全 文 ：第 29 卷 第 1 期
2011 年 1 月
北京工商大学学报(自然科学版)
Journal of Beijing Technology and Business University(Natural Science Edition)
Vol. 29 No. 1
Jan． 2011
文章编号:1671-1513(2011)01-0054-05
自养小球藻培养条件的优化
张正洁， 汪 苹
(北京工商大学 食品学院，北京 100048)
摘 要:在无菌条件下，对影响自养小球藻生长的主要因素进行优化． 实验表明，优化结果对小球
藻的生长有显著影响． 通过正交试验和单因素实验得到了以 BG－11 培养基为基础的优化培养条
件:Na2CO3质量浓度为 0. 02 g /L、初始 pH 值为 7、N /P 为 30、接种量为 5%、温度 25 ℃、光照强度
8 800 lx． 该优化条件有效地提高了自养小球藻的生长速率．
关键词:小球藻;自养培养;培养基
中图分类号:TS201. 3 文献标志码:A
收稿日期:2010-09-13
基金项目:国家“十一五”科技支撑计划项目(2007BAK36B07)．
作者简介:张正洁，女，硕士研究生，研究方向为小球藻的固碳作用及其产物;
汪 苹，女，教授，主要从事水污染控制工程、废水生物处理及反应器方面的研究． 通讯作者．
小球藻为绿藻门(ChloropHyta)小球藻属(Chlo-
rella)的一种单细胞绿藻，其生态分布广，世界上已
知的小球藻现有 15 种左右，加之其变种可达百种之
多［1］． 我国常见的种类有普通小球藻(Chlorella vl-
garis)、椭圆小球藻(Ch. ellipsoidea)和蛋白核小球藻
(Ch. py-renoidosa)． 小球藻富含蛋白质、不饱和脂肪
酸(亚油酸、亚麻酸、DHA、EPA等)、类胡萝卜素、虾
青素和多种维生素［2］，具有极高的营养价值和提高
免疫力的功效． 其中不饱和脂肪酸(PUFA)更具有
广泛的生物学活性，具有抗血栓、降血脂等功能，尤
其对心脑血管、关节炎等疾病有良好的防治作用．
此外，DHA还能促进脑细胞的生长发育，改善大脑
机能［3］． 传统上，深海鱼油是不饱和脂肪酸的主要
来源，但从鱼油中提取的不饱和脂肪酸存在腥臭味，
且处理过程复杂． 微藻作为水体中初级生产力，具
有合成不饱和脂肪酸的能力［4］，且藻体内 PUFA 的
相对含量远远高于鱼油中的含量，从藻细胞中提取
的 PUFA 产品没有腥臭味，不含胆固醇成分，避免了
服用鱼油胶囊时摄入大量胆固醇的缺点． 此外，小
球藻还含有一种非常重要的成分———小球藻生长因
子，它既具有诱发干扰素激发人体防御和免疫组织中
的巨噬细胞、T细胞和 B细胞的功能，又具有人体对环
境污染有害物质解毒和排泄的作用［5］． 因此，小球藻被
联合国粮农组织列为 21世纪人类健康食品．
小球藻作为光能自养型生物，可利用 CO2作为
碳源供其生长，虽多数微藻在 CO2环境浓度为1% ～
5%时生长良好，但现已发现可将微藻驯化为耐受高
浓度 CO2的藻种
［6］，由此对酒精发酵工艺中排出的
高纯度 CO2(每年约 500 万吨)吸收利用，既节约了
资源，又减少了温室效应的发生． 基于小球藻的上
述特点，美国、日本、以色列等国家先后开发出现代
化的小球藻培养技术并成为小球藻的主要生产国．
目前该领域在我国研究较少，国内开展此项工作，其
经济效益和社会效益前景广阔［7］．
利用小球藻固定 CO2并得到高不饱和脂肪酸等
产物，需获得大量藻体． 本研究以普通小球藻为材
料，考察温度、光照强度、接种量、pH 值以及营养成
分对小球藻生长速率、细胞积累量的影响，寻求最优
培养条件，提高小球藻生物量，以期为今后大规模培
养小球藻提供参考．
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 藻种来源
本实验藻种购自中国科学院水生研究所淡水藻
45
库无菌普通小球藻 1068 藻株(Chlorella vlgaris 1068
strain)．
1. 1. 2 培养基配方
本实验在 BG－11 培养基的基础上进行优化，1L
BG－11 培养基由 5 种储备液(1 ～ 5)及 NaNO3构成．
