全 文 ：　　收稿日期:2002-07-13
作者简介:沈颂东 , 1968年生 ,男 , 安徽长丰人 , 博士 , 副教
授 ,主要从事藻类细胞生物学研究。
氮素对小球藻生长的影响
沈颂东
(苏州大学生命科学学院生物科学系 ,苏州　215151)
　　摘要:将淡水小球藻在不同浓度的氮素中培养 ,每天用分光光度计检测培养液在662 nm 和 632 nm 的吸
光度值 ,计算小球藻叶绿素的含量变化。研究结果表明 ,氮素浓度对淡水小球藻的影响因添加的氮源不同而
异 ,以尿素(NH2CONH2)为氮源 , 浓度在 20 mmol/ L以下时生长速度较快;而当 NaNO3 作为氮源时 , 生长速
度较快的浓度在 100 mmol/ L 左右。
关键词:小球藻;氮素;生长培养
中图分类号:S955.3+1　　文献标识码:A　　文章编号:1003-1278(2003)02-0055-03
　　小球藻 (Chlorel la vulgaris)为 绿藻门
(Chlo rophyta)小球藻属(Chlorella)普生性单细胞
藻 ,利用光能自养 ,生物量大 ,对生长条件要求简
单 ,环境耐受性强 ,繁殖速率高 ,单位光照面积的
水域培养小球藻的生物量是高等植物的数倍 。小
球藻的营养极其丰富 ,具有良好的保健作用 。其
中蛋白质含量占干重的 50%～ 67%,含有人体所
需的 20种氨基酸 、多种维生素 、微量元素 ,以及亚
麻酸 、亚油酸等不饱和脂肪酸等成分 。研究证明
小球藻细胞糖蛋白具有显著的抑瘤抗瘤 、增强免
疫和抗病毒感染的活性[ 1] 。
在水产养殖上 ,单细胞藻直接作为草食性鱼
类和鱼苗的饵料 ,或者作为肉食性鱼类仔鱼开口
期食用的丰年虫等动物的饵料 ,具有很高的经济
价值。如何在短时间内迅速扩大小球藻的浓度 ,
在水产养殖上非常重要。本研究的目的是探索最
适合小球藻生长的氮素浓度 ,促进小球藻的生长
和繁殖 ,使其更加有效地被人们所利用 。
1　材料与方法
1.1　材料
淡水小球藻由上海水产大学藻种室提供。
HN2CONH2和 NaNO3 均为分析纯 ,用蒸馏水配
制溶液。
1.2　方法
1.2.1　藻种的扩培　采用水生 6号培养液(每升
含有 NH2CONH2 0.133 g , MgSO4·7H2O 0.100
g ,NaHCO3 0.100 g , KCl 0.033 g , 1%FeSO4 0.2
mL ,CaCl2 0.030 g ,土壤浸出液 0.5 mL)扩增藻
种。实验采用 250 mL 三角瓶 ,小球藻的藻液量
为 100 mL ,在 LRH-250型光照培养箱中进行培
养 ,设定温度 27℃,光照周期为 12 L:12 D ,光照
强度为 2 500 lx 。每天定时摇动。
1.2.2　小球藻的吸光度扫描　取 5 mL 的藻液 ,
3 500 rpm 、5 min 离心 ,弃去上清液 ,在沉淀中加
入 2 mL 丙酮充分溶解 ,提取小球藻的叶绿素 ,在
Hitachi U-3010以双光束分光光度计上扫描其
在 300 ～ 700 nm 的吸光度值 ,确定以后分光光度
计测量时将采用的波长。
1.2.3　氮素种类和浓度的设定　将扩培到一定
浓度的藻液 ,3 500 rpm 、5 min离心 ,弃去上清液 ,
在沉淀中加入不含尿素的水生 6 号培养液 ,体积
为离心前的 10 倍 ,震荡均匀 ,进行分组实验。每
100 mL 稀释的藻液中分别添加 1 mol/L 的
NH2CONH2溶液 ,使最终尿素浓度分别为:0.2 、
0.5 、2.5 、5 、10 、15 、20 、50 、100 、200 mmol/L。原
来水生 6号的尿素浓度是 5 mmol/L 。另取稀释
的藻液添加 1 mol/ L的 NaNO3 作为氮源 ,最终浓
度为:1 、5 、10 、20 、30 、40 、50 、100 、200 mmol/L。
1.2.4　生长速率的测定　根据扫描结果 ,确定波
长662 nm 和 432 nm 时小球藻叶绿素有2个吸收
峰。每天用 UV755B型紫外光分光光度计 ,测定
在662 nm 和 432 nm 时的吸光度值。把每天测
定的光密度值登入表格 ,根据公式统计各浓度藻
