全 文 ：第 18卷第 3期 烟台大学学报(自然科学与工程版) V o.l 18 No. 3
2005年 7月 Jou rna l of Yantai University (Na tural Science and Eng inee ring Edition)　 Ju.l 2005　
　　文章编号:1004 -8820(2005)03 - 0206 -06
小球藻培养条件的研究①
于　贞 ,王长海
(烟台大学 生物工程系 ,山东 烟台 264005)
摘要:对影响小球藻生长的 NaHCO3 、NaNO3、KH2PO4、维生素等 4种主要营养因素进行了
优化 ,获得了以海水为基础的优化培养基配方:NaHCO3 0. 10 g /L, N aNO3 0. 225 g /L,
KH2PO4 0. 005 g /L, pH 6. 0.另外 , 适量添加土壤浸出液和维生素也会明显提高藻的产量.
流加培养可以促进小球藻生物量的增加.
关键词:小球藻;流加培养;维生素;土壤浸出液
中图分类号:Q949. 2　　　　文献标识码:A
小球藻 (Chlorella spp)为绿藻门 (Ch loropHy ta)小球藻属 (Ch lorella)单细胞藻 ,含有小球
藻多糖 、脂肪酸等多种营养成分 ,具有多种保健和药理作用 ,如小球藻多糖具有抗肿瘤 、抗病
毒 、抗血栓及增强机体的免疫功能等药理作用[ 1] . 经过热处理和破壁处理的小球藻 ,可直接
制成小球藻片 、小球藻颗粒剂或小球藻胶囊 ,适用于预防和辅助治疗高血压 、高血脂 、动脉粥
样硬化 、冠心病 、消化性溃疡 、免疫功能低下等疾病 ,还可用于减轻肿瘤放疗和化疗的副反
应[ 2] .小球藻粉还可用于开发具有更高附加值的精细化工产品和医药制品 ,如工业上用于
制取叶绿素 、脯氨酸 、油脂等;在医药领域用于提取有效活性成分制成各种医药制剂. 另外 ,
在环保方面小球藻可应用于污水处理.小球藻是光能自养型生物 ,它可和人形成一个循环系
统 ,即人呼出的 CO2可供小球藻生长 ,而小球藻产生的 O2可供人体呼吸之用 ,这使得小球
藻在航天方面具有重要的开发价值.
要更好地利用小球藻 ,首先要获得大量的小球藻藻体 ,本研究通过优化小球藻培养条件
来提高小球藻生物量 ,为其进一步的扩大培养提供依据.
1　材料与方法
1. 1　藻种与仪器
1. 1. 1　藻种来源　小球藻 (Chlorella spp)藻种由烟台大学海洋生化研究所提供.
1. 1. 2　仪器　HZQ -QG振荡箱 (哈尔滨东联电子技术开发有限公司);LDZX - 40BI型立
式自动电热压力蒸汽灭菌器 (上海申安医疗器械厂).
1. 2　实验方法
①收稿日期:2004 - 11 -01
作者简介:于贞(1973 ～ ),女 ,山东烟台人 ,讲师 ,硕士 ,主要从事海洋微藻方面的研究.
　第 3期　　　　　　　于　贞 ,等:小球藻培养条件的研究
1. 2. 3　生物量的测定　用血球计数板计数.
1. 2. 4　实验用培养基　在 f /2培养基基础上进行优化.
1. 2. 5　土壤浸出液的制备　首先取没有施化肥或农药的土壤在三角瓶 (1 L)底部铺上 1
cm厚的土层 ,随后加入 1 L蒸馏水 ,高压灭菌 30m in后 ,静置 24 h,倾出上清液即可使用 [ 3] .
1. 2. 6　培养条件　23℃ ,光强为 4. 5×103 lx,转速为 140 r /m in下培养
1. 2. 7　正交试验优化小球藻培养盐　小球藻生长所需要的营养元素有 15 ～ 20种 ,天然水
体的大多数元素都能满足它的需要 ,不会成为限制性因子. C、N、P是小球藻生长的主要营
养元素.
