全 文 ：第 47卷第 4期
2 0 07年 7月
大 连 理 工 大 学 学 报
Journal of Dalian University of Technology
Vol. 47,No. 4
Jul. 2 0 0 7
文章编号: 1000-8608( 2007) 04-0509-06
收稿日期: 2006-04-20;　修回日期: 2007-03-09.
基金项目: 国家“十五”重点科技攻关课题资助项目 ( 2001BA707B03) .
作者简介: 王逸云* ( 1974-) ,女 , 博士生 , E-mai l: yanw yy@ sina. com; 王长海 ( 1963-) ,男 , 教授 ,博士生导师 .
小球藻基因工程选择标记研究
王 逸 云* ,　王长 海
(大连理工大学 生物工程系 , 辽宁 大连　 116024 )
摘 要: 研究了小球藻对 10种常见抗生素: 庆大霉素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉
素 、链霉素、 G418、潮霉素、 Zeocin和氯霉素的敏感性 ,发现小球藻对庆大霉素、新霉素 、氨苄
青霉素、卡那霉素、头孢霉素和链霉素不敏感 ;对 G418和潮霉素较敏感 ;对 Zeocin和氯霉素最
敏感 . 利用统计学的方法和原理 ,确定了 G418、潮霉素、 Zeocin和氯霉素在海水培养基和淡化
10倍的培养基中对小球藻的半致死剂量和 95% 可信限 . 为筛选出小球藻基因工程藻株的选
择试剂 ,建立其遗传转化系统奠定了基础 .
关键词: 小球藻 ; 抗生素 ; 半致死剂量 ; 选择标记
中图分类号: Q949. 217 文献标识码: A
0　引　言
海洋藻类是海洋中重要的初级生产者 ,其种
类繁多 ,数量庞大 ,且利用太阳能效率高 ,具丰富
营养 ,是重要的生物资源 . 随着陆地生物资源的
日益匮乏 ,开发海洋 ,利用海洋 ,向海洋要食品、要
药品、要能源已成为人们的共识 ,因此海洋藻类 ,
尤其是经济种类基因工程的研究和开发潜力越来
越受到关注 . 近几年来 ,海洋大型藻类基因工程
研究已取得了一定的进展 [ 1～ 4] ,但对海洋微藻的
转化报道还较少 . 小球藻是一种单细胞真核绿
藻 ,作为生物反应器可对复杂蛋白进行正确的翻
译后加工 ,形成有活性的分子 ;同时又具备微生物
的特点 ,生长繁殖迅速 ,培养条件简单 ,生产成本
相对低廉 ,易于大规模培养 ;对其基因组结构与功
能的研究也日益深入 ,因而小球藻是进行基因工
程研究的较理想材料 [ 5] . 迄今有关小球藻基因工
程的研究多集中于淡水小球藻 [ 5～ 10 ] ,对于海水小
球藻的相关研究还未见报道 . 本实验室选用一种
海水小球藻 — — Chlorel la sp. MACC /C95为实
验材料 ,探索用它进行遗传操作的可能性 .
建立遗传转化系统中一个关键的环节是确定
　　
适合的选择标记基因 ,以便于把转化体同非转化
体分开 . 目前 ,真核藻类的选择标记基因研究得
还不太完善 . 以往的报道中 ,对海带、裙带菜、金
藻、盐藻 ,及淡水小球藻的选择标记基因进行了较
系统的研究 [5、 11～ 16 ] . 但是 ,海水生小球藻尚未有
这方面的报道 . 因此 ,为筛选到海水生小球藻
(Chlorella sp. M ACC /C95)基因工程的选择试
剂 ,选择 10种抗生素 ,研究小球藻对它们的敏感
性 ,并测定抗生素对小球藻的半致死剂量和 95%
可信限 ,以期为这种海水生小球藻遗传转化系统
的建立提供参考和依据 .
1　材料和方法
1. 1　小球藻来源及培养方法
小球藻 (Chlorel la sp. MACC /C95)购自中国
海洋大学微藻室 . 培养温度 ( 25± 0. 5)℃ ,光强
1. 0～ 1. 6mW /cm2 ,持续光照 ,培养液为 f /2培养
基 ,所用海水取自大连水产学院近海海域 ,并经孔
径 0. 22μm的玻璃纤维滤膜过滤除菌 .
