全 文 ：第 32 卷 第 1 期 海 洋 环 境 科 学 Vol ． 3 2 ，No ． 1
2 0 1 3 年 2 月 MARINE ENVIRONMENTAL SCIENCE February 2 0 1 3
小球藻培养条件优化及油脂积累特征
王俊彩1，赵阳国1，2，师振华1，王亚洁1，杜明玥1，李新伟1
(1．中国海洋大学 环境科学与工程学院，山东 青岛 266100;2．海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛 266100)
摘 要:为探索小球藻光生物反应器培养和油脂积累的最佳条件，就 pH和不同浓度的 NO3-N、Mg2 +、Fe3 +和 Zn2 +等环境因
素对小球藻生长的影响进行了探讨，同时应用尼罗红染色荧光法对各环境因子条件下小球藻细胞内油脂积累状况进行了动
态监测;继而应用正交实验对显著影响小球藻生长和油脂积累的培养条件进行了组合优化。结果表明:高浓度的 NO3-N、
Mg2 +、Fe3 +可促进小球藻的生长，而 Zn2 +则抑制其生长，pH对其生长及油脂积累影响不明显;在一定范围内，氮限制和高
浓度的金属离子可以有效地促进小球藻油脂的积累;小球藻最优培养条件组合为:Fe3 +浓度为 12 μmol /L，Zn2 +浓度为 7． 2
μmol /L，NO3-N浓度为 0． 3 mmol /L。
关键词:小球藻;油脂;NO3-N;金属离子
中图分类号:Q945 文献标识码:A 文章编号:1007-6336(2013)01-0011-06
Optimization of cultivation conditions and characteristics of
lipid accumulation of Chlorella sp．
WANG Jun-cai1，ZHAO Yang-guo1，2，SHI Zhen-hua1，WANG Ya-jie1，DU Ming-yue1，LI Xin-wei1
(1． College of Environmental Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266100，China;2． Key Laboratory of Ma-
rine Environment and Ecology，Ministry of Education，Qingdao 266100，China)
Abstract:In order to obtain the optimal cultivating and oil-producing parameters，the influence of NO3-N，Fe3 +，Mg2 + and Zn2 + con-
centrations on the growth of Chlorella sp． was explored． The Nile Red was used to examine the lipid content of Chlorella sp． at the same
time． The factors affecting the growth and oil-production of Chlorella sp． were optimized by the orthogonal experimental design． Chlo-
rella sp． showed the fast-growing under high concentration of NO3-N，Mg2 + and Fe3 +，while high Zn2 + inhibited its growth． The
change of pH has little influence to its growth． It concluded that nitrogen limit and high concentration of Mg2 + or Fe3 + could improve
