全 文 ：第 20卷第 5期
2001年 9月
水　产　科　学
FISHERIES　SCIENCE Vol.20 , No.5Sep., 2001
小球藻固定化培养的初步研究

杨海波 , 于　媛 , 张欣华 , 李英敏
(大连大学 化学化工系 , 辽宁　大连　116622)
摘　要:用海藻酸钙作固定化载体, 初步探讨了海藻酸钠浓度 、 CaCl2 浓度 、 胶球密度 、 胶球直径等固定化条件对
小球藻 (Chlorel la vu lgaris)生长的影响。确定了优化的固定化条件为:用 4#针头 、 2 %的海藻酸钠溶液和 0.15
mol/ L 的 CaCl2 溶液制备固定化小球藻 , 在含 50 mL 培养液的 150 m L 三角烧瓶内放置 250个小球藻胶球时 , 其生
长速率较高 , 生长周期较长。与游离的小球藻相比 , 固定化小球藻生长速率慢 , 但生长周期长。实验结果为微藻固
定化技术的应用和发展提供了必要的实验数据和理论基础。
关键词:小球藻;固定化;培养条件
中图分类号:Q942.217　　　文献标识码:A 　　　文章编号:1003-1111(2001)05-0004-04
　　固定化作为构建生物反应器的一项重要的生物工
程技术 , 最初用于酶的固定化 , 随后用于细菌 、 酵母
等微生物活细胞的固定化培养 , 在大量的基础研究和
生产实践中 , 已经取得了十分显著的经济效益和社会
效益。然而对藻类细胞的固定化研究 , 在 20 世纪 80
年代才开始进行探索性的工作 , 初步的研究结果表
明 , 微藻固定化在有用物质及能源生产 、 生物传感
器 、 污水处理 、 种质保存及模拟生物反应器等领域具
有广阔的应用前景[ 1 , 2] 。
海洋微藻的固定化以能进行放氧型光合作用的海
洋生物为研究对象 , 从而使固定化技术在海洋生物技
术领域中开辟了新的研究和应用方向 , 因此 , 其研究
成果不仅为海洋生物资源的研究 、 开发和利用提供更
广阔的应用前景 , 而且也将丰富现有的固定化理论和
技术。然而 , 海洋微藻固定化的基础性研究工作还相
当薄弱 , 本文以海藻酸钙为固定化载体 , 以具有全面
均衡营养价值及多种应用前景的小球藻[ 3]为固定化对
象 , 初步研究固定化条件对其生长的影响 , 以期为固
定化培养海洋微藻技术的应用和发展提供必要的实验
依据和理论基础。
1　材料和方法
1.1　材料
藻种由辽宁省海洋水产研究所提供;海藻酸钠系
北京市旭东化工厂生产 , 化学纯及其他药品均为市售
分析纯。
1.2　培养条件
培养液为经过滤 、 煮沸后冷却的海水 , 并加入
0.1 %的康维营养液。室温培养 , 自然光照。
1.3　固定化胶球的制备
将一定体积的不同质量浓度的无菌海藻酸钠溶解
液与培养至对数生长期的小球藻藻液按一定比例混合
均匀 , 选用不同型号的针头及针管 , 将混合液滴入一
定浓度的 CaCl2 溶液中 , 边滴边摇动 , 静止 15 min
后 , 将形成的海藻酸钙———细胞固定化胶球用无菌去
离子水清洗三次 , 移入 150 mL 三角烧瓶内 , 并加入
50 mL 培养液培养。每 4 d 取相同个数的胶球并计算
其体积 , 往胶球中加入一定体积的 0.1 mol/ L 的柠檬
酸钠溶液溶解胶球。藻细胞密度用血球计数器在显微
镜下观测获得。
2　结果与讨论
2.1　海藻酸钠浓度对固定化小球藻生长的影响
　收稿日期:2000-12-18; 修回日期:2001-04-25.基金项目:辽宁省科学技术基金资助项目 (001059)作者简介:杨海波(1968-), 女 , 副教授 , 博士 , 专业方向:生物化工.
