全 文 ：第 4卷第 4期
2 0 0 8年 8月
南 方 水 产
SouthChinaFisheriesScience
Vol.4, No.4
Aug., 2008
收稿日期:2008-04-03;修回日期:2008-04-29
资助项目:“十一五 ” 国家科技支撑计划项目 (2006BAD09A03)
作者简介:梁 英 (1967-), 女 , 博士 , 教授 , 从事微藻生理生化研究。 E-mail:yliang@ouc.edu.cn
磷限制及恢复对小球藻叶绿素荧光特性的影响
梁 英 , 金月梅 , 田传远
(中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室 , 山东 青岛 266003)
摘要:研究了小球藻 (Chlorelasp.)一次性培养过程中 , 培养基中不同磷浓度 (0、 10、 36.3和 290.4 μM)对
其叶绿素荧光参数 、 细胞密度和叶绿素含量的影响以及磷添加后各荧光参数的瞬时变化 (nutrientinducedfluo-
rescncetransients, NIFT反应)及恢复情况。培养温度为 20±1℃, 盐度为 31, 光照强度为 100μmol·m-2·s-1。单
因子方差分析的结果表明 , 随着培养时间的延长 , 磷浓度对小球藻的光合作用及生长均有显著影响 (P<0.05)。
多重分析的结果表明 , 小球藻的最适磷浓度为 36.3 μM。小球藻的最大光能转化效率 (Fv/Fm)、 实际光能转化
效率 (ΥPSII)、 电子传递效率 (ETR)、 光化学淬灭 (qP)、 细胞密度以及叶绿素含量随着起始磷浓度的增大而
增大 , 在磷浓度为 36.3 μM达到最大值。磷重新添加后 , 瞬时荧光不断下降 , ΥPSII出现瞬间的上升后恢复至原
初状态 , qP、 非光化学淬灭 (NPQ)则不断上升。限制 7 d后重新添加磷 , 各处理组的 Fv/Fm、 ΥPSII、 ETR、
NPQ24 h内基本恢复 , 而对照组的变化不显著。
关键词:小球藻;磷浓度;叶绿素荧光参数;瞬时变化;恢复
中图分类号:Q945.78 文献标识码:A 文章编号:1673-2227-(2008)04-0001-07
Efectsofphosphorusrestrictionandsupplementonthechlorophyl
fluorescentparametersofChlorelasp.
LIANGYing, JINYuemei, TIANChuanyuan
(TheKeyLab.ofMariculture, MinistryofEducation, OceanUniversityofChina, Qingdao266003, China)
Abstract:TheefectsofdiferentPconcentrations(0, 10, 36.3, 290.4 μM)onthechlorophylfluorescenceparameters, cel
densityandrelativechlorophyllcontentofChlorelasp.werereported.ThealgaewereobtainedfromtheMicroalgaeCultureCenter
(MACC), OceanUniversityofChina.Theculturesweregrownat20±1℃, thesalinitywasadjustedto31 byusingdistiledwater,
andthelightintensitywas100μmol·m-2·s-1.One-wayanalysisofvarianceshowedthatPconcentrationshavesignificanteffectsonthe
photosynthesisandgrowthofChlorellasp.withthecultureageincreasing(P<0.05).ForChlorellasp., Fv/Fm, ΥPSII, ETR, qP,
celdensitiesandchlorophylcontentsallincreasedwiththeincreaseofPconcentrationsandreachedtheirhighestvaluesat36.3
μM.MultiplecomparisontestsshowedthattheoptimalPconcentrationsforthephotosynthesisandgrowthofChlorelasp.is36.3
μM.ThechlorophyllfluorescenceparametersshowedcharacteristicNIFTresponsesfolowingPO3-4 additiontoP-starvedChlorelasp.,
fluorescencedecreasedbutqP, NPQincreasedsteadily, ΥPSIIincreasedsharply, andthenadecreasetothesamesteadystateasthat
priortoaddition.Sevendayslater, thelackednutrientPwasaddedandchlorophylfluorescenceparametersweremeasuredevery2
hours.TheresultsshowedthatFv/Fm, ΥPSII, ETRofChlorelasp.wereallrecoveredin24hours.ThechangesofqN, NPQwerenot
significant.