the lipid content in Chlorella sp． The orthogonal experiment showed that the optimal cultivation condition was a group of factors contai-
ning 12 μmol /L Fe3 +，7． 2 μmol /L Zn2 + and 0． 3 mmol /L NO3-N for Chlorella sp．
Key words:Chlorella sp．;lipid;NO3-N;metal ion
随着化石能源的日渐匮乏，生物柴油逐渐受到人们
的关注和重视。以动植物油脂为原料的第一代生物柴油
已经实现工业化，但生物柴油的原料却因有限的耕地面
积而受到限制;第二代生物柴油的显著特征是以微藻油
脂为原材料，能有效地解决第一代生物柴油的原料限制
问题。微藻是光合效率最高的原始植物之一，与农作物
相比，单位面积的产率可高出数十倍［1］。目前，对微藻生
物柴油的基础研究很多，但是还没有实现规模化生产。
筛选高品质油藻、选择最佳培养条件以提高单位质量微
藻油脂含量、降低微藻生物柴油成本，是解决微藻生物柴
油商业化生产的关键途径。
脂肪酸生物合成途径是以乙酰辅酶 A 为底物，经乙
酰辅酶 A羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase，ACCase)
催化后进入脂肪酸合成途径。该酶促反应是脂肪酸合成
和氧化过程中限制速率的关键调节步骤，因此乙酰辅酶 A
羧化酶是脂肪酸生物合成途径的关键限速酶［2］。研究表
收稿日期:2012-04-24，修订日期:2012-06-06
基金项目:国家自然科学基金(40801193) ;山东省中青年科学家科研奖励基金(BS2011NJ018) ;中国海洋大学国家大学生创新性实
验计划
作者简介:王俊彩(1988-) ，女，河南安阳市人，硕士生，主要从事微藻生物柴油研究，E-mail:coolfallwjc@ 163． com
通讯作者:赵阳国(1975-) ，男，山东济南市人，副教授，硕士生导师，主要从事海洋微生物学研究，E-mail:yg． zhao@ yahoo． com． cn
12 海 洋 环 境 科 学 第 32 卷
明，适当的 pH和金属离子浓度可以提高乙酰辅酶 A羧化
酶的活性［2-3］。同时，有研究表明，培养过程中氮源限制
可以在很大程度上促进小球藻油脂的积累［4-5］。然而，综
合考虑影响微藻生长和油脂积累的各种因素，并进行选
择优化，是提高微藻生物量和油脂含量的重要手段。
本研究以代表性的产油微藻———小球藻为研究对
象，通过改变基础培养基中 NO3-N、Fe
3 +、Mg2 +和 Zn2 +的
浓度来探讨影响小球藻生长和油脂积累的环境因子，选
取对小球藻影响较大的因子进行正交实验，筛选微藻的
最佳培养条件，为小球藻的扩大培养提供理论参考和数
据支撑。另外，本研究采用油脂特异性荧光染料 －尼罗
红(NileRed)对各环境因子条件下小球藻细胞内油脂进行
快速监测，为使用高通量方法筛选富油微藻及对富油微
藻培养条件的优化提供技术保障。
1 材料与方法
1． 1 藻种来源
本实验所采用的小球藻(Chlorella sp．)分离自青岛近
岸海水，初步测定该藻的油脂含量约为 10%。
1． 2 实验设计
实验采用不加硅(Si)的 f /2 培养基［6］，其中海水取自
青岛近岸，经 0． 45 μm 膜过滤高压蒸汽灭菌后使用。取
600 mL 培养基加入锥形瓶中，高压蒸汽灭菌后，按 30∶ 1
接入对数期的小球藻，藻接种后的初始浓度为 OD750 =
0． 010，置于光照培养箱(LRH-250-G，韶关市泰宏医疗器
械有限公司)中培养。培养温度(22 ± 1)℃，光照强度
3 500 lx，光暗比 12 h∶ 12 h，每天定时手摇四次。
以不加硅的 f /2 培养基为基础，分别探讨小球藻在单
一因子改变时(即 pH、NO3-N、Mg
2 +、Fe3 +或 Zn2 +) ，小球
藻生长及油脂含量变化，每种条件设置 3 个重复，本研究
探讨的单因子及其范围如表 1 所示。
通过单因子实验研究发现，NO3-N、Fe
3 +和 Zn2 +对小
球藻的生长及油脂含量影响较大，故选取 NO3-N、Fe