DOI :10.16378/j.cnki.1003-1111.2001.05.002
为获得处于固定化状态的微藻 , 首先应保证固定
化胶球本身具有一定的强度 、 粒度和孔隙度等 , 以防
止固定化胶球散落 , 同时保证微藻生长过程中底物和
代谢产物及时进出胶球 , 维持微藻处于较好的生长条
件。Smidsr d[ 4]和韩丽君[ 5]等研究了不同来源的海藻
酸盐作为细胞固定化基质的性质 , 发现海藻酸盐的粘
度与其分子量大小有关 , 分子量越大 , 其粘度越大 ,
相应所形成的胶球的机械强度也大。海藻酸盐所形成
胶球的机械强度也与其浓度有关 , 且当浓度大于一定
值时 , 主要受浓度影响。
本实验结果 (图 1)表明 , 海藻酸钠的浓度明显
影响固定化小球藻细胞的生长 , 使用 2 %的海藻酸
钠 , 可使固定化小球藻有最高的生长速率并在较长时
间内维持生长。实验过程中发现 , 使用 1.0 %的海藻
酸钠时 , 培养液随培养时间延长逐渐变为绿色 , 说明
凝胶球散落 , 包埋于珠内的细胞游离至培养液中 , 使
测得的细胞密度低。随着海藻酸钠浓度的增大 , 其与
CaCl2溶液所形成的凝胶网格逐渐致密 , 凝胶珠的机
械强度增高 , 藻细胞能够较好地包埋于其中 , 并通过
凝胶网格的孔隙获得培养液中的营养 , 排除代谢物 ,
但当海藻酸钠浓度达到 2.5 %后 , 所形成的凝胶网格
过于致密 , 从而加大了培养液中的底物和藻细胞产生
的代谢物进出凝胶珠的阻力 , 使细胞生长环境逐渐恶
化 , 随培养时间延长 , 珠内的营养不断消耗 , 代谢物
质不断增多 , 细胞开始衰老 , 并逐渐死亡。
图 1　海藻酸钠浓度对固定化小球藻生长的影响
实验条件:4#针头 , 0.15 mol/ LCaCl2
2.2　CaCl2 浓度对固定化小球藻生长的影响
韩丽君等人考察了不同浓度的 CaCl2 溶液与不同
来源的海藻酸钠形成凝胶珠后 , 其强度的变化规律。
发现海藻酸钠中甘露糖醛酸(M)越高 , 所形成胶球的
强度越差;古罗糖醛酸(G)越高 ,所形成胶球的强度越
高。而凝胶颗粒的机械强度与 CaCl2 浓度无关。 Smid-
sr d 则认为凝胶球内的 CaCl2 浓度直接影响微藻细胞
的生长。
本实验结果(图 2)表明 ,用 0.15 mol/ L的 CaCl2 溶
液与 2 %的海藻酸钠形成的凝胶珠 , 小球藻细胞的生
长量最大 , 表明此时所形成的凝胶珠的机械强度和孔
隙度适合于其生长 ,当 CaCl2 浓度低时 , 形成的凝胶珠
的强度差 , 藻细胞向培养液中分散 , 而当 CaCl2 浓度高
时 , 形成的凝胶珠的强度大 ,增加了底物和产物进出胶
球的扩散阻力 , 影响细胞正常生长。当 CaCl2 浓度为
0.25 mol/ L 时的细胞生长量大于浓度为 0.20 mol/ L
时的细胞生长量 , 是因为前者在凝胶珠内的 Ca2+浓度
大于后者在凝胶珠内的 Ca2+浓度 , 而 Ca2+正是细胞生
长所需要的元素。此结果与 Smidsr d 的结论相似。
图 2　CaCl2 浓度对固定化小球藻生长的影响
实验条件:4#针头 , 2 %海藻酸钠
2.3　胶球密度对固定化小球藻生长的影响
培养液中的胶球密度直接影响藻细胞对营养盐的
吸收和光的利用 , 进而影响胶球内部细胞的生长。实
验用 4#针头 , 0.15 mol/ L的 CaCl2 溶液 , 2 %的海藻
酸钠制备胶球 , 分别在含 50 mL 培养液的 150 mL 的
三角烧瓶中放入 150 , 250 , 350 个胶球 , 得到固定化
细胞的生长情况如图 3所示。
当胶球为 350 个时 , 培养液中的营养盐消耗较
快 , 同时胶球之间互相遮光 , 使得光照不足 , 从而引
起藻细胞衰老和死亡。胶球为 150 个时 , 则可避免上
述问题 , 使藻细胞有较长的生长周期 , 但低的细胞密
度使其对外界环境的变化比较敏感 , 细胞易受损伤 ,
生长速率较慢 , 因此 , 在含有 50 mL 培养液的 150
mL 的三角烧瓶中 , 放 250 个凝胶球时 , 可使固定化
5第 5期　　　　　　　　　　　杨海波等:小球藻固定化培养的初步研究
小球藻有较快的生长速率和较长的生长周期。
图 3　胶球密度对固定化小球藻生长的影响
2.4　胶球直径对固定化小球藻生长的影响
不同型号的针头 , 其内径不同 , 由其所形成的凝
胶球的直径也不同 , 型号越大 , 胶球直径越大。采用
上面所确定的优化条件 , 分别用 4#, 6#, 8#针头
制备固定化胶球 , 得到固定化细胞的生长情况如图 4。
图中结果表明 , 用 4#针头制备的胶球 , 细胞生长速
率快 , 生长周期长。胶球直径越大 , 所产生的扩散传