分别取储备液 1:2 mL，2:20 mL，3:2 mL，4:1 mL，5:1
mL及 1. 5 g NaNO3于容量瓶中定容至 1 L，调 pH 值
为 7. 5． 储备液配方如下:
储备液 1(g /L) 柠檬酸 0. 3 g，柠檬酸铁铵 0. 3
g，Na2-EDTA0. 05 g．
储备液 2(g /L) KH2 PO4 1. 5 g，MgSO4·7H2 O
3. 75 g．
储备液 3(g /L) CaCl2·2H2O 1. 8 g．
储备液 4(g /L) NaCO3 2 g．
储备液 5(g /L) H3 BO3 2. 86 g，MnCl2·4H2 O
1. 81 g，ZnSO4·7H2O 0. 222 g．
NaMoO4·5H2O 0. 39 g，CuSO4·5H2O 0. 079 g，Co
(NO3)2·6H2O 0. 049 g．
其中，储备液 1，3，4 定容至 100 mL;储备液 2，5
定容至 1 000 mL．
1. 2 实验方法
1. 2. 1 生物量的测定
接种后，每日定时于超净工作台取样，以血球计
数板法测定小球藻的细胞个数，绘制生长曲线，计算
藻体生长速率． 计算公式［5］:
K = 2. 303(lgN － lgN0)/ t，
T = 0. 693 /K． (1)
式(1)中，K 为生长速率，d －1;N0为起始细胞密度，
106 mL －1;N为经过 t 时间的细胞密度，106 mL －1;T
为平均世代时间，d;t为生长时间，d．
实验采用 25 × 16 型血球计数板，细胞密度:
N =(80 个小格内细胞个数 /80)× 400 × 104 ×稀释
倍数．
1. 2. 2 培养条件的确定
100 mL培养液装于 250 mL三角瓶内，121 ℃灭
菌 20 min． 超静工作台接种、取样，置于 25 ℃光照
培养箱中自养培养，光照强度 8 800 lx，光暗比为 12∶
12，每日定时于 160 r /min摇床内摇 15 min．
1. 2. 3 正交试验优化培养基
小球藻生长所需的营养元素有 15 ～ 20 种，大多
数元素不会成为限制性因子，其中 C、N、P是其生长
的主要营养元素［5］，对小球藻的生长及其产物的积
累有较大影响．
小球藻利用空气中的 CO2进行光自养生长，
CO2主要以 HCO
－
3 的形式利用，因此 HCO
－
3 盐可作为
小球藻生长的碳源［8］． 空气中 CO2体积分数为 380 ×
10 －6，溶解于水中的 CO2将与空气中的 CO2分压产
生平衡，符合亨利定律:
x*A = yA × P /kA (2)
式(2)中，x*A 为溶质 A在液相中的浓度;P为大气压
强，在本实验过程中取标准大气压值 101 325 Pa;kA
为亨利系数(Pa) ;yA为溶质 A在气相中的浓度．
查得 25 ℃ 下，Ka = 1. 66 × 108 Pa，yA =
0. 038%，P = 101 325 Pa．
xA = nCO2 /nH2O = yA × P /kA，
mH2O = 1 g /mL × 100 mL =100 g，
nH2O =mH2O /MH2O =
100 g /18(g /mol)= 5. 55 mol，
nCO2 = (yA × P /kA) × nH2O =
(0. 038% ×101 325 /1. 66 × 108) × 5. 55 =
1. 29 × 10 －6 mol，
mCO2 =MCO2 × nCO2 =
44(g /mol) × 1. 29 × 10 －6mol =
56. 6 × 10 －6g = 0. 056 mg．
由计算可知，每 100 mL 的培养基中均有 0. 056
mg 的 CO2溶于水中． 自养小球藻利用空气中的 CO2
供其生长，因此在优化培养基条件时 Na2CO3的质量
浓度无须过大．
氮、磷是生物生长所需的重要营养成分． 一般
认为，氮、磷是限制藻类增殖的重要因素，而硝酸盐
和磷酸二氢钾一直是培养小球藻的一种普通氮源、
磷源，一定的氮磷比将促进小球藻细胞的增长．
培养基的 pH值是影响藻类生长代谢等许多生
理过程的另一重要因子，并影响光合作用中 CO2的
可用性［9］． 小球藻存活的 pH值范围为 4. 5 ～ 10. 6，