液中叶绿素 a、叶绿素 b 、叶绿素总量的日均增长
率等。计算公式是:小球藻总叶绿素值=662 nm
测定值·8.02+632 nm 测定值·20.21[ 1 ,2] 。
·55·2003 年第 23卷第 2期　　　　　　　　　　　　水　利　渔　业　　　　　　　　　　(总第 126期)
DOI :10.15928/j.1674-3075.2003.02.025
2　结果
2.1　小球藻叶绿素吸光度的波长扫描结果
对丙酮提取的小球藻叶绿素在 Hitachi U-
3010双光束分光光度计上进行波长扫描 ,发现小
球藻叶绿素在可见光范围内有 2 个吸收峰 ,分别
在波长 661.8 nm和 431.6 nm(见图 1)。根据扫
描结果 ,确定 662 nm 和 432 nm 作为吸光度的测
定波长 。每天用 UV755B 型紫外光分光光度计 ,
测定在上述 2个波长时的吸光度值 。
图 1　小球藻的光谱测定
2.2　NO-3 对淡水小球藻生长的影响
用 NaNO3 作为氮源 ,小球藻的生长情况可用
肉眼直接观察出不同浓度间的差异 ,生长旺盛的
藻液颜色碧绿 ,随着藻体的生长而颜色加深 ,并且
很少沉底;反之则颜色变浅 ,沉底现象严重 ,终至
白色混浊(藻体死亡)。在实验的范围内(200
mmol/L),所有组的小球藻都能较快生长 ,氮浓度
越高 ,生命活动越旺盛 ,增殖越快 ,反复几次都是
如此 ,说明氮的浓度还没有达到上限 。根据吸光
度值分别计算叶绿素 a 和叶绿素 b的值 ,两项相
加得到总叶绿素的含量。根据每天总叶绿素含量
的增加量作图 ,组内标准差作双相误差线 ,结果见
图 2。
图 2　不同浓度 NaNO3 对小球藻生长量的影响
由图 2 可见 , NO-3 浓度在 30 ～ 200 mmol/L
时 ,总叶绿素每日增加量都在 2.5 g 以上 ,说明小
球藻对 NO-3 浓度的适应范围广 ,在高浓度 NO-3
时生长繁殖旺盛 ,在 NO-3 浓度高达 200 mmol/L
时 ,小球藻的生长速度虽然比 100 mmol/L 时有
所减慢 ,但是仍能够快速生长 ,提示小球藻对氮有
极高的耐受性 ,可以在富营养化严重的水中生长
从而除去水中过量存在的氮素 。从图 2还可以看
出 ,NO-3 浓度在 100 mmol/L 有最大的生长量 ,
而水生 6 号培养基中使用氮的浓度不超过 10
mmol/L ,提示我们在大量扩增小球藻时要加大氮
素的使用浓度 。
2.3　尿素对淡水小球藻生长的影响
用尿素作为氮源培养小球藻 ,根据每天总叶
绿素含量的平均增加量作图 ,组内标准差作双相
误差线 ,结果见图 3。
表 3　尿素对小球藻生长的影响
由图 3 可见 ,在尿素浓度超过 20 mmol/L
时 ,总叶绿素的日增加量明显低于低浓度组 ,甚至
低于完全不加尿素的对照组 ,说明在此浓度范围
内 ,尿素对小球藻产生了毒害作用。在尿素含量
较低时(<20 mmol/L),各组均生长良好 ,总叶绿
素日均增加量大于在较高 NO-3 浓度下小球藻的
生长速度 ,表明小球藻对尿素吸收更容易 ,利用率
更高 。从图 3可以看出 ,在极低的尿素浓度组(<
1 mmol/ L)中 ,小球藻仍能生长 ,可能在小球藻细
胞内氮的储存库 ,或者在小球藻细胞表面有主动
运输的通道存在 ,可以将尿素这一无极性的有机
小分子源源不断地逆着浓度梯度 ,由培养液输送
到细胞内 。
3　讨论
在自然水体中 ,氮主要以无机氮(N2 、NO-3 、
NO-2 、NH+4 )、可溶性有机氮(尿素 、游离氨基酸 、
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酰胺和维生素)和颗粒性有机氮(有机氮碎屑 、细
菌和浮游植物成分)的形式存在 ,在海洋中氮往往
成为初级生产力的限制因子。藻类不能直接利用
N2 ,却都能以 NH+4 、NO-3 、NO-2 为氮源 ,高浓度
的NH+4 和 NO-3 对藻类有毒;NO-2 一般在浓度
低到 1 mmol以下时才可作为氮源 ,浓度太高则抑
制藻类生长;尿素 、酰胺等有机物是藻类很好的氮
源;氨基酸 ,特别是甘氨酸 、丝氨酸 、丙氨酸和谷氨
酸也可作为某些浮游藻类 ,如扁藻 、栅藻等生长的