3 +和
Zn2 +三个影响因子各三个水平，优化小球藻的生长及产
油条件。采用正交实验设计软件(正交设计助手Ⅱ v3． 1)
对影响小球藻的重要因子 NO3-N、Fe
3 +和 Zn2 +，按 L3(3
4)
正交表进行设计，结果如表 2 所示。
表 1 本研究采用的单因素梯度
Tab． 1 Design of single-factor gradient experiment in this
study
项目 梯度
pH 6． 5、7． 0、7． 5、8． 0、8． 5
NO3-N /mmol·L-1 0． 3、0． 6、1． 2、1． 8、2． 4、3． 0、3． 6、
4． 2、4． 8
Mg2 + /mmol·L-1 0． 6、0． 9、1． 2、1． 5、1． 8
Fe3 + /μmol·L-1 0． 012、0． 12、1． 2、12
Zn2 + /μmol·L-1 2． 4、12、24、36、48
表 2 小球藻培养条件优化正交实验表
Tab． 2 Orthogonal experiments for optimization of cultivation
conditions of Chlorella sp．
实验组
因素 A
Fe3 + /μmol·L-1
因素 B
Zn2 + /μmol·L-1
因素 C
NO3-N /mmol·L-1
1 1． 2 2． 4 0． 3
2 1． 2 7． 2 0． 6
3 1． 2 12 4． 8
4 6． 6 2． 4 0． 6
5 6． 6 7． 2 4． 8
6 6． 6 12 0． 3
7 12 2． 4 4． 8
8 12 7． 2 0． 3
9 12 12 0． 6
1． 3 分析方法
1． 3． 1 微藻生物量测定
根据文献［4］的方法，采用分光光度法检测微藻的生
物量。每隔 24 h 取藻液，用 722N 型可见光分光光度计
(上海精科) ，测定其在 750 nm处的吸光度。
1． 3． 2 油脂含量测定
据研究［7-8］，微藻细胞内油脂经尼罗红(NileRed)染
色后，在激发波长为 480 nm 条件下，可于波长为 575 nm
处检测到与油脂含量成正相关的荧光。每隔 24 h 取藻
液，在进行分光光度法测定其浓度后，调整其浓度至
OD750 = 0． 040，用终浓度为 1 μg /mL的尼罗红溶液对藻液
染色 5 min，用 F4600 型分子荧光光度计(日本日立公司)
在波长为 480 nm处激发后，检测其波长为 575 nm处的荧
光值。
1． 3． 3 统计分析
应用 SPSS for windows(SPSS Inc．，美国)对微藻在不
同条件下的生物量和油脂含量进行统计分析，计算标准
偏差。对微藻培养条件优化的正交实验结果，应用正交
设计软件(正交设计助手Ⅱ v3． 1)的直观分析法进行统计
分析，筛选最佳培养条件组合。
2 结果与讨论
2． 1 pH对小球藻生物量和油脂积累的影响
图 1 为小球藻在 f /2 培养基中，pH 分别为 6． 5 ～ 8． 5
时生长和油脂积累的情况。根据该图发现，在一定范围
内，高的 pH可以促进小球藻的生长，但其效果并不显著。
在整个培养过程中，小球藻的油脂含量总体呈上升
趋势。结合该条件下的生长曲线可以看出，小球藻油脂
的积累主要在其生长后期(9 d以后) ，这可能是由于在该
时期营养元素浓度逐渐降低，某些生长限制性元素缺乏
导致了其油脂含量的积累［4-5］。培养末期，藻液的荧光值
最大，为接种时荧光值的 7 倍。
第 1 期 王俊彩，等:小球藻培养条件优化及油脂积累特征 13
图 1 不同 pH条件下小球藻的生长(a)及油脂积累(b)
曲线
Fig． 1 Growth (a)and lipid accumulation (b)of Chlorella
sp． under different pH conditions
在 pH 6． 5 ～ 8． 5 的范围内，不同的 pH对小球藻的油
脂积累并没有显著的影响，但不能肯定强酸或强碱性环
境对小球藻油脂积累是否有影响。Sasaki等经研究发现，
豌豆叶绿体中羧基转移酶(carboxyltransferase，CT)和生物