质阻力越大 , 胶球内细胞所需营养不足 , 积累的代谢
物过多 , 细胞生长环境恶化 , 同时由于直径过大 , 使
得胶球内部的光照不足 , 这些不利条件使得大直径的
固定化小球藻生长不好。
图 4　胶球粒径对固定化小球藻生长的影响
2.5　游离和固定化小球藻的生长比较
通过以上对小球藻固定化条件的考察 , 获得优化
的固定化条件为:用 4 #针头 , 2 %的海藻酸钠 ,
0.15 mol/ L 的CaCl2 , 在含 50 mL 培养液的 150 m L三
角烧瓶内放置 250个胶球时 , 小球藻有较好的生长速
率和较长的生长周期。按此条件将小球藻进行固定化
培养 , 比较游离和固定化的小球藻的生长情况 , 结果
见图 5。
固定化小球藻的生长速率明显低于游离小球藻的
生长速率 , 但游离小球藻的生长周期较短 , 在经历了
对数生长期后 , 迅速进入死亡期。 测定培养液 pH 值
发现 , 此时的 pH 值明显高于生长期的 pH 值 , 说明
细胞分泌了大量的碱性物质 , 从而导致细胞死亡。细
胞固定化后 , 虽然生长比较缓慢 , 但在实验周期内 ,
一直处于不断的生长阶段 , 表明固定化小球藻具有较
长的生长周期 , 这对于构建生物反应器 , 从中获取有
价值的活性物质是十分有利的。
图 5　游离和固定化小球藻的生长比较
3　小结
虽然海产微藻的固定化研究起步较晚 , 但对其在
某些领域的探索性研究工作已经表明 , 固定化微藻具
有十分广阔的应用前景 , 因此 , 进一步的工作需要脚
踏实地对其进行深入细致的研究。以上讨论了各种固
定化条件对固定化后小球藻生长的影响 , 从中确定了
有利于固定化小球藻生长的优化固定化条件 , 为海产
微藻的固定化研究提供一些必要的基础实验数据 , 进
一步工作将研究分析影响固定化小球藻分泌代谢物的
因素及提高有效活性物质含量的方法和手段。
参考文献:
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[ 5] 　韩丽君 ,范晓 ,郑乃余.用于固定化载体的海藻酸钙凝
胶条件的研究[ J] .海洋科学 , 1992(3):56-59.
Study on Immobilization Culture of Marine Microalga ,
Chlorella vulgaris
YANG Hai-bo , YU Yuan ,ZHANG Xin-hua , LI Ying-min
(Depar tment of Chemistry and Chemical Eng ineering , Dalian University , Dalian 116622 , China)
Abstract:Alginate-Ca was used as the immobilized matrix , the effects of some immobilized conditions on the grow th of
Chlorella vulgaris were discussed.the optimal immobilized conditions w ere:4# syringe , 2 % alginate , 0.15 mol/ L Ca-
Cl2.The immobilized Chlorella vulgaris produced w ith these optimal conditions had high grow th rate and long grow th pe-
riod w hen it w as cultured in 150 mL flask containing 50 m L medium.Compared with the free Chlorella vulgaris , the im-
mobilized Chlorella vulgaris had slow er grow th rate , but longer grow th period.The results provided some necessary exper-
imental data and theo retical foundation fo r the application and development of the technology of microalg al immobilization.
Key words:Chlorella vulgaris;immobilization;culture condition
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