Keywords:Chlorelasp.;Pconcentration;chlorophyllfluorescenceparameters;nutrientinducedfluorescncetransients(NIFT);recovery
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南 方 水 产
第 4卷
磷是微藻生长发育的必需元素 , 主要存在于单
细胞藻的原生质和细胞核中 , 它作为底物或调节物
直接参与光合作用的各个环节 , 包括光能吸收 、 同
化力的形成 、 卡尔文循环 、 同化产物的运输以及对
一些关键性酶的活性起调节作用等[ 1] 。它参与植
物生长发育过程中的各种代谢活动 , 在细胞膜结
构 、 物质代谢以及信号传导等方面都起着极为重要
的作用[ 2] 。
当微藻受到环境胁迫时 , 光合作用受到抑制 ,
光合效率降低 , 藻细胞吸收的过剩光能通过热量以
及荧光的形式散发出去 。因此 , 叶绿素荧光的变化
可以在一定程度上反映环境因子对微藻的影响 [ 3] ,
通过对不同营养盐浓度下叶绿素荧光参数变化的分
析 , 可深入了解磷浓度对微藻光合机构主要是 PSII
的影响。叶绿素荧光法具有快速 、 准确 、对细胞无
损伤 、需要样品量少的优点 , 是检测微藻营养盐限
制最有发展前景的方法 [ 4-5] 。
小球藻 (Chlorelasp.)属于绿藻门 , 其蛋白
质含量高达 55% ～ 65%, 氨基酸组成均衡 , 含有
大量的叶绿素 , 特别是含有生物活性物质糖蛋白 、
多糖体及高达 13%的核酸等物质 。小球藻中富含
小球藻生长因子 (Chlorelagrowthfactor, CGF),
能迅速恢复机体造成的损伤 , 是公认的健康食品。
它不仅是轮虫 (Brachionusplicatilis)[ 6]等水产动物
的天然饵料 , 同时很多研究表明 , 在养殖水体接种
小球藻可调节和优化浮游生物的群落结构 , 增加溶
解氧 , 从而改善水体的化学环境条件 [ 7 -8] 。因此 ,
合理培养和利用小球藻在水产动物的健康养殖中具
有重要意义。
迄今为止 , 国外已有一些有关叶绿素荧光法研
究营养盐胁迫对微藻光合作用影响的报道[ 9-14] ,
国内有关营养盐浓度对小球藻叶绿素荧光的影响尚
未见报道 。目前 , 通过叶绿素荧光法检测营养盐限
制情况的主要方法有 3种: (1)通过 Fv/Fm (最
大光能转化效率)比值的变化来检测 。 (2)通过
营养添加后各荧光参数的瞬时变化 (nutrientin-
ducedfluorescncetransients, NIFT反应)来检测。
(3)通过在线叶绿素荧光的变化检测 。此文结合
前 2种方法研究了不同磷浓度对小球藻各荧光参数
的影响 , 并对其逆境反应的机理进行了初步研究 ,
为其利用提供科学依据 , 推进了营养盐检测方法的
发展和完善 。
1 材料与方法
1.1 材料
实验所用小球藻藻种取自中国海洋大学微藻种
质库 , 编号为 MACC/C95。
1.2 微藻培养
实验在 500mL的三角烧瓶中进行 , 除磷浓度
外 , 其它营养盐均采用 f/2培养基 [ 15] 。磷设 4个
浓度梯度 , 分别为 0 (缺磷组)、 10 (低磷组)、
36.3 (对照组)和 290.4 μM (高磷组)。每个浓
度 3个平行组 , 培养温度为 20 ±1℃, 盐度为 31,
光照强度为 100 μmol·m-2·s-1。培养过程中不充
气 , 每日随机调换三角瓶并摇动 2 ～ 3次 。培养时
间为 7 d, 每天定时取样 , 进行叶绿素荧光参数 、
细胞密度 、 叶绿素含量的测定。
1.3 叶绿素荧光参数的测定
用 Water-PAM水样叶绿素荧光仪 (Walz, Ef-
fectnich, Germany)测定叶绿素荧光参数 。测量前
将微藻样品暗适应 15 min, 叶绿素荧光参数 Fv/
Fm、 ΥPSII(实际光能转化效率)、 ETR(电子传
递效率)、 qP(光化学淬灭)、 qN(非光化学淬
灭)和 NPQ(非光化学淬灭)可通过叶绿素荧光
仪直接读出 。
1.4 叶绿素含量的测定