羧化酶(biotin carboxylase，BC)复合体与生物素羧基载体
(biotin carboxyl carrier protein，BCCP)结合后，叶绿体基质
内的 pH 从 7． 0 上升到 8． 0，ACCase 的活性增加了 10
倍［7］，可见，pH可能主要是通过改变 ACCase 的活性来改
变脂肪酸的合成量的。有研究表明，当 pH 的范围在 6． 8
～ 8． 5 之间时，微藻的多不饱和脂肪酸的生产受 pH 的影
响较小;但 Molina等发现球等鞭金藻(Isochrysis galbana)
在 pH 6． 0 ～ 8． 0 范围内，总脂含量变化不大，但二十碳五
烯酸(EPA)含量随 pH 上升而下降，在 pH 6． 0 时含量最
高［9］。这也说明，pH对不同藻种油脂含量及组分的影响
存在很大的差异。
2． 2 NO3-N对小球藻生长和油脂积累的影响
氮元素是小球藻生长的必要元素之一，过高或过低
的氮含量都会对小球藻的生长产生影响。有研究显示，
以 NO3-N 作氮源时，蛋白核小球藻中性脂肪含量最
高［10］。由图 2(a)可以看出，培养初期不同浓度的氮含量
对小球藻的生长影响不明显。从第 8 天开始，小球藻的
生长在 NO3-N浓度为 3． 0 mmol /L 的条件下呈现出明显
的优势，并且这种优势一直持续到培养末期。同时可以
看出，当NO3 -N浓度为0 ． 3mmol / L时，小球藻的生长受
图 2 不同氮浓度下小球藻的生长(a)及油脂积累(b)曲
线
Fig． 2 Growth (a)and lipid accumulation (b)of Chlorella
sp． under different NO3-N conditions
到抑制，这说明较低的氮含量会抑制小球藻的生长。
不同氮素浓度下，小球藻的油脂积累与其生长曲线
呈现明显的相反趋势，如图 2(b)。在氮浓度较低的条件
下，小球藻表现出明显的油脂积累。在第 5 ～ 19 天的培养
过程中，在 NO3-N 浓度为 0． 3 mmol /L 的培养条件下，小
球藻的油脂含量较其他培养条件要高，藻液荧光值约为
其他条件下的 2 倍。
在 NO3-N浓度为 0． 6 mmol /L的培养条件下，从第 16
天开始，小球藻内的油脂开始大量积累，并比其他条件下
呈现出显著的优势。在该条件下，培养末期的小球藻藻
液的荧光值可达培养初期的 14 倍之多;而在 NO3-N浓度
为 1． 2 mmol /L 的培养条件下，最大荧光值仅为培养初期
的 4 倍左右。
从该组实验可以看出，氮限制可以显著刺激小球藻
的内部反应，并促进油脂的大量积累。这也与以往研究
氮限制可促进油脂的积累的结论相似［11-12］，这可能是因
为贮存脂类和绝大部分膜脂不含氮元素，在氮缺乏条件
下仍能继续合成，而含氮化合物(如蛋白质和核酸)的合
成急剧下降，在氮缺乏时微藻中贮存脂类对膜脂的比例
急剧上升，因而合成贮存脂类的酶系活力也明显增加［13］。
2． 3 Mg2 +对小球藻生长和油脂积累的影响
如图 3 所示，不同 Mg2 +浓度对小球藻的生长影响较
小。在油脂积累上，Mg2 +浓度为 1． 2 mmol /L 时，油脂含
量最低。在其他 4 种条件下，小球藻油脂的积累差别并
14 海 洋 环 境 科 学 第 32 卷
不大。培养末期，藻液荧光值最大约为培养初期的 8 倍。
有报道表明，Mg2 +对植物脂肪酸合成关键酶 ACCase的活
性有一定对影响，Mg2 + 浓度的变化可以改变该酶的活
性［14］。Sasaki等研究发现，豌豆叶绿体中 CT 和 BC 复合
体与 BCCP结合后，在改变叶绿体基质内的 pH 时，ACCa-
se的活性增加了 10 倍，而在此过程中 Mg2 + 浓度为 2． 5
mmol /L［7］。在本研究中，提高 Mg2 +的浓度对小球藻油脂
积累的影响并不明显，可能与微藻脂肪酸合成酶系与植
物存在差异有关。
图 3 不同Mg2 +浓度下小球藻的生长(a)及油脂积累(b)
曲线
Fig． 3 Growth (a)and lipid accumulation (b)of Chlorella
