanjing Agricultural University Marine Biology Key Laboratory，Nanjing 210095，Jiangsu，China；
2. Shandong Yantai University Marine Institute，Yantai 264005，Shandong，China）
Abstract：Chlorella has become one of the important microalgae resources for biodiesel research because of its
high fat content and growth characteristics，and there is a lot of research showing that the lipin extraction method is
usually directly related to the quality of biodiesel.We investigate the Soxhlet extraction and organic solvent
extraction of lipin extraction method and the influence of extraction rate of chlorella lipin extracted by different
pre-cell approach methods， and compared the composition differences of lipin extracted by different methods.The
results show that the different extraction methods result in different lipin yield，different ratio of long-chain fatty
acids （C14-C22）to total fatty acids and different extract purity of fatty acids.Among them，chloroform-methanol
extraction method is a simple and efficient method of lipin extraction，with lipin yield of （22.40±0.89） % and
85.84 % long chain fatty acids （C14-C22）；In Soxhlet extraction，we get the highest yield rate of （24.37±0.21） %
with Anhydrous alcohol as an extraction solvent，and we get up to 10 kinds of fatty acids with petroleum ether as an
extraction solvent.
Key words：chlorella；oil extracted；gas chromatography
基金项目：“十二五”支撑计划（2011BAD14B01）
作者简介：刘宪夫（1987—），男（汉），硕士生，主要从事微藻生物能
源方面的而研究。
*通信作者
食品研究与开发
Food Research And Development
2014年 2月
第 35卷第 3期
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.006
随着全球石化燃料的日益枯竭，可再生资源的寻
求显得尤为重要。油脂是一类重要的可再生资源，微
藻油脂与植物油脂相似，可代替植物油脂，还可以用
来生产生物柴油。微藻的能源化利用有望成为“后石
油时代”破解能源危机的一把金钥匙[1-2]。近年来，从微
藻中制备生物柴油的研究也引起了我国政府、科研机
构和企业的重视，被列为科技部“973”和“863”计划的
重点项目之一。目前对产油藻的研究主要有葡萄藻
（Botryococcus braunii）、小球藻（Chlorella pyrenoidosa）
等[3]。其中以小球藻为原料生产的生物质燃油非常宜
于柴油发动机的燃烧，同时由于小球藻的高含油量和
生长迅速的特征，因此被认为是最有工业化潜力的生
物柴油的重要生产藻株之一[4-5]。目前从微藻中提取油
脂的方法主要有碾磨法、酸水解法、索氏抽提法和加
热回流法等[6]。早期研究表明[7]，对于相同的原料采用
的提取方法不同，所获得的油脂提取率是不同的。生