1. 2　抗生素来源及配制
氯霉素、氨苄青霉素、链霉素、新霉素购自
Sigma公司 ; G418、潮霉素、卡那霉素、 Zeocin购自
　　　
Invi t rog en公司 ;庆大霉素、头孢霉素购自郑州豫
新制药有限公司 . 抗生素母液的配制参照文献
[17 ] ,用 0. 22μm的玻璃纤维滤膜过滤除菌 .
1. 3　小球藻在海水液体培养基中的抗生素基础
抗性测定
取对数生长期的藻液 ,按 10% 的接种量接种
到海水液体培养基中 ,加入各种抗生素至终浓度
为 100、 200、 300、 400、 500μg /mL, 并设置空白对
照组 ,每天观察小球藻的生长状况 ,并计数 . 每组
实验重复 3次 .
1. 4　液体培养基中抗生素对小球藻半致死剂量
的测定
取对数生长期的藻液 ,按 10% 的接种量分别
接种到海水液体培养基和淡化 10倍的液体培养
基中 (起始浓度约为 106个 /mL) . 根据统计学的
要求 ,设计 1. 3中小球藻敏感的选择试剂浓度 (选
择试剂终浓度设置见表 1、 2) . 在 24、 48、 72、 168 h
数细胞数 ,统计死亡率 ,每组实验重复 3次 . 用寇
氏法计算抗生素对小球藻的半致死剂量 [18 ] ,计算
公式为
lgLD50 = X m - I (∑ P - 0. 5) ( 1)
式中: X m为最大剂量的对数值 ; I为相邻剂量比值
的对数值 ;∑ P为各组死亡率的总和 .
lg (LD50的 95% 可信限 ) = lgLD50± 1. 96SlgLD
50
( 2)
式中
S lgLD
50
= I (∑ ( pq /n ) ) 12 ( 3)
p为各组的死亡率 ; q为各组的存活率 ; n为各组细
胞的数目 .
表 1　海水培养基中测定 LD50的抗生素终浓度设置
Tab. 1　 Concentra tion o f antibio tics in seawa ter m edium fo r LD50 de termining
抗生素 d/ (μg mL- 1)
潮霉素 0 20 40 80 160 320 640 1 280 2 560
G418 0 10 20 40 80 160 320 640 1 280
氯霉素 0 2. 5 5 10 20 40 80 160 320
Zeocin 0 2. 5 5 10 20 40 80 160 320
表 2　淡化培养基中测定 LD50的抗生素终浓度设置
Tab. 2　 Concentra tion o f antibio tics in decr easing NaCl concentr ation medium fo r LD50 determining
抗生素 d/ (μg mL- 1)
潮霉素 0 10 20 40 80 160 320 640 1 280
G418 0 2. 5 5 10 20 40 80 160 320
氯霉素 0 1. 25 2. 5 5 10 20 40 80 160
Zeocin 0 1. 25 2. 5 5 10 20 40 80 160
2　结果和分析
2. 1　海水液体培养中小球藻对 10种抗生素的基
础抗性
实验结果如表 3所示 ,小球藻对卡那霉素、庆
大霉素、新霉素、氨苄青霉素、头孢霉素、链霉素都
不敏感 ,在它们浓度高达 500μg /mL的条件下 ,
培养两周后小球藻依然生长良好 ,没有任何死亡
现象 ;小球藻对潮霉素、 G418有一定的敏感性 ,在
它们浓度为 500μg /m L的条件下 ,经过两周的培
养 ,小球藻的生长受到一定抑制 ,一些细胞死亡 ;
小球藻对氯霉素和 Zeocin非常敏感 ,在它们浓度
为 100μg /mL时 ,小球藻的生长就受到强烈抑
制 ,大量细胞死亡 . 同时在实验中观察到本藻种
对氯霉素的溶剂 —— 乙醇也有一定的敏感性 .
如表 3所示 ,加入各剂量的氯霉素处理时 ,设置加
入相同体积乙醇的空白对照组 . 结果表明乙醇在
最低剂量时即对小球藻有一定的抑制作用 ,如选
用氯霉素做小球藻的筛选抗生素需考虑这个影响
因素 .