sp． under different Mg2 + conditions
2． 4 Fe3 +对小球藻生长和油脂积累的影响
参照文献［18］的研究方法，对不同 Fe3 +浓度在小球
藻生长和油脂含量方面的影响进行研究。本研究表明，
Fe3 +对小球藻的生长及油脂积累都有较大的影响(图 4)。
有研究发现，在海洋中，存在高氮、低叶绿素含量的初级
生产力极低的区域，其限制因子就是海水中可利用铁的
含量低于临界浓度，通过补铁可以明显提高初级生产
力［15］。在一定范围内，高浓度的 Fe3 +能促进小球藻的生
长及油脂含量的积累，这与金属离子可以改善乙酰辅酶 A
羧化酶的活性有关，而该酶的活性是微藻细胞内控制油
脂合成的限制性因素。Jay 等研究发现，增加离子强度可
以使 ACCase中的 BC更好地溶解在叶绿体中［16］。在 AC-
Case的催化作用下，乙酰辅酶 A产生丙二酰辅酶 A，从而
保证油脂合成的顺利进行［17］。
图 4 不同 Fe3 +浓度下小球藻的生长(a)及油脂积累(b)
曲线
Fig． 4 Growth (a)and lipid accumulation (b)of Chlorella
sp． under different Fe3 + conditions
从生长曲线及油脂积累曲线上我们可以看出，12
μmol /L的 Fe3 +浓度不仅可以促进小球藻的生长，还可以
促进其油脂的积累。这与刘志媛和王广策的研究［18］略有
不同，在其研究中，该浓度对小球藻生物量积累略显抑
制，这可能是由于应用的藻种不同所致。本研究中，Fe3 +
浓度为 12 μmol /L时，培养末期荧光值可达到培养初期的
7 倍以上。而在低浓度的 Fe3 +培养基中，小球藻的生长比
较缓慢，而且小球藻的油脂含量在整个培养周期内几乎
没有变化，水平一直较低。
2． 5 Zn2 +对小球藻生长和油脂积累的影响
与 Fe3 +相反，在一定范围内，较高的 Zn2 +浓度明显的
抑制了小球藻的生长和油脂的积累，而低浓度的 Zn2 +则
促进小球藻体内油脂的积累(图 5)。有文献报道，Zn2 +对
小球藻的半致死浓度为 13 μmol /L［19］。由此可见，在
Zn2 +浓度为 24 μmol /L、36 μmol /L 和 48 μmol /L 的条件
下，Zn2 +对小球藻产生了毒性作用，限制了小球藻的生长
及油脂的积累。而在 Zn2 + 浓度为 2． 4 μmol /L 和 12
μmol /L的条件下，小球藻能够较好地生长和进行油脂的
积累。特别是 Zn2 +浓度为 2． 4 μmol /L时，培养末期藻液
的荧光值可以达到接种初期的 10 倍以上，说明在此条件
下 Zn2 +可以有效地促进小球藻油脂的积累;在该条件下
小球藻的生长也比较迅速。
2． 6 小球藻培养条件的优化
对小球藻藻液的吸光度及荧光值数据进行统计分
第 1 期 王俊彩，等:小球藻培养条件优化及油脂积累特征 15
析，把结果输入正交设计软件，利用直观分析法对其进行
统计分析，结果如表 3。其中生物量及油脂含量为本次实
验的两个分析指标，A、B、C分别代表培养基中 Fe3 +浓度、
Zn2 +浓度和 NO-3浓度三个影响因素，ki代表不同影响因素
的不同水平梯度。极差 R反映了某一影响因子对实验结
果影响的程度，值越大，影响越显著。
图 5 不同 Zn2 +浓度下小球藻的生长(a)及油脂积累(b)曲线
Fig． 5 Growth (a)and lipid accumulation (b)of Chlorella sp． under different Zn2 + conditions
表 3 小球藻实验结果直观分析表
Tab． 3 Visual analysis for orthogonal experiments of Chlorella sp．
指标 A B C 空列
生物量 k1 0． 677 0． 803 0． 763 0． 762
k2 0． 809 0． 786 0． 821 0． 818
k3 0． 854 0． 751 0． 756 0． 761
极差 R 0． 177 0． 052 0． 065 0． 057