分离提取
18
物柴油通常是指由中长链脂肪酸形成的单烷基酯，即
脂肪酸甲酯（C14-C22）组成的[8]。因此探讨油脂提取方法
对油脂脂肪酸组成的影响，对优质微藻生物柴油的制
备有重要意义。本研究即在上述背景下，以小球藻为
材料，考察了不同提取方法（索氏提取法和有机溶剂
浸提法）及小球藻细胞不同前处理方法对油脂提取率
和脂肪酸组成的影响，旨在寻找到一种油脂得率较
高、可以制备优质生物柴油的油脂提取方法，为微藻
能源化利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小球藻（Chlorella pynenoidosa），原种由中国海洋
大学微藻种质库（MACC）提供，经进一步分离纯化后
由烟台大学海洋生化工程研究所保存。
石油醚、乙醚、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、无水乙
醇、异丙醇、环己烷、氯仿、甲醇、甲苯均为分析纯。脂
肪酸甲酯标准品为 Sigma公司产品。
1.2 试验方法
1.2.1 小球藻的培养与采收
小球藻培养用海水取自烟台大学近海，经过滤、
高温灭菌后使用。采用 f/2培养液，室温（22±1）℃，光照
2 500 lx（日光灯），连续充气培养。在细胞生长至指数
生长末期（培养至 7 d~8 d左右）离心采收，低温烘干封
口于干燥器中保存备用。
1.2.2 油脂提取方法
1.2.2.1 索氏提取法
准确称取小球藻藻粉 0.2 g放入滤纸包中，称重
得 m1，放入索氏提取器中。分别选用石油醚、乙醚、丙
酮、正己烷、乙酸乙酯、无水乙醇、异丙醇、环己烷 8种
单一有机溶剂进行提取，直至提取到无色，取出滤纸
包烘干至恒重，称重得 m2，m1与 m2之差即为油脂重
量，按公式 1计算油脂得率。旋转蒸发有机溶剂得油
脂备用。每个实验重复 3次。
油脂得率 =（m1 - m2）/m1 × 100 % （1）
1.2.2.2 有机溶剂浸提法
准确称取小球藻藻粉 m1 0.2 g 放入 50 mL 离心
管中，分别采用氯仿-甲醇﹙2 ∶ 1﹚、丙酮-石油醚﹙1 ∶ 1﹚、
乙醚-石油醚﹙1 ∶ 1﹚三种溶剂组合进行提取，3 h后离
心转移上层有机溶剂，重新加入溶剂再次抽提，重复
三次。小球藻藻粉残渣烘干至恒重，称重得 m2，m1与
m2之差即为油脂重量，按公式 1 计算油脂得率。分
别合并有机溶剂相并旋干得油脂备用。每个实验重
复 3次。
1.2.2.3 小球藻细胞前处理方法[9]
酸热法：准确称取小球藻藻粉 m1 0.2 g，加入 4 mol/L
盐酸，震荡混匀，室温下放置 30min，，然后沸水浴 3min，
立即放于-20℃速冷。
超声法：准确称取小球藻藻粉 m1 0.2 g，加入 10 mL
蒸馏水振荡混匀后，超声处理，功率 200 W，全程时间
20 min，其中脉冲时间 10 s，间隔时间 4 s。
酸热耦合超声波法：准确称取小球藻藻粉 m1 0.2 g，
先按上述酸热法处理，后再按上述超声法处理。
上述三种方法处理后的小球藻藻粉采用氯仿-甲
醇﹙2 ∶ 1﹚进行油脂浸提，浸提方法同 1.2.2.2。
1.2.3 油脂脂肪酸组成分析
1.2.3.1 样品甲酯化
精确称取 5 mg油脂提取物中加入带塞试管中，加
入 3 mL石油醚 ∶甲苯（1 ∶ 1）的混合溶剂，待油脂溶解，
加入 3 mL 0.4 mol/L的 KOH-CH30H溶液，混匀，室温静
置 10 min，加蒸馏水至瓶颈部，静置，取上层液分析[10]。
1.2.3.2 气相色谱分析
采用岛津 GC-2010气相色谱仪，氢火焰离子化检
测器，DB-5毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。升温
程序：150℃保留 1 min，以 10℃/min升至 250 ℃，保留
40 min。进样口、检测器的温度为 290℃。载气为高纯
度氮气，流速为 9.6 mL/min，进样量 0.8 μL。以面积归
一化法计算各脂肪酸组分的相对含量。
2 结果与讨论
2.1 油脂提取方法比较
2.1.1 不同提取方法下小球藻油脂得率的比较
表 1 为采用不同方法提取小球藻油脂的油脂
得率。
油脂提取方法 提取溶剂 油脂得率/%
索氏提取法 无水乙醇 24.37±0.21
乙酸乙酯 20.14±0.32
环己烷 15.08±0.47
乙醚 13.42±0.22
异丙醇 19.17±0.40
石油醚 7.17±0.20
正己烷 7.05±0.09
丙酮 12.74±0.11
浸提法 氯仿-甲醇 22.40±0.89
乙醚-石油醚 12.61±0.45