510 大 连 理 工 大 学 学 报 第 47卷　
表 3　海水培养基中小球藻对 10种抗生素的基础抗性
Tab. 3　 Sensitivity of Chlorella sp. to 10 antibio tics in seawa ter medium
d/ (μg mL- 1 )
抗生素
　卡那霉素　　
庆大
霉素　　新霉素　
氨苄青
霉素 　 链霉素　
头孢
霉素 　潮霉素　　 G418　　氯霉素　 Zeocin　
乙醇
0 — — — — — — — — — — —
100 — — — — — — — + + + + + +
200 — — — — — — — + + + + + +
300 — — — — — — — + + + + + + + + +
400 — — — — — — — + + + + + + + + + +
500 — — — — — — + + + + + + + + + + +
　　注 1): + + + :完全抑制 ; + + :强烈抑制 ; + :抑制 ; - :不抑制 .
2):乙醇与同组的氯霉素加入体积相同
2. 2　海水液体培养基中小球藻对 4种抗生素的
敏感性
小球藻对潮霉素有很强的耐受性 ,仅对高剂
量的潮霉素表现出一定的敏感性 . 当潮霉素浓度
为 2 560 μg /mL 时 , 第 7 d藻细胞死亡率为
85. 2% . 而当潮霉素浓度低于 320μg /mL时 ,小
球藻的生长在第 1、 2 d受到一些抑制后 ,从第 3 d
又逐渐恢复正常 (见表 4) .
表 4　小球藻对不同剂量潮霉素的敏感性统计分析
Tab. 4　 Statistica l analysis o f sensitiv ity o f Chlorella sp. to diffe rent do se of hyg r omycin
t /d
不同剂量 (μg /m L)潮霉素中小球藻的死亡率 /%
　 0　　　 20　　　 40　　　 80　　 160　　 320　 　 640　　 1 280　 2 560L D50 / (μg mL
- 1)
LD50的 95%
可信限 /(μg mL- 1 )
1 0 6. 6 2. 9 4. 3 0. 5 0. 5 0. 5 1. 1 2. 1 3 184. 70 3 186. 02～ 3 182. 37
2 0 8. 1 5. 1 7. 0 4. 2 3. 5 5. 5 4. 2 11. 7 2 570. 40 2 572. 76～ 2 568. 04
3 0 5. 0 2. 3 4. 7 3. 0 1. 1 3. 6 8. 5 27. 7 2 454. 71 2 456. 99～ 2 452. 43
7 0 0 2. 7 0 0 0 3. 4 17. 1 85. 2 1 706. 08 1 707. 40～ 1 704. 77
　　 小球藻对 G418有一定的耐受性 , 1 280
μg /mL的 G418第 7 d可使绝大部分藻细胞死亡 .
当 G418浓度低于 40μg /mL时 ,小球藻的生长在
第 1、 2 d受到一些抑制后 ,从第 3 d开始也有一定
恢复 (见表 5) .
表 5　小球藻对不同剂量 G418的敏感性统计分析
Tab. 5　 Statistical ana ly sis o f sensitivity of Chlorella sp. to different dose of G418
t /d
不同剂量 (μg /mL) G418中小球藻的死亡率 /%
　 0　　　 10　　　 20　　　 40　　　 80　　 160　　 320　 　 640　 1 280 L D50 / (μg mL
- 1)
LD50的 95%
可信限 /(μg mL- 1 )
1 0 7. 4 7. 7 6. 4 6. 9 8. 5 9. 3 9. 8 10. 6 1 139. 75 1 141. 46～ 1 139. 04
2 0 10. 3 10. 5 10. 5 10. 1 9. 6 11. 8 14. 9 18. 1 933. 25 934. 42～ 932. 09
3 0 6. 8 6. 7 5. 3 5. 8 7. 4 9. 9 17. 9 42. 5 891. 25 892. 32～ 890. 18
7 0 0 0. 6 0. 6 5. 9 11. 8 24. 4 59. 2 96. 4 456. 04 456. 52～ 455. 56
　　小球藻对氯霉素很敏感 ,在相同的剂量下氯
霉素对小球藻的致死率明显高于 G418和潮霉素 ,
320μg /mL的氯霉素第 7 d可使藻细胞全部死亡
(见表 6) .