表 1　因素水平表
Tab. 1　Leve ls o f fac to rs
A B C D
pH
N aCO
3
/
g L - 1
NaNO
3
/
g L - 1
KH
2
PO
4
/
g L- 1
1 5 0. 05 0. 075 0. 005
2 6 0. 10 0. 150 0. 015
3 7 0. 15 0. 225 0. 025
　　小球藻营光自养生长 ,可直接利用空气中的 CO 2.
CO2主要以 HCO 3 -的形式被利用. 因此 HCO3 -盐可直
接作为小球藻生长的碳源〖4〗.氮是生物最重要的营养
成分 ,而硝酸盐一直是培养小球藻的一种普通氮源.
培养基的 pH是影响藻类有关生长代谢等许多生
理过程的另一重要因子. 本实验利用正交试验优化培
养基中 NaHCO3 、NaNO 3和 KH2 PO 4的浓度及小球藻生
长适宜的 pH ,采用 L9(34)正交表进行四因素三水平
正交实验。如表 1所示.
2　结果与讨论
2. 1　营养盐浓度和 pH值对小球藻生长的影响
按表 1设计的因素水平在光照培养箱中培养 ,结果如表 2所示.
表 2　正交试验及结果
Tab. 2　O rthogonal expe rim ents and results
pH NaCO3 /g L- 1 N aNO3 /g L - 1 KH2PO4 /g L - 1 生物量 /106 m L -1
1 1 1 1 1 28. 08
2 1 2 2 2 40. 07
3 1 3 3 3 36. 03
4 2 1 2 3 97. 5
5 2 2 3 1 122. 5
6 2 3 1 2 73. 12
7 3 1 3 2 108. 33
8 2 2 1 3 72. 00
9 3 3 2 1 98. 00
K 1 104. 18 233. 91 173. 2 248. 58
K 2 293. 12 234. 56 235. 56 221. 52
K 3 278. 33 207. 15 266. 86 205. 53
R 62. 99 9. 14 31. 22 14. 35
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烟台大学学报(自然科学与工程版) 第 18卷　
表 3　因素水平表
Tab. 3 Levels o f fac to rs
NaNO3 /g L -1 KH2PO4 /g L- 1
1 0. 225 0. 003
2 0. 3 0. 005
表 4实验结果
Tab. 4 Results of expe rim en ts
NaNO 3 /
g L - 1
KH2PO4 /
g L - 1
生物量 /
106 mL - 1
1 1 1 61. 25
2 1 2 88. 33
3 2 1 65. 00
4 2 2 38. 75
K 1 149. 58 126. 25
K 2 103. 75 127. 08
k
1 74. 79 63. 12
k2 51. 88 63. 54
　　由表 2可知 ,第 5组实验小球藻长势最好 ,且当
pH值在 6 ～ 7之间时小球藻生长情况较好 , pH值为
5时 ,小球藻的生长明显较差;当碳酸氢钠浓度小于
0. 10 g /L时 ,小球藻生物量随碳酸氢钠浓度的增加
而增加 ,但超过 0. 10 g /L时 ,小球藻的生物量又随之
下降;随着氮源水平的升高小球藻生长量逐步升高 ,
说明氮源水平取得不够 ,需作进一步实验;小球藻生
长量随磷源水平的升高而逐步下降 ,说明磷源水平
取得过高 ,应取较低的水平继续实验. 总之 ,通过分
析可知 ,较好的水平组合为 A2B2C3D1 ,比较四因素的
极差 R知 ,影响小球藻生长的因素的主次顺序为 A
>C>D >B ,说明 pH值对它的影响最大 ,其次是氮
源浓度.
为了对氮源和磷源水平作进一步的探索 ,设计
实验如表 3所示 ,结果见表 4.由表 4可知 ,小球藻的
生物量随 N aNO 3浓度的增加而下降 , 故培养基中
NaNO3最适浓度为 0. 225 g /L;小球藻的生物量随
KH2 PO4浓度的减少而下降 ,故培养基中 KH2 PO 4最
适浓度为 0. 005 g /L.