因素主次 ACB
优方案 A3C2B1
油脂含量 k1 0． 863 1． 223 2． 049 1． 128
k2 1． 312 1． 604 1． 168 1． 408
k3 2． 075 1． 423 1． 033 1． 714
极差 R 1． 212 0． 381 1． 016 0． 586
因素主次 ACB
优方案 A3C1B2
通过对影响小球藻培养的单因子实验，发现氮素、
Fe3 +和 Zn2 +的浓度在一定范围内均对微藻的生物量和油
脂积累具有重要影响。然而，若将较好的单因子条件简
单叠加以获得微藻的最佳培养条件，其结果可能与实际
状态差别很大，故此，有必要将这几个单因子组合在一
起，通过正交实验探讨微藻最佳培养条件下各因子的实
际浓度。
由于实验指标为小球藻的生物量和油脂含量，所以
值越大越好。
(1)因素 A
从表 3 和图 6 可以看出，对于小球藻生长和油脂含量
两个指标来说，都是以 A3为最佳水平;但也有研究指出，
Fe3 +的添加量为 0． 002 mmol /L时所培养出来的小球藻生
长速度和藻体中的脂肪含量较高［20］，其研究 Fe3 +的最高
添加量为 0． 004 mmol /L，较本实验的研究范围小很多，这
说明不同的小球藻，其最适的 Fe3 +浓度存在较大差异。
(2)因素 B
如表 3 和图 6 所示，对于生长状况，B1为最佳水平;但
对于油脂含量来说，B2明显占优势，且该优势远高于生物
量中 B1 的优势。另外，对于这 2 个指标来说，极差 R 都
为三项指标中的最小值，这说明因素 B 都处于末位的影
响因素，所以因素 B 选取哪一个水平对 2 个指标的影响
都较小，故从获取油脂角度，B2水平可为实验最优浓度水
平。
(3)因素 C
C是较次要因素，但是从 ki上可以看出，C1和 C2对小
球藻生长状况影响较小，而对油脂含量的影响较大。有
研究显示，氮饥饿可以触发藻类大量积累中性脂肪［10］。
在氮浓度较低时，小球藻的生长速度随着氮浓度的增高
而增加;在氮含量增加到 1． 4 mmol /L时，生长速度反而降
低［20］，本实验的研究结果也显示了同一规律。
根据 C因素对 2 个指标的不同重要程度，应选取可
以增加小球藻油脂含量的最佳水平 C1。
此外，生长和油脂含量两个指标空列的极差 R 值都
比较小，说明其他影响小球藻培养的因素可能性较小，本
实验设计比较合理。
综合上述的分析，从微藻油脂含量和生物量角度看，
最优方案为 A3B2C1，即 Fe
3 +浓度为 12 μmol /L，Zn2 +浓度
16 海 洋 环 境 科 学 第 32 卷
图 6 小球藻生长(a)及油脂积累(b)正交实验趋势图
Fig． 6 Growth (a)and lipid accumulation (b)tendency of orthogonal experiment for Chlorella sp．
为 7． 2 μmol /L，NO-3浓度为 0． 3 mmol /L。
3 结 论
(1)小球藻的油脂积累主要集中在生长的稳定期，不
同条件对小球藻的生长及油脂含量影响差别很大。
(2)在 pH 6． 5 ～ 8． 5 的范围内，小球藻的生长及油脂
含量变化不明显。在 NO-3浓度为 3． 0 mmol /L 时，小球藻
生物量最高;在 NO-3浓度为 0． 6 mmol /L的培养条件下，小
球藻油脂积累比其他条件更具优势。
(3)在 Mg2 +浓度为 0． 6 ～ 1． 8 mmol /L的范围内，对小
球藻的生长影响较小。Fe3 +对小球藻的生长及油脂积累都
有较大的影响，高浓度的 Fe3 +能促进小球藻的生长及油脂
含量的积累。在一定范围内，较高的 Zn2 +浓度能够显著抑
制小球藻的生长和油脂的积累，而低浓度(2． 4 μmol /L)的
Zn2 +则促进小球藻的生长和体内油脂的积累。
(4)该小球藻培养的最佳油脂积累条件为:Fe3 +浓度
12 μmol /L，Zn2 +浓度 7． 2 μmol /L，NO-3浓度 0． 3 mmol /L。
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