丙酮-石油醚 17.81±0.95
表 1 索氏提取法、浸提法油脂得率
Table 1 The extraction efficiency of Soxhlet extraction and extract
approach
刘宪夫，等：小球藻油脂不同提取方法的比较分离提取
19
从表 1中可以看出在索氏提取法中，无水乙醇的
提取效果最好，油脂提取得率达到 24.37 %，这和马帅
等[7]运用乙醇法对微藻油脂提取的结果相似。其次为乙
酸乙酯、异丙醇。环己烷的油脂得率也达到了 15.08 %，
油脂提取得率较小的是正己烷和石油醚。实验中采用
的不同溶剂提取油脂实验重复率都较好，说明各有机
相对小球藻中粗脂的提取较稳定。不同溶剂提取的油
脂的颜色不同，石油醚、正己烷提取的油脂呈现黄色，
油脂提取率较大的无水乙醇、乙酸乙酯等油脂呈现绿
色，可能因为有些溶剂对色素等提取效果较好造成
的，因而采用不同的溶剂，油脂提取得率相差较大。
采用混合溶剂浸提法提取小球藻油脂结果（表 1）
显示，氯仿-甲醇的提取效果最好，提取率达到 22.40%。
丙酮-石油醚提取效果次之，油脂提取率为 17.81 %。
乙醚-石油醚提取油脂得率较差，仅为 12.61 %。
与索氏提取方法相比较，氯仿-甲醇浸提法所获
得的油脂提取率（22.4 %）仅次于索氏提取中的无水乙
醇，与乙酸乙酯提取率相当，但这种现象并没有发生
在乙醚-石油醚、丙酮-石油醚混合溶剂中。但由于索
氏提取法耗时较长，操作繁琐，而且需要的样品量较
大，因而不适用于对微藻细胞中的油脂含量实行在线
监测。而溶剂浸提法中，氯仿-甲醇的提取率高，且操
作步骤相对简单，适用于微藻生长过程中对其细胞油
脂含量实现在线监测。
2.1.2 不同小球藻细胞前处理方法的比较
表 2为小球藻细胞经不同前处理后采用氯仿-甲
醇浸提的结果。
数据分析显示：对小球藻细胞经过前破碎处理，
小球藻的油脂得率有一个提升，但提升效果并不是很
明显。其中酸热超声耦合时对油脂的提取效果最好，
油脂得率为 24.58 %。超声法比酸热法油脂得率稍高。
2.2 油脂脂肪酸组成分析
2.2.1 不同油脂提取方法中油脂脂肪酸组成分析
两种提取方法下提取的小球藻粗油脂脂肪酸组
成分析见表 3和表 4。
由数据分析可知：不同提取方法下小球藻油脂的
细胞前处理方法 提取溶剂 油脂得率/%
未处理 氯仿-甲醇 22.40±0.89
酸热法 氯仿-甲醇 23.83±0.68
超声法 氯仿-甲醇 24.33±0.40
酸热超声耦合法 氯仿-甲醇 24.58±0.58
表 2 不同小球藻细胞前处理方法的比较
Table 2 The comparison of different Pre-treatment methods on
Chlorella cells
脂肪酸 乙醚 丙酮 正己烷 石油醚环己烷 异丙醇
乙酸
乙酯
无水
乙醇
C8:0 - - 1.18 - 0.68 - - -
C10:0 0.25 - - 0.21 - - - -
C12:0 - - - 0.42 - - - -
C14:0 - - - 0.34 - - - -
C16:0 17.48 20.72 20.85 24.00 25.21 22.82 21.47 24.32
C16:1 3.75 5.79 3.6 4.68 4.87 5.37 4.93 5.52
C18:0 5.77 6.13 7.62 7.71 7.31 8.43 6.67 7.12
C18:1 22.70 24.55 28.37 32.83 31.70 25.77 24.62 26.39
C18:2 - - - - - - - -
C18:3 - - 1.54 - 1.67 - 1.02 0.89
C20:0 - - - - - - - -
C20:1 - - - - - - - -
C20:2
C20:3 - - - - - - - -
C20:4 - - - - - - - -
C20:5 19.2 24.17 14.35 13.36 12.13 25.43 26.01 21.27
C22:0 0.45 - 0.90 0.70 0.55 - -
C22:1 - - - - - - - -
C24:0 0.51 - 1.20 0.83 - - - -
合计 70.11 81.36 79.61 85.08 84.12 87.82 84.72 85.51
中长链
脂肪酸
（C14-C22）
69.35 81.36 77.23 83.62 83.44 87.82 84.72 85.51
峰面积
总量
（×106）
1.31 1.20 1.58 1.39 0.93 1.16 1.35 1.47