pH值较低，碳源主要以 CO2和 H2CO3的形式存在，
不利于小球藻的利用;pH 值较高，小球藻细胞易老
化，细胞繁殖受到强烈抑制而导致生长缓慢． 因此，
接近中性的 pH值最有利于小球藻的生长［10］． ，
本实验利用正交试验优化培养基中的 Na2 CO3
浓度、N /P、pH值，并考虑 Na2CO3质量浓度和 pH 值
的交互作用，采用 L9(3
4)正交表(表 1)进行 3 因素
3 水平正交试验．
55第 29 卷 第 1 期 张正洁等:自养小球藻培养条件的优化
表 1 因素水平表
Tab． 1 Levels of factors
水平
因素
ρ(Na2CO3)/(g·L －1) pH N /P
1 0. 02 6 15
2 0. 05 7 30
3 0. 1 8 45
2 结果与讨论
2. 1 营养盐浓度和 pH值对小球藻生长的影响
根据表 1 数据，在光照培养箱中光照培养，接种
量为 10%、温度 25 ℃，光照强度 8 800 lx，光暗比为
12∶ 12，每日定时于 160 r /min 摇床内摇 15 min． 培
养 12 d于超静工作台内取样，血球计数板法测定小
球藻的细胞个数并计算细胞密度． 实验与直观分析
结果见表 2．
表 2 正交试验与直观分析结果
Tab． 2 Results and analysis of orthogonal tests
实验组
ρ(Na2CO3)/
(g·L －1)
pH
ρ(Na2CO3)×
pH
N /P
N /
(106 mL －1)
1 1 1 1 1 35. 35
2 1 2 2 2 43. 95
3 1 3 3 3 35. 80
4 2 1 2 3 40. 25
5 2 2 3 1 35. 15
6 2 3 1 2 37. 85
7 3 1 3 2 29. 85
8 3 2 1 3 31. 05
9 3 3 2 1 33. 50
K1 38. 376 35. 150 34. 750 34. 667
K2 37. 750 36. 717 39. 233 37. 217
K3 31. 467 35. 717 33. 600 35. 700
极差 R 6. 900 1. 567 5. 633 2. 550
表中 K1、K2、K3 分别代表不同因素同一水平下结果的平均值，R
为级差．
表 2 中，第 3 列设计为 ρ(Na2CO3)与 pH 值的
交互作用列． 4 种因素对小球藻生长的影响按级差
R的大小排列为 ρ(Na2 CO3)＞ ρ(Na2 CO3)× pH ＞
N /P ＞ pH，ρ(Na2CO3)及 ρ(Na2CO3)与 pH值的交互
作用对小球藻生长的影响最为显著，pH 值和 N /P
对其生长的影响因素较小，不构成显著影响．
通过比较 K1、K2、K3 可知，当 Na2 CO3的质量浓
度大于 0. 05 g /L 时，小球藻的生物量明显下降，而
小于 0. 05 g /L时，随 Na2CO3质量浓度的降低生物量
稍有增加，但此趋势明显减缓． 由此得出优化培养
基配方:ρ(Na2CO3) :0. 02 g /L;pH值:7;N /P:30． 此
结果与正交试验中长势最好的第 2 组实验条件相
同，无需验证．
2. 2 正交试验中的交互作用
小球藻通过光合作用将二氧化碳、水和无机盐
转化为有机物． 二氧化碳主要以 HCO －3 形式被利
用，pH 值是影响培养基中 HCO －3 在总溶解状态的
CO2所占比例的主要因素，因此 pH值与 ρ(Na2CO3)
二者将产生一定的交互作用，这与实验结果相符．
据表 2 可知，按级差 R的大小排列，ρ(Na2CO3)
与 pH值的交互作用对小球藻生长的影响仅次于
ρ(Na2CO3)． 对于如此明显的交互作用在实验中应给
予关注． 表 3为 ρ(Na2CO3)与 pH值的交互作用表．
表 3 ρ(Na2CO3)与 pH值交互作用
Tab． 3 Interaction of ρ(Na2CO3)and pH
106 mL －1
pH
N
ρ(Na2CO3)/(g·L －1)
0. 02 0. 05 0. 1
6 35. 350 40. 250 29. 850
7 43. 950 35. 150 31. 050
8 35. 800 37. 850 33. 500