小球藻能利用光合作用将二氧化碳 、水和无机盐转化为有机物. 二氧化碳主要以
HCO 3
-形式被利用 , pH是影响培养基中 HCO3 -在总溶解状态的 CO 2所占比例的主要因素 ,
此外 , pH值也会影响光合作用 ,并影响培养基中藻细胞对离子的吸收和利用 ,以及代谢产物
的产生.因此 , pH是影响小球藻生长的重要因素 ,与正交试验的结果相符.
2. 2　维生素浓度对小球藻生长的影响
维生素是最早发现的生长因子 ,它们在小球藻生长过程中所起的作用主要是作为酶的
辅基或辅酶参与新陈代谢.
在已优化好营养盐和 pH值的培养基的基础上 ,设计单因素实验考察维生素需求量. 在
配好的培养基中按体积分数添加混合维生素量 0. 10 %、0. 13 %、0. 16%、0. 20 %,在光照
培养箱中培养 ,结果如图 1所示.由图 1可见 ,小球藻的生物量先是随着维生素添加量的增
加而增加 ,当维生素添加量超过 0. 16 %时 ,小球藻的生物量反而会下降 ,由此可知 ,培养基
中维生素的添加量以 0. 13% ～ 0. 16%为宜.
2. 3　通气量对小球藻生长的影响
小球藻进行自养生长时会利用 CO2放出 O2 ,培养基中通入大量的无菌空气既可为活细
胞提供碳源 ,而且会把抑制藻细胞生长的 O2排出 ,同时又有助于保持藻细胞处于悬浮状态
并促进营养物质运送到细胞表面.但通气量过大可能会损伤或杀死一些敏感细胞 ,应保持较
小的通气量 ,并且通气管道和过滤器都需无菌 [ 5] . 培养条件:500 mL培养基中添加 1. 5×
10
6
/mL的藻种于 4. 5×103 lx下培养 14 d,通气量水平取为:0, 0. 5, 1. 0, 1. 5, 2 L /m in,结
果如图 2所示. 从图 2可以看出 ,小球藻在通气量为 1. 5 mL /m in时 ,生物量最大. 当光照到
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　第 3期　　　　　　　于　贞 ,等:小球藻培养条件的研究
培养液表面时 ,藻体本身对光有遮挡作用 ,故入射光穿透培养液时存在着不断衰减的现象 ,
且随着培养密度的增加 ,这种光衰减现象会不断加重 ,因此增加通气量会加强培养液的混
合 ,使小球藻每一个细胞接受光照的机会均等.但过强的通气使之对细胞的剪切力加大 ,反
而不利于小球藻的生长 [ 5] .
2. 4　光照强度对小球藻生长的影响
对于营光合自养生活的小球藻而言 ,光是藻生长的重要限制因素.当温度和营养不限制
其生长时 ,光就成为影响小球藻自养生长的主要因素 ,即藻的生物量是光照的函数.
一般情况下 ,在一定光照范围内藻的光合作用效率会随光照度的增加而增加 ,但光照度
达到一定值时 ,光合作用效率几乎保持在一定水平 ,不再增加 ,这种现象称为光饱和效应.如
果光照度超过光饱和点一定限度后 ,藻的光合作用效率将会下降 ,导致细胞生长缓慢甚至死
亡 ,即光抑制现象.在光饱和点以下的光照度是藻生长的一个限制性因子〖4〗.
光强取 2. 0×103 , 3. 3×103 , 4. 5×103 , 5. 5×103 lx进行单因素实验 ,结果如图 3所示.
由图 3可看出 ,光强为 4. 5×103 lx时小球藻生长最好. 光合作用由光反应和暗反应两个过
程组成 ,当暗反应所需的中间产物不能从光反应中得到充分满足时 ,整个过程的速率完全取
决于光反应的速率 ,即随着光强的增加光合作用加强 ,小球藻的生长较快;若光反应形成了
大量中间产物 ,而暗反应速率已配合不上光反应的速率 ,此时光合作用的整体速率将只取决
于暗反应的大小 ,同时由于光照强度太强 ,会导致光合色素的光氧化和细胞中的某些酶受到
氧化伤害而使光合作用速率下降 ,因而存在一个适宜的光照强度 [ 5] .