氮源 。
有研究表明[ 3] :海藻细胞内(细胞质或液泡
中)氮浓度较外界高 1 000倍 ,这使人们认为一定
存在一种逆着电化学势梯度的传递 ,因此主要是
主动传递过程 。硝酸还原酶(NR)可能作为这一
过程中的传递蛋白 ,但尚缺乏充足的实验证据。
大型海藻 NO-2 的吸收只研究了少数几个种类 ,
如刺松藻(Codium fragile)其 Vmax 值类似于
NO-3 吸收 ,但比 NH+4 的 Vmax 值低[ 3] 。
尿素是很多海藻很好的氮源[ 4] ,尽管由于它
是小而不带电的分子 ,应有较高的扩散率 ,但对尿
素吸收研究表明 ,它符合饱和动力 ,所以一般认为
是主动吸收 。对浮游植物的研究认为[ 5 ,6] ,对可
溶性有机氮的吸收并非一开始就传递进入细胞 ,
而是通过一些位于细胞表面的酶将有机氮降解成
NH+4 后被细胞吸收 。对这方面研究尚需进一步
开展 。
对淡水小球藻的培养条件优化的研究表明 ,
氮的浓度对小球藻的影响比较复杂 ,要视氮源而
论 ,当氮源为 NaNO3 时 ,淡水小球藻的生长高峰
在氮添加浓度为 0.08 ～ 0.16 mol/ L;而当尿素作
为氮源时 ,淡水小球藻的生长高峰在氮添加浓度
为 0.002 5 ～ 0.015 mol/ L。实验中发现氮的实验
组比较容易沉淀 ,有的会导致藻体的贴壁生长 ,所
以最适生长条件的标准不但要考虑到增长量 ,还
要尽量减少藻的沉淀 。
本次试验初步得出了影响淡水小球藻生长的
3个因素的数据 ,在一定程度上提高了小球藻的
光能转化率及其生长速率 ,达到了本试验的预期
目的 ,展示了藻类大规模培养的诱人前景。
参考文献:
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marine phytoplankton:A novel mechanism.Liminol
Oceanogr , 1990 , 35(2):260～ 269.
(责任编辑　万月华)
(上接第 54页)
2.3.2　千克鱼饲料成本　R1(鱼粉)=5.24>R4=3.06
(误差)> R3 = 2.55(微量元素)> R2=1.00(磷脂),
即:鱼粉是影响鲟鱼千克鱼饲料成本的主要因素 , 微量元
素 、磷脂油对鲟鱼千克鱼饲料成本的影响尚不如试验误
差大。
2.3.3　饲料经济效率　R1=9.04(鱼粉)>R4=4.48(误
差)>R3=3.71(微量元素)>R2=1.44(磷脂),即:鱼粉
是影响饲料经济效率的主要因素 , 微量元素 、磷脂油对饲
料经济效率的影响尚不如试验误差大。
2.3.4　饲料蛋白质效率　R1=1.12(鱼粉)>R4=0.62
(误差)>R3=0.54(微量元素)>R2 = 0.38(磷脂), 即:
鱼粉是影响饲料经济效率的主要因素 , 微量元素 、磷脂油
对饲料蛋白质效率的影响尚不如试验误差大。
2.3.5　群体相对增重率　R1=32.7(鱼粉)> R4=20.4
(误差)> R3=14.0(微量元素)> R2 = 10.5(磷脂),
即:鱼粉是影响群体相对增重率的主要因素 , 微量元素 、
磷脂油对群体相对增重率的影响尚不如试验误差大。
2.3.6　群体重量生长率　R1=0.65(鱼粉)> R4=0.42
(误差)> R3=0.29(微量元素)> R2=0.22(磷脂),即:
鱼粉是影响群体重量生长率的主要因素 , 微量元素 、磷脂
油对群体重量生长率的影响尚不如试验误差大。
3　讨论
根据上述各项技术经济指标的分析 , 可以看出 ,在本
试验各饲料配方中 ,以 A2 B3 C1 即 50%鱼粉 、15%磷脂 、
1%盐的搭配比例为最佳。 相对应的饲料粗蛋白为
43.61%,粗脂肪 19.41%, 无氮浸出物 14.84%, 代谢能为
1.7×104 kJ/kg , 与虹鳟对饲料的营养要求十分相近。
本试验油脂的添加比例最高为 15%, 未试验更高比
例的油脂对鲟鱼生长的影响。 微量元素的配方为美国冷
水性鱼类研究所提供 , 试验未考虑蛋白与油脂间的相互
影响。
(责任编辑　张俊友)
·57·2003 年第 23卷第 2期　　　　　　　　　　　　水　利　渔　业　　　　　　　　　　(总第 126期)