用 Water-PAM水样叶绿素荧光仪测定叶绿素
含量 , 原理是由于瞬间荧光产量 (F值)与叶绿
素含量在一定范围内成正比 , 通过校正可测出叶绿
素含量 。为避免校正过程中可能产生的误差 , 文中
的叶绿素含量用相对含量 (每天测得的叶绿素含
量与接种时叶绿素含量的比值)表示 。
1.5 细胞密度的测定
每天定时取样 , 用血球计数板测定细胞密度。
1.6 NIFT反应
培养基中 , 磷的添加量为 0, 其它营养盐采用
f/2培养基 。实验的第 3、 第 5和第 7天定时取 3
mL样品于石英杯中 , 测定光强为 150 μmol·m-2·
s-1 , 每 30 s进行瞬时荧光 、 ΥPSI、 qP、 NPQ的
测定 , 样品稳定 10 min后 , 向样品中迅速添加 30
μL磷源 (PO3-4 -P), 再测定 10 min。根据 RO-
BERTS[ 16]的研究 , 此测定光强以及磷源的添加量
第 4期
梁 英等:磷限制及恢复对小球藻叶绿素荧光特性的影响
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足够引起 NIFT反应 。
1.7 恢复实验
微藻在不同磷浓度条件下培养 7 d后 , 分别向
缺磷组 、 低磷组和对照组中添加磷至 f/2培养基的
浓度 , 培养条件同 1.2。每 2 h取样测定叶绿素荧
光参数 , 测量方法同 1.3。
1.8 数据处理
用 SigmaPlot10.0软件作图。用 SPSS11.5软
件分别进行单因子方差分析和多重比较。 P<0.05
表示差异显著 。
2 结果
2.1 磷浓度对小球藻叶绿素荧光参数的影响
磷浓度对小球藻叶绿素荧光参数的影响见图 1
-a～ f, 随着培养时间的延长 , Fv/Fm、 ΥPSⅡ、
ETR、 qP总体上呈下降趋势 。缺磷组下降幅度最
大 , 其中 Fv/Fm值从接种时的 0.643下降到 0.35,
接种后第 2天开始到实验结束 qP均处于最低水平。
高磷组的 Fv/Fm值从 0.643下降到 0.455, 下降的
幅度仅次于缺磷组 。单因子方差分析以及多重比较
的结果表明 , 一次性培养过程中 , 磷浓度对小球藻
的叶绿素荧光参数均有显著影响 (P<0.05)。接
种后第 1天起到实验结束 , 缺磷组的 Fv/Fm、 ΥPS
Ⅱ、 ETR均显著低于对照组 (P<0.05), 高磷组
的 ΥPSⅡ 、 ETR、 qP以及低磷组的 ΥPSⅡ、 ETR
均显著低于对照组 (P<0.05)。接种后第 3天到
实验结束 , 高磷组的 Fv/Fm均显著低于对照组 (P
<0.05)。高磷组的 qN、 NPQ随着培养时间的延
长不断下降 , 从接种后第 2天开始到实验结束始终
处于最低水平 。
磷浓度对小球藻细胞密度的影响见图 1-g,
随着培养时间的增加 , 各组细胞密度不断增长 , 生
长速率按大小顺序为对照组 >低磷组 >高磷组 >缺
磷组 。单因子方差分析及多重比较的结果表明 , 磷
浓度对小球藻的细胞密度有显著影响 (P<0.05)。
磷浓度对叶绿素相对含量的影响见图 1 -h,
随着培养时间的延长 , 各组叶绿素相对含量不断增
长 , 增加速率按大小顺序为对照组 >高磷组 >低磷
组 >缺磷组。单因子方差分析及多重比较的结果表
明 , 磷浓度对小球藻的叶绿素相对含量有显著影响
(P<0.05)。
2.2 磷添加后各荧光参数的 NIFT反应
磷源添加后小球藻各荧光参数的 NIFT反应见
图 2-a～ d, 磷添加后实验第 3天 , 荧光的变化不
明显 , 第 5和第 7天荧光迅速下降随后有一定的恢
复但始终低于磷添加前的水平。实验第 3天 ,
ΥPSI的变化不显著 , 第 5和第 7天 ΥPSII迅速上
升随后又很快恢复至磷添加前的水平 。实验第 3和
第 5天 qP的变化不显著 , 而第 7天 qP不断大幅度
上升。整个实验过程中 , NPQ在磷添加后不断上
升 , 实验第 7天的上升幅度最大 。
2.3 磷添加后各荧光参数 24 h内的变化情况
磷添加后各荧光参数 24h内的变化情况见图 3
-a～ f, 添加磷后 , 缺磷组的 Fv/Fm、 ΥPSⅡ、