表 6　小球藻对不同剂量氯霉素的敏感性统计分析
Tab. 6　 Statistical analy sis o f sensitivity o f Chlorella sp. to different dose of chloramphenico l
t /d
不同剂量 (μg /mL)氯霉素中小球藻的死亡率 /%
　 0　　　 2. 5　　 5　　　 10　　　 20　　　 40　 　 80　　 160　　 320 L D50 / (μg mL
- 1)
LD50的 95%
可信限 /(μg mL- 1 )
1 0 0. 7 0 0 0 5. 4 6. 1 6. 2 7. 0 374. 98 375. 23～ 374. 72
2 0 8. 7 5. 8 8. 2 9. 2 20. 2 24. 3 27. 2 31. 7 177. 01 177. 26～ 176. 76
3 0 8. 2 6. 7 11. 4 16. 3 32. 1 42. 2 43. 8 49. 9 105. 20 105. 36～ 105. 03
7 0 6. 7 2. 0 3. 3 5. 3 30. 8 63. 6 80. 9 100 59. 55 59. 64～ 59. 49
511　第 4期　　 王逸云等: 小球藻基因工程选择标记研究
　　小球藻对 Zeocin极敏感 , Zeocin在低浓度下
即对小球藻的生长有明显的抑制作用 , 2. 5
μg /mL时第 7 d的致死率即达 44. 7% , 320
μg /mL的 Zeocin第 7 d可使藻细胞全部死亡 (见
表 7) .
表 7　小球藻对不同剂量 Zeocin的敏感性统计分析
Tab. 7　 Statistica l analysis o f sensitiv ity o f Chlorella sp. to differ ent do se of Zeocin
t /d
不同剂量 (μg /ml) Zeocin中小球藻的死亡率 /%
　 0　　　 2. 5　　 5　　　 10　　　 20　　　 40　 　 80　　 160　　 320 L D50 / (μg mL
- 1)
LD50的 95%
可信限 /(μg mL- 1 )
1 0 0 0 0 0 0 0 0. 2 2. 1 445. 25 445. 75～ 445. 56
2 0 5. 1 0 5. 0 0. 2 0 0. 7 16. 5 27. 1 316. 24 316. 52～ 315. 95
3 0 12. 1 8. 2 14. 6 12. 2 12. 1 15. 8 29. 5 46. 9 158. 49 158. 72～ 158. 26
7 0 44. 7 40. 8 47. 7 49. 4 54. 1 62. 6 75. 3 100 16. 86 16. 90～ 16. 84
2. 3　淡化液体培养中小球藻对 4种抗生素的敏
感性
已知抗生素在一定的离子浓度下才有效 ,在
筛选海洋生物基因工程的选择标记时 ,就需考虑
盐度的影响 . 曹军平、李杰等报道淡化培养基中
藻对抗生素的敏感性大为增加 [14、 15] . 为了兼顾选
择剂的效果和小球藻的生长 ,设计了一系列的梯
度淡化实验 . 结果表明在稀释 10倍的培养基中 ,
小球藻的生长未受到影响 ,且对抗生素的敏感性
大为提高 . 而低稀释倍数时 ,抗生素的作用浓度
仍较大 ,完全淡化处理则对小球藻的生长有一定
影响 . 因此又在稀释 10倍的培养基中测定小球
藻对这 4种抗生素的敏感性 .
在淡化培养基中 ,小球藻对潮霉素的敏感性
大为提高 ,其浓度为 5μg /mL时 ,便对小球藻的
生长产生一定的抑制作用 , 当其浓度为 640
μg /mL时 ,第 7 d藻细胞全部死亡 (见表 8) .
淡化培养也使小球藻对 G418更为敏感 , 2. 5
μg /mL的 G418就对小球藻有明显抑制作用 , 160
μg /mL的 G418第 7 d使藻细胞全部死亡 . 但其作
用时间略为延缓 ,第 1、 2 d几乎不影响藻的生长
(见表 9) .