由表 3 可知，Na2 CO3质量浓度为 0. 02 g /L，pH
值为 7 时小球藻的生长密度最高，长势最优．
2. 3 接种量对小球藻生长的影响
本实验将 9 个 250 mL三角瓶分为 3 组，每组接
种量分别为 5%，10%，15%(V /V) ，三角瓶装液量为
100 mL，置于光照培养箱中培养 7 d，每日定时于超
净工作台内取样，以血球计数板计数，测定结果取平
均值，结果见表 4，生长曲线如图 1．
表 4 不同接种量的测定结果
Tab． 4 Measured results with different inoculum
接种量 /%
5 10 15
N0 /(106 mL －1) 3. 15 5. 05 7. 9
Nt /(106 mL －1) 24. 85 26. 65 28. 8
细胞积累量 /(106 mL －1) 21. 7 21. 6 20. 9
生长速率 /d － 1 0. 295 0. 238 0. 185
提高接种量是缩短延滞期的有效措施之一． 一
65 北京工商大学学报(自然科学版) 2011 年 1 月
图 1 接种量对小球藻生长的影响
Fig． 1 Effects of inoculums on grows of Chlorella． sp
般情况下，接种量越多其延滞期越短，但由于接种量
的增加在一定程度上造成了装液量的增加，从而导
致液面与空气接触面积减小，影响溶解氧． 实验中
10%，15%的接种量无论生长速率，还是细胞的积累
量均小于 5%的接种量，且随接种量的增加，生长速
率依次减小，细胞积累量依次降低，由此确定接种量
以 5%为宜． 这与潘欣［10］、张丽君［11］得出的 10%为
最佳接种量的结论不符．
2. 4 温度对小球藻生长的影响
微生物的生长和产物的合成都是在各种酶的催
化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在
微生物发酵系统中必须保证稳定而适合的温度环境
条件［11］．
在本实验中，取 9 个 250 mL 三角瓶分为 3 组，
分别置于 20，25，30 ℃下培养． 三角瓶装液量为 100
mL，接种量为 5%，光照培养箱中培养 7 d，每日定时
于超净工作台内取样，以血球计数板计数，测定结果
取平均值，结果见表 5，生长曲线如图 2． 比较从
20 ～ 30 ℃的 3 种不同温度梯度的培养结果，在 25 ℃
的条件下，小球藻的细胞积累量及其生长速率均好
于 20 ℃和 30 ℃ ． 因此，当温度为 25 ℃时最适宜自
养小球藻的生长．
表 5 不同温度下的测定结果
Tab． 5 Measured results with different temperature
t /℃
20 25 30
N0 /(106 mL －1) 1. 40 1. 65 1. 70
Nt /(106 mL －1) 13. 00 24. 05 18. 95
细胞积累量 /(106 mL －1) 11. 60 22. 4 17. 25
生长速率 /d － 1 0. 318 0. 383 0. 345
2. 5 光照强度对小球藻生长的影响
小球藻作为光合自养型生物，光是影响其生长
的重要限制因素． 当温度和营养元素不限制其生长
图 2 温度对小球藻生长的影响
Fig． 2 Effects of temperature on grows of Chlorella． sp
时，光就成为影响小球藻自养生长的主要因素．
一般情况下，在一定光照范围内藻的光合作用
效率会随光照强度的增加而增加，但光照强度达到
一定值时，光合作用效率几乎保持在一定水平不再
增加，这种现象称为光饱和效应． 如果光照强度超
过光饱和点后，藻的光合效率将会下降，导致细胞生
长缓慢甚至死亡，即光抑制限制． 在光饱和点以下
的光照强度是藻生长的一个限制性因子［12］．
实验中，光照强度分别取 4 400，8 800，13 200 lx
进行单因素实验，结果见表 6，生长曲线如图 3． 光
照强度为 8 800 lx时，小球藻长势最好，其生长速率
最快，细胞积累量最大． 光合作用由光反应和暗反
应两个过程组成，当暗反应所需的中间产物不能从
光反应中得到充分满足时，整个过程的速率完全取
决于光反应的速率，即随着光照强度的增加光合作