ETR、 qP呈明显上升的趋势 , 低磷组的 ΥPSⅡ、
ETR也呈上升的趋势。恢复 24h后 , 缺磷组的 Fv/
Fm从 0.350上升到 0.526 , ΥPSⅡ从 0.114上升到
0.246, ETR从 5.7上升到 12.4。对照组的 Fv/Fm
变化不明显 , ΥPSⅡ、 ETR在磷添加后 12 h后呈
现下降的趋势 , 其 Fv/Fm、 ΥPSⅡ、 ETR最终大小
分别为 0.610、 0.233、 11.7。
各组的 qN、 NPQ在磷添加 4 h以后呈现上升
的趋势 , 缺磷组的上升速率最快 、 上升幅度最大 ,
低磷组及对照组的 qN、 NPQ也有所上升 , 但是上
升幅度不大 。缺磷组 、 低磷组 、 对照组的最终 qN
分别为 1.048、 0.373、 0.517, 最终 NPQ分别为
1.230、 0.260、 0.469。
3 讨论
叶绿素荧光与光合作用的各个反应过程紧密相
关 , 任何胁迫对光合作用产生的影响都可以通过体
内叶绿素荧光诱导动力学变化反映出来。因此 , 叶
绿素荧光参数可作为胁迫条件下微藻抗逆反应的指
标 , 较好地反映微藻的实际光合状况 。
胁迫条件下 , Fv/Fm、 ΥPSⅡ、 ETR、 qP都明
显下降。此实验中 , 缺磷 、 低磷 、 高磷组的 Fv/
Fm、 ΥPSⅡ、 ETR、 qP都显著低于对照组 。培养 7
d后缺磷组 Fv/Fm降低的幅度最大 , 从接种时的
0.643下降到 0.350, 高磷组的 Fv/Fm值从 0.643
下降到 0.455。LIPPEMEIER等[ 11]对微小亚历山大
藻 (Alexandriumminutum)的研究表明 , 磷限制条
件下培养 9d后 , Fv/Fm值从 0.67下降到 0.42, 而
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南 方 水 产
第 4卷
图 1 磷浓度对小球藻叶绿素荧光参数 (a～ f)、 细胞密度 (g)、 叶绿素含量 (h)的影响
Fig.1 EfectsofdiferentPconcentrationsonthechlorophylfluorescenceparameters(a～ f), celdensity(g)
andchlorophylcontent(h)ofChlorelasp.
第 4期
梁 英等:磷限制及恢复对小球藻叶绿素荧光特性的影响
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图 2 小球藻磷限制后添加磷源时的瞬时荧光反应 (a～ d)
Fig.2 TransientperturbationstofluorescenceparametersfromP-starvedfor3, 5 and7 days
Chlorellasp.afterPadditionsasPO3-4
对照组的则保持在 0.67左右 , 这和此实验的结果
相一致。 Fv/Fm下降表明 , 磷限制使小球藻 PSⅡ反
应中心受损 , 阻碍了光合电子传递的过程 , 抑制光
合作用的原初反应[ 17] 。 ΥPSⅡ的降低 , 说明磷胁
迫阻止藻细胞同化力 (NADPH, ATP)的形成 ,
从而影响对碳的固定与同化。 qP的下降表明 , 电
子由 PSⅡ的氧化侧向 PSⅡ反应中心的传递受阻 ,
用于进行光合作用的电子减少 , 以热或其它形式耗
散的光能增加 , 这与 ΥPSⅡ的下降是吻合的 。非
光化学淬灭处在较低的水平 , 说明藻细胞的卡尔文
循环活跃 , 能量利用率高 。缺磷胁迫下小球藻的
qN逐渐增加 , 表明其卡尔文循环的活性受抑制的
程度增大 , PSⅡ的潜在热耗散增加 , 对藻体本身
是一种保护作用 。高磷组的 qN、 NPQ不断下降 ,
表明小球藻的正常生理功能受到严重伤害 , 对热能
的耗散能力不断丧失。
磷缺乏会影响到微藻光合作用中的卡尔文循
环 , 从而影响到叶绿素的合成和细胞的分裂 , 此时
微藻对外界胁迫的适应性减小 , 其生长速率下降 ,
最终导致细胞停止分裂。此实验结果表明 , 缺磷组
培养 2d后 , 细胞分裂处于停滞状态 , 叶绿素的合