表 8　淡化液体培养基中小球藻对不同剂量潮霉素的敏感性统计分析
Tab. 8　 Statistica l analysis o f sensitiv ity o f Chlorella sp. to hyg romycin in decr easing NaCl concent ration medium
t /d
不同剂量 (μg /m L)潮霉素中小球藻的死亡率 /%
　 0　　　 5　　　 10　　　 20　　　 40　 　 80　　 160　　 320　　 640 L D50 / (μg mL
- 1)
LD50的 95%
可信限 /(μg mL- 1 )
1 0 0 1. 2 0 1. 8 1. 2 0 0 0 879. 02 879. 26～ 878. 78
2 0 7. 2 12. 3 11. 6 17. 8 18. 1 14. 5 15. 6 23. 3 393. 55 394. 09～ 393. 01
3 0 15. 3 25. 9 15. 9 33. 2 34. 9 31. 8 34. 9 40. 9 179. 89 180. 20～ 179. 58
7 0 12. 2 31. 6 52. 9 75. 8 82. 6 85. 2 92. 9 100 22. 48 22. 52～ 22. 46
表 9　淡化液体培养基中小球藻对不同剂量 G418的敏感性统计分析
Tab. 9　 Statistical analy sis o f sensitivity o f Chlorella sp. to G418 in decr ea sing NaCl concentr ation medium
t /d
不同剂量 (μg /m L) G418中小球藻的死亡率 /%
　 0　　　 2. 5　　 5　　　 10　　　 20　　　 40　 　 80　　 160　　 320 L D50 / (μg mL
- 1)
LD50的 95%
可信限 /(μg mL- 1 )
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 452. 90 452. 90～ 452. 90
2 0 0 0 0 0 0 0 10. 1 24. 3 356. 40 356. 70～ 356. 20
3 0 16. 2 16. 7 6. 4 8. 7 12. 2 22. 8 38. 2 47. 6 140. 28 140. 49～ 140. 07
7 0 85. 6 87. 2 91. 6 92. 6 95. 1 98. 8 100 100 2. 48 2. 48～ 2. 48
　　淡化培养时小球藻对氯霉素也更为敏感 ,氯
霉素浓度为 1. 25μg /mL时 ,便对小球藻的生长
产生明显的抑制作用 ,当其浓度为 80μg /mL时 ,
第 7 d藻细胞全部死亡 (见表 10) .
512 大 连 理 工 大 学 学 报 第 47卷　
表 10　 淡化液体培养基中小球藻对不同剂量氯霉素的敏感性统计分析
Tab. 10　 Sta tistical ana ly sis of sensitivity of Chlorella sp. to ch lo ramphenicol in decr easing NaCl concent ration medium
t /d
不同剂量 (μg /m L)氯霉素中小球藻的死亡率 /%
　 0　 　 1. 25　　 2. 5　 　 5　 　 10　　　 20　　　 40　 　 80　　 160 L D50 / (μg mL
- 1)
LD50的 95%
可信限 /(μg mL- 1 )
1 0 8. 8 8. 2 8. 2 6. 5 9. 4 11. 8 15. 3 14. 7 127. 34 127. 50～ 127. 20
2 0 19. 9 21. 4 22. 8 27. 5 34. 8 44. 6 56. 9 53. 3 32. 23 32. 27～ 32. 15
3 0 29. 2 26. 7 29. 5 39. 5 42. 9 58. 8 70. 7 68. 8 17. 91 17. 94～ 17. 87
7 0 24. 6 15. 3 22. 3 42. 5 51. 0 88. 5 100 100 10. 42 10. 44～ 10. 41
　　淡化培养时小球藻对 Zeocin仍然极敏感 ,
Zeocin浓度为 40μg /mL时 ,第 7 d藻细胞全部死
亡 . 但同 G418相似 ,其作用时间略为延缓 ,第 1、 2
d几乎不影响藻的生长 (见表 11) .
由表 8～ 11可见 ,在淡化 10倍的液体培养基
中 ,小球藻对 4种抗生素的敏感性大为提高 . 相
同的培养时间内 ,当小球藻的起始浓度相同时 ,淡
化培养基中抗生素对小球藻的半致死剂量远远低
于海水培养基中的值 .
例如: 潮霉素 168 h的 LD50从 1 708. 00
μg /mL降为 22. 48μg /mL, Zeocin 168 h的 LD50
也从 16. 80μg /mL降为 1. 16μg / mL. 因此在以
抗生素做选择剂 ,大规模培养转基因小球藻时 ,可
以考虑采用淡化培养基 .