表 3 索氏提取法提取油脂脂肪酸组成分析（占总脂肪酸含量%）
Table 3 The fatty acid composition analysis of the lipin cxtracted
from Soxhlet extraction
注：“-”为本实验未检测出。
脂肪酸
丙酮-
石油醚
乙醚-
石油醚
氯仿-甲醇
未经前
处理
超声
处理
酸热
处理
酸热超
声耦合
C8:0 - - - - - -
C10:0 0.93 1.13 - - - -
C12:0 - 2.26 0.52 - - -
C14:0 4.30 4.10 1.52 - - -
C16:0 14.71 12.04 21.33 19.97 26.92 22.55
C16:1 4.67 3.15 5.36 5.36 5.15 4.64
C18:0 5.34 6.32 6.34 6.98 7.74 7.44
C18:1 27.26 28.68 30.09 24.06 30.26 26.55
C18:2
C18:3 6.94 8.58 2.50 1.93 2.35 2.94
表 4 浸提法和藻细胞不同前处理提取油脂的脂肪酸组成分析
（占总脂肪酸含量%）
Table 4 The fatty acid composition analysis of the lipin from
extract approach and different Pre-treatment methods on
Chlorella cells
分离提取刘宪夫，等：小球藻油脂不同提取方法的比较
20
脂肪酸
丙酮-
石油醚
乙醚-
石油醚
氯仿-甲醇
未经前
处理
超声
处理
酸热
处理
酸热超
声耦合
C20:0 - - - - - -
C20:1 - - - - - -
C20:2 - - - - - -
C20:3 - - - - - -
C20∶4 - - - - - -
C20:5 15.70 5.53 18.70 18.50 18.66 18.78
C22:0 - - - - - -
C22:1 - - - - - -
C24:0 - - - - - -
合计 79.85 71.79 86.36 76.8 91.08 82.9
中长链脂肪
酸（C14-C22）
78.92 68.4 85.84 76.8 91.08 82.9
峰面积总量
（×106）
0.89 0.88 1.21 0.69 0.72 0.52
续表 4 浸提法和藻细胞不同前处理提取油脂的脂肪酸组成分析
（占总脂肪酸含量%）
Continue table 4 The fatty acid composition analysis of the lipin
from extract approach and different Pre-treatment methods on
Chlorella cells
脂肪酸组成差别不是很大，不同方法提取的小球藻的
油脂都主要由 C16、C18、C20脂肪酸组成。C16脂肪酸中
C16 ∶ 0较多的存在在，占总脂肪酸的 12.04 %~26.92 %，
C16 ∶ 1占总脂肪酸的 5 %左右。C18脂肪酸中 C18 ∶ 0和 C18 ∶ 1
含量较多，绿藻纲微藻最主要的脂肪酸 C18 ∶ 3含量很
少，有的提取方法甚至都没有检测到。在 C20脂肪酸中
小球藻属中藻类不应具有的二十碳五烯酸（C20 ∶ 5）却占
有很大比例，占到总脂肪酸的 5.53 %~26.01 %，这与冯
福应等 [11]的研究结果比较相似，与蒋敏霞 [12]等研究结
果有所不同，这可能与小球藻的藻种及培养条件不同
有关。C8-C12等短链脂肪酸以及 C22、C24长链脂肪酸含
量很少，有的提取方法甚至没有检测到。
在提取方法相同溶剂不同的情况下，提取获得的
油脂组成也有所差别。在索氏提取法中，正己烷、石油
醚提取的脂肪酸成分较多，分别为 9种和 10种，异丙
醇、丙酮提取物中脂肪酸的成分比较少，都为 5种，其
它溶剂提取物中脂肪酸的成分为 6种~8种。在浸提法
中，乙醚-石油醚提取物中有最多的 9种脂肪酸成分，
超声处理、酸热处理、酸热耦合超声处理提取的油脂
中脂肪酸成分较少，均为 6种，而未经处理、丙酮-石
油醚提取物中都含有 8种脂肪酸成分。综上，在索氏
提取法和浸提法中，只要单一或者混合提取溶剂中含
有石油醚，提取的油脂中就含有较多脂肪酸成分，与
其它有机溶剂提取的油脂相比，多了 C10 ∶ 0、C12 ∶ 0两种或
者其中一种脂肪酸。造成这种结果的原因可能与石油
醚的极性小，酯类、醇类的极性大有关。生物柴油是由
中长链脂肪酸甲酯（C14-C22）组成的，石油醚作为提取
溶剂虽然提取出较多的脂肪酸成分，但提取出的短链