用加强，小球藻的生长较快;若光反应形成了大量中
间产物，而暗反应速率已配合不上光反应速率，此时
光合作用的整体速率将只取决于暗反应的大小，同
时由于光照强度太强，会导致光合色素的光氧化和
细胞中的某些酶受到氧化伤害而使光合作用速率下
降，因而存在一个适宜的光照强度［13］．
表 6 不同光照强度下的测定结果
Tab． 6 Measured results with different illumination
光照强度 / lx
4 400 8 800 13 200
N0 /(106 mL －1) 2. 25 3. 05 3. 00
Nt /(106 mL －1) 34. 15 44. 00 38. 9
细胞积累量 /(106 mL －1) 31. 90 40. 95 35. 9
生长速率 /d － 1 0. 371 0. 381 0. 365
3 结 论
小球藻含有大量陆地生物所缺乏且十分独特的
75第 29 卷 第 1 期 张正洁等:自养小球藻培养条件的优化
图 3 光照强度对小球藻生长的影响
Fig． 3 Effects of illumination on grows of Chlorella． sp
生物活性物质，具有生长快，产量高，可定向培养，适
应能力强，易调控等特点，因而是许多高附加值生物
制品的重要来源． 利用小球藻含有的活性物质已成
为目前各国的研究热点之一，其开发利用前景广阔，
因此研究在培养过程中如何提高小球藻细胞密度及
其生长速率具有重要意义．
BG－11 培养基适用于小球藻的培养，但培养效
果不甚理想． 为寻求最佳的培养条件，提高生长速
率，缩短培养周期，得到大量藻体，本实验通过 3 因
素 3 水平正交试验，以及接种量、温度、光照强度单
因素实验，得到了以 BG－11 培养基为基础的优化培
养基配方:Na2CO3质量浓度为 0. 02 g /L、初始 pH 值
为 7、N /P为 30、接种量为 5%、温度 25 ℃、光照强度
8 800 lx． 实验显示，经优化培养基培养的小球藻的
生长速率为 0. 381 d －1，细胞积累量达到 40. 95 × 106
mL －1，而在未经优化培养基条件下，其生长速率为
0. 107 d －1，细胞积累量为 5. 5 × 106 mL －1 ． 速率提高
了 3. 561 倍，细胞积累量提高了 7. 45 倍，说明该优
化培养基有效地提高了小球藻的生长速率及细胞积
累量，为该藻的高密度大规模培养提供了有力依据．
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Optimization of Culture Conditions of Chlorella． sp
ZHANG Zheng-jie， WANG Ping
(School of Food，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)
Abstract:The effects of culture conditions on the growth of Chlorella． sp were studied． The nutrient fac-
tors showed obvious effect on Chlorella． sp． The culture conditions based on BG-11 were optimized by or-
thogonal experiments:Na2CO3 0. 02 g /L，the initial pH 6，the ratio of nitrogen to phosphorus 30，inocu-
lum 5%，temperature 25℃，illumination 8 800 lx． Under the optimal culture conditions，the growth rate
of Chlorella． sp was enhanced significantly．
Key words:Chlorella． sp;autotrophic culture;medium
(责任编辑:叶红波)
85 北京工商大学学报(自然科学版) 2011 年 1 月