表 11　淡化液体培养基中小球藻对不同剂量 Zeocin的敏感性统计分析
Tab. 11　 Statistical analysis o f sensitivity o f Chlorella sp. to Zeocin in decreasing NaCl concentra tion medium
t /d
不同剂量 (μg /m L) Zeocin中小球藻的死亡率 /%
　 0　 　 1. 25　　 2. 5　 　 5　 　 10　　　 20　　　 40　 　 80　　 160 L D50 / (μg mL
- 1)
LD50的 95%
可信限 /(μg mL- 1 )
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 226. 46 226. 46～ 226. 46
2 0 0 0 0 0 0 0 14. 0 23. 0 190. 98 191. 10～ 190. 87
3 0 10. 5 13. 6 10. 8 3. 0 15. 7 27. 5 37. 3 55. 9 67. 64 67. 71～ 67. 51
7 0 88. 3 92. 8 89. 1 92. 3 97. 9 100 100 100 1. 16 1. 17～ 1. 16
3　讨　论
小球藻对氯霉素、 G418、潮霉素、 Zeocin较敏
感 ,与其他真核藻类的报道较为一致 . 其中 ,氯霉
素是藻类普遍敏感的抗生素 ,其干扰细胞内核糖
体的蛋白质合成 ,抑制细胞生长并最终导致死
亡 [11～ 16 ] . 而 cat基因编码的氯霉素乙酰转移酶可
使氯霉素乙酰化而失活 . 小球藻对氯霉素很敏
感 ,但氯霉素的溶剂 —— 乙醇 ,对小球藻也有很
强的毒害作用 ,选择氯霉素做小球藻转基因的选
择抗生素时需考虑此问题 . 新霉素磷酸转移酶基
因 (npt II)和潮霉素磷酸转移酶基因 (hpt )是在
植物基因转化中广泛应用的选择标记 . npt II编
码的产物通过酶促磷酸化使氨基葡糖苷类抗生素
失活 ,从而解除毒性 . hpt基因编码潮霉素磷酸转
移酶使潮霉素分子结构上的某个羟基发生磷酸化
而使其失活 ,本实验表明 ,小球藻对潮霉素的敏感
性较低 ,但是在淡化培养基中其敏感性大增 ,有可
能成为小球藻转化的选择试剂 . 小球藻对 G418
较敏感 ,这与陈颖等的结果较吻合 [5 ] ,但作用剂量
不同 ,可能是使用的藻种和培养基有差异所致 .
这是在进行藻类转基因工作时必须注意的问题 .
Zeocin通过诱导对细胞内 DNA的损伤以非特异
性的方式起作用 , ble基因编码对 Zeocin有很强
亲和力的蛋白 ,该蛋白可结合 Zeocin使之不能切
离 DNA. 在本实验中小球藻对 Zeocin极为敏感 ,
有可能成为其转化的高效选择试剂 . 其他 6种抗
生素小球藻对其不敏感 ,可用做小球藻除菌的工
具 .
4　结　语
本实验测定了小球藻对 10种常见抗生素的
敏感性 ,找到了 4种有效的选择试剂 ,测定了小球
藻对这 4种抗生素在海水液体培养基和淡化液体
培养基中的半致死剂量 ,为确定小球藻基因工程
中适用的阳性选择标记基因提供了实验依据 . 利
用这些选择标记构建表达载体转化小球藻 ,经过
筛选得到表达目的基因的藻体 ,可能在小球藻基
因工程等方面发挥重要作用 ,相关工作正在进行
中 .
513　第 4期　　 王逸云等: 小球藻基因工程选择标记研究
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Study of selectable markers in genetic engineering of Chlorella sp.
WANG　Yi -yun* ,　WANG　Chang -hai
( Dept . of Biosci . and Biotechnol . , Dal ian Univ . of Technol . , Dalian 116024, China )
Abstract: The sensi tivi ties of Chlorella sp. to 10 antibiotics: gentamicin, neomycin, ampici llin,
kanamycin, cephalo thin, st reptomycin, G418, hyg romycin Zeocin and chloramphenico l w ere
investigated. The resul ts show tha t Chlorel la sp. is no t sensi tiv e to g entamicin, neomycin,
ampicillin, kanamycin, cephalo thin and st reptomycin, and they canno t inhibi t the g row th of Chlorel la
sp. in the concentration of this test. How ever, i t i s rela tiv ely sensi tive to G418 and hyg romycin, and
very sensi tiv e to Zeocin and chlo ramphenico l. LD50 and 95% confidence ranges o f these four reagents
in bo th seaw ater culture and decreasing NaCl concentration medium were calculated respectiv ely. The
resul ts prov ide impo rtant data in developing selectable ma rkers in genetic engineering of Chlorella sp.
Key words: Chlorella sp. ; antibio tics; LD5 0; selectable marker
514 大 连 理 工 大 学 学 报 第 47卷