脂肪酸（C10、C12）并不利于生物柴油的生产。
不同方法和提取溶剂所提取的油脂中各脂肪酸
所占总脂肪酸比例有所差别。在索氏提取法中，正己
烷作为提取溶剂，C8 ∶ 0、C22 ∶ 0、C24 ∶ 0的占总脂肪酸比例最
高，C16 ∶ 1、C18 ∶ 0、C18 ∶ 1、C20 ∶ 5占总脂肪酸最高比例分别出现
在丙酮、异丙醇、石油醚、乙酸乙酯作为提取溶剂的方
法中，比例分别达到：5.79 %、8.43 %、32.83 %、26.01 %。
在浸提法中，C10 ∶ 0、C12 ∶ 0、C18 ∶ 3在乙醚-石油醚作为提取
溶剂提取的油脂中比例最高，C14 ∶ 0、C16 ∶ 0占总脂肪酸最
高比例分别出现在丙酮-石油醚、酸热处理方法中，比
例分别达到：4.30 %、26.92 %。可见根据所需要的脂肪
酸可选择不同的油脂提取方法。
2.2.2 不同油脂提取方法中油脂中长链脂肪酸（C14-
C22）组成分析
由于生物柴油通常是指由中长链脂肪酸形成的
单烷基酯，即脂肪酸甲酯（C14-C22）组成的，因此提取的
油脂中中长链脂肪酸（C14-C22）占总脂肪酸的比例关系
到生物柴油的燃烧性能。由表 3和表 4中可以看出：在
不同提取方法下中长链脂肪酸（C14-C22）占总脂肪酸的
比例可达到 68.4 %~91.08 %，中长链脂肪酸（C14-C22）
比例较高，这说明用小球藻油脂制备生物柴油的思路
是正确的。在索氏提取法中，中长链脂肪酸（C14-C22）比
例可达到 69.35 %~87.82 %。其中异丙醇作为提取溶剂
的比例最高为 87.82 %，无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚
次之，乙醚最低，为 69.35 %。在浸提法中，中长链脂肪
酸（C14-C22）比例可达到 68.4 %~91.08 %。藻粉经过酸
热处理后最高，为 91.08 %，未经处理比例次之，达到
85.84 %。乙醚-石油醚作为浸提溶剂比例最低，仅为
68.4 %。综上，在索氏提取法异丙醇作为提取溶剂以及
浸提法中藻粉未经处理、藻粉酸热处理方法下，中长
链脂肪酸（C14-C22）比例都比较高，都高于 85.8 %。可
见，藻粉未经处理，采用氯仿-甲醇作为提取溶剂的浸
提法所提取的油脂是适用于生物柴油生产的。
2.2.3 不同油脂提取方法粗提物中脂肪酸纯度分析
由于对不同提取方法提取的油脂进行甲酯化时
称取的油脂重量相同，因此，进行气相色谱分析后，脂
肪酸峰面积大小可代表单位重量粗油脂中脂肪酸含
量的差异。由表 3和表 4中，在索氏提取法中，正己烷、
无水乙醇、石油醚等作为提取溶剂时峰面积较大，表
明这些方法提取的粗油脂中所检测脂肪酸的含量较
注：“-”为本实验未检测出。
刘宪夫，等：小球藻油脂不同提取方法的比较分离提取
21
高。在浸提法中，小球藻藻粉未经前处理，粗提物油脂
中所检测脂肪酸的含量较高，而经过酸热、超声、酸热
耦合超声处理后，粗油脂中所检测脂肪酸的含量均有
明显下降。乙醚-石油醚、丙酮-石油醚均没有采用氯
仿-甲醇作为提取溶剂检测出的脂肪酸的含量高。综
上，浸提法中，小球藻不经处理，采用氯仿-甲醇作为
提取溶剂所提取的粗油脂中含有较多含量的脂肪酸。
3 结论
微藻油脂的提取过程对生物柴油的生产非常重
要。不同方法提取微藻油脂需同时考虑到两个因素：
油脂得率和油脂脂肪酸成分，因为这关系到生物柴油
的产量和燃烧性能。在索氏提取法中无水乙醇作为提
取溶剂提取油脂，虽然油脂得率较氯仿-甲醇稍高，但
中长链脂肪酸（C14-C22）比例不及氯仿-甲醇直接浸提
法提取的油脂。另外考虑到索氏提取法耗时较长，操
作繁琐，而且需要的样品量较大。氯仿-甲醇浸提法所
获得的油脂提取率虽次于索氏提取中法中的无水乙
醇，但提取物经过气相分析发现：该方法提取的油脂
脂肪酸成分、中长链脂肪酸（C14-C22）比例、粗提物中脂
肪酸纯度均非常适于生产生物柴油。而小球藻藻粉经
过不同前处理与未经处理相比，油脂得率没有明显提
高，粗提物中脂肪酸纯度反而有了明显降低。综上，结
合不同油脂提取方法的油脂得率及脂肪酸组成，氯
仿-甲醇直接浸提法是一种适于生物柴油生产的小球
藻油脂提取方法。
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收稿日期：2012-09-14
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分离提取刘宪夫，等：小球藻油脂不同提取方法的比较
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