2. 5　有机氮对小球藻生长的影响
氮是生物最重要的营养成分 ,硝酸盐一直是培养小球藻的一种普通氮源 ,但在实验过程
中发现 ,由于硝酸盐的消耗会使培养基的 pH变化较大.有研究表明 ,在藻类的生长过程中
消耗等量的氮 ,以尿素作氮源则比硝酸盐产生出较多的生物量 ,并引起培养基较小的 pH之
变化 ,因此添加尿素作为有机氮源考查其对小球藻生长的影响.
尿素浓度取为 0, 0. 30, 0. 60, 0. 90 g /L,在光照培养箱中培养 ,结果如图 4所示.
实验发现尿素是一种很好的有机氮源 ,并且在小球藻的培养过程中 ,培养基中 pH一直
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烟台大学学报(自然科学与工程版) 第 18卷　
非常稳定 ,当尿素浓度为 0. 30 g /L时小球藻生长最好 ,而浓度为 0. 90 g /L时则明显不如对
照组长得好 ,说明氮源量如果太多反而会抑制小球藻的生长.
2. 6　土壤浸出液对小球藻生长的影响
土壤浸出液往往含有一些含碳 ,氮 ,磷的有机物 ,无机盐和微量元素。这些成分有可能
成为小球藻生长所需要的营养成分.
在将营养盐及 pH优化好了的培养基中加入体积分数分别为:0, 0. 2%, 0. 4%, 0. 6%的
土壤浸出液 ,在光照培养箱中培养 ,结果如图 5所示. 由图 5可看出 ,添加土壤浸出液后 ,小
球藻的生长量明显高于未添加的 ,且添加量在 0. 4 %为最好.
3　结　论
pH是影响小球藻生长的重要因素.光照强度和通气量通过影响小球藻光合作用强度而
影响小球藻的生长. 小球藻可以利用尿素作氮源. 添加适量的土壤浸出液有利于小球藻的生
长.通过试验得小球藻的优化培养基配方为:NaHCO3 0. 10 g /L, N aNO3 0. 225 g /L, KH2PO 4
0. 005 g /L,维生素的添加量为 0. 13% ～ 0. 16%,尿素量为 0. 30 g /L,土壤浸出液为 0. 4 %.
环境条件为 pH值 6. 0,光照强度 4 , 500 lx,通气量 1. 5 L /m in.
参考文献:
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　第 3期　　　　　　　于　贞 ,等:小球藻培养条件的研究
Optmi ization ofCulture Conditions ofChlorella spp
YU Zhen, WANG Chang-hai
(Department o f B ioeng inee ring, Yantai University, Yantai 26400, China)
Abstrac t:Fou r nutrient compositions mainly affecting the g row th ofCh lorella spp such asNaHCO3,
NaNO3 , KH 2 PO4 , and v itam inshave been optim ized as fo llow s:N aNO 3 0. 2 2 5 g /L , KH 2 PO 4
0. 005 g /L, NaHCO3 0. 10 g /L, pH6. 0. M o reove r, the add ition o f so il ex tract and vitam insw ith
appropria te amoun t can considerably improve the output of Ch lorella spp. Fed-ba tch cultu re can
a lso stimu late the accumu lation o f b iom ass o fChlorella spp.
Key words:Chlorella spp;fed-ba tch cu lture;v itam ins;so il ex tract
(责任编辑　周雪莹)
(上接第 170页)
一阶退化椭圆型复方程在多连通区域上
的 Riemann-H ilbert边值问题
闻国椿
(北京大学 数学学院 ,北京 100871)
摘要:讨论一阶退化椭圆型复方程在多连通区域上的 Riem ann-H ilbe rt边值问题. 文中先给
出这种边值问题的表示式 , 然后证明上述边值问题解的存在性和唯一性.
关键词:Riem ann-H ilbe rt边值问题;退化椭圆型复方程;多连通区域
中图分类号:O175. 2;O175. 8　　　　文献标识码:A
(责任编辑　周雪莹)
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