成受到阻碍 。低磷组的最终细胞密度以及叶绿素含
量也显著低于对照组。 LIPPEMEIER等 [ 11]研究表
明 , 磷限制的条件下 , 微小亚历山大藻培养 20 d
后的细胞密度仅为 15.6 ×103 , 而磷充足的条件
下 , 其最终密度为 240×103 , 这和此实验的结果
相一致 。氮是合成蛋白质的主要物质基础 , 磷的缺
乏同时影响了微藻对氮的吸收利用 , 从而严重阻碍
了叶绿素的合成 。高磷胁迫也会影响微藻的生长 ,
此实验表明 , 高磷浓度下小球藻的细胞密度以及叶
绿素的最终含量显著低于对照组 。
此实验中 , 缺磷培养的小球藻在磷添加后各荧
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南 方 水 产
第 4卷
图 3 小球藻不同磷浓度下培养 7 d重新添加磷源后 24 h内各荧光参数 (a～ f)的变化
Fig.3 ChangesoffluorescenceparametersunderdiferentPconcentrationsfor7 days
afteradditionofPinChlorellasp.for24 h(a～ f)
光参数会出现相应的 NIFT反应 , YOUNG和
BEARDALL[ 10] 的研究表明 , 杜氏藻 (Dunaliela
tertiolecta)在氮限制后添加 NO-3 , 荧光在 15 s内
迅速下降 , 随后上升到最大值再下降至稳定水平 ,
NPQ在前 20s内随着荧光的下降而下降 , ΥPSⅡ、
qP都有小幅度的变化 , 而添加蒸馏水则无此现象。
HOLLAND等[ 18] 的研究也表明颤藻 (Oscilatoria
sp.)以及浮水小球藻 (C.emersoni)在磷限制后
添加 PO3-4 , 荧光以及 ΥPSⅡ都迅速下降至更低的
水平并保持稳定 。这和此实验的结果相一致 , 小球
藻在添加磷源后 , 荧光也出现瞬时下降的现象。
HOLLAND等的研究还表明 , 从自然海区取回的样
品并无 NIFT反应 , 经过实验室缺磷培养后 , 才出
现 NIFT反应 。结果表明 , 微藻在受到营养盐限制
的情况下 , 重新添加的瞬间会出现 NIFT反应 , 这
为后人检测水体中营养盐的限制情况提供一定的依
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梁 英等:磷限制及恢复对小球藻叶绿素荧光特性的影响
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据。
实验结果显示 , 磷添加后 24 h内 , 小球藻缺
磷组和低磷组的叶绿素荧光参数值都有一定恢复 ,
而对照组的变化不明显。 LIPPEMEIER等[ 11]的研
究表明 , 微小亚历山大藻在磷限制 9 d后 , 重新添
加磷培养 3 d后其 Fv/Fm从 0.42恢复到 0.67, 而
未重新添加磷的组 Fv/Fm继续下降 。 YOUNG和
BEARDALL[ 13]对杜氏藻的研究也表明 , 限制性营
养盐氮重新添加后 24 h内 , Fv/Fm从 0.4恢复到
0.7。这是因为营养盐限制的条件下 , 微藻处于
“饥饿 ” 状态 , 重新添加营养盐后出现 “奢侈性吸
收”。
过低或过高的磷浓度都会限制微藻的生长和光
合作用 , 影响微藻的基本生理功能 , 此实验结果表
明 , 小球藻生长和进行光合作用的最适磷浓度为
36.3 μM(即对照组的磷浓度)。微藻受到营养盐
限制后 , 叶绿素荧光会发生相应的变化 。限制性营
养盐重新添加后 , 荧光参数是否出现 NIFT反应 、
NIFT反应的大小 、 是否能够恢复以及恢复的程度
和微藻的种类以及营养盐限制的程度有着密切的联
系。因此 , 可以根据营养盐限制条件下叶绿素荧光
参数的变化情况 、 限制性营养盐添加瞬间各荧光参
数的 NIFT反应以及营养盐重新添加后各荧光参数
的恢复情况来判断微藻营养盐限制的情况 , 研究其
对营养盐限制条件的适应性 。
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