全 文 ：625 Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences  http://www.jcps.ac.cn 
Rapid screening of anti­HIV ingredients in Artemisia rupestris L. extracts 
interacting with V3 loop region of HIV­1 gp120 and reverse transcriptase 
by affinity capillary electrophoresis and capillary zone electrophoresis 
Yiran Zhao 1 , Zhongjie Li 1 , Yong Jiang 2 , Xiaodan Zhang 1 , Xiaomei Ling 1* 
1. Department of Chemical Biology, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University Health Science Center, Beijing 100191, 
China 
2. Department of Natural Medicines, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University Health Science Center, Beijing 100191, China 
Abstract: HIV­1 gains entry into target cells by sequentially interacting with cellular receptors and co­receptors. Both the receptor 
and co­receptor are recognized by HIV­1 envelope protein gp120, which plays a key role in the entry process of HIV­1 into cells. The 
development of new inhibitors is essential since the viral enzyme reverse transcriptase (RT) is one of the first targets of antiretroviral 
therapy. It has been reported that a variety of natural plants, such as Artemisia rupestris L., have anti­viral pharmacological activity, 
and they might be the potential inhibitors of RT or V3 loop of gp120 against HIV­1. RIQRGPGRAFVTIGK (R15K), the relatively 
conserved region of V3 loop, can be used for binding research. In this work, we analyzed the interactions between different extracts 
from Artemisia rupestris L. and R15K by affinity capillary electrophoresis (ACE). Moreover, we analyzed the interactions between 
different extracts from Artemisia rupestris L. and RT by capillary zone electrophoresis (CZE). Our data showed that the chloroform 
extract of Artemisia rupestris L. was active among the different plant extracts, which was consistent with previous studies. Taken 
together, our study provided a rapid screening method to seek anti­HIV ingredients in natural plants’ extracts. 
Keywords: HIV, V3 loop, RIQRGPGRAFVTIGK, Reverse transcriptase, Affinity capillary electrophoresis, Capillary zone electrophoresis 
CLC number: R917  Document code: A  Article ID: 1003–1057(2015)9–625–05 
Received: 2015­05­18, Revised: 2015­06­20, Accepted: 2015­06­24. 
Foundation  items: National Natural Science Foundation  (Grant No. 
81373372) and Specialized Research Fund for the Doctoral Program 
of  Higher  Education  of  China  (Grant  No.  20110001110021  and 
20130001110059). 
* Corresponding author. Tel.: 86­10­82801590, 
E­mail: lingxm@bjmu.edu.cn 
http://dx.doi.org/10.5246/jcps.2015.09.079 
1. Introduction 
The entry of HIV into target cells is a sophisticated, 
multi­step process mediated by the viral envelope proteins 
gp120 and gp41, including sequential attachment, specific 
bindings  and  membrane  fusion [1,2] .  Apart  from  the 
well­defined  receptors  and  coreceptors,  a  variety  of 
glycosphingolipids  (GSL),  including  galactosyl  ceramide 
(GalCer) and a monoganglioside GM3, can also regulate 
Env­mediated  fusion, interaction with gp120 through 
a  specific  portion  of  the V3  loop  region [3,4] .  The V3 
loop serves an important role during  the entry process. 
It  extends  and  projects  away  from  the  virion  spike 
upon  CD4  binding.  Sequentially,  the  orientation  of 
gp120  is  altered, and  the  bridging  sheet and V3  loop 
are positioned towards  the host membrane where they 
can  interact with  coreceptors. V3  loop  also  takes  part 
in  the  binding  of  gp120  to  CCR5  and  CXCR4,  two 
most commonly used corecptors for HIV entry in vivo. 
As  a  synthetic  V3  loop  peptide  corresponding  to  the 
glycolipid binding domain of the V3 loop of HIV­1 gp120, 
RIQRGPGRAFVTIGK  can  be  used  to  investigate 
the  binding  studies  instead  of  the  recombinant  gp120 
molecules [5,6] .  Although  a  complex  process,  including 
multiple sequential interactions between gp120 and gp41 
and host  surface  proteins,  a  large number  of  potential 
targets to impede the entry process, now the HIV entry 
can be discovered. 
Successful  entry  of  the  contents  of  the  viral  core  is 
followed by the reverse transcription of the viral RNA 
template into its complementary DNA. This process is 
performed by the enzyme reverse transcriptase (RT) of 
the virus. RT degrades the RNA template to subsequently 
produce  the  double­stranded  viral  DNA [1] .  To  date,
626  Zhao, Y.R. et al. / J. Chin. Pharm. Sci. 2015, 24 (9), 625–629 
the three major groups of drugs in the clinical practice 
are the RT inhibitors (nucleoside/nucleotide, NRTI, and 
non­nucleoside,  NNRTI)  and  protease  inhibitors  (PI). 
Therefore, one of the most important strategies against 
HIV­1 is to find out new inhibitors targeting RT. 
The  current  therapeutic  strategy,  highly  active  anti­ 
retroviral therapy (HAART) involves the use of agents 
from at least two distinct classes of antiretroviral drugs [8] . 
As  the  combination  of  HAART  regiments  is  unable  to 
eradicate HIV infection, lifelong therapy is required to 
avoid disease progression [9,10] . These  factors necessitate 
the continual development of new inhibitors that can be 
used against resistant viruses. It has been reported that 
a variety of natural plants, such as Artemisia rupestris L., 
have  anti­viral  activity [11–13] .  To  screen  the  potential 
HIV­1  entry  inhibitors  in natural  plants,  we  investi­ 
gated the interactions between R15K and the extracts 
of  Artemisia  rupestris  L.  as well  as  the  interactions 
between RT  and  the  extracts  of Artemisia  rupestris  L., 
respectively. 
The  interactions  between  small  ligands  and  bio­ 
molecules have been studied by varieties of methods. 
Among these approaches, capillary electrophoresis (CE) 
achieves remarkable advantages, including low sample 
consumption,  relatively  short  analysis  time  and  high 
efficiency [14,15] .  In  our  present  study,  we  investigated 
the  interactions  between  R15K  and  different  extracts 
from  Artemisia  rupestris  L.  by ACE  and  assessed  the 
interactions  between  RT  and  different  extracts  from 
Artemisia rupestris L. by CZE. 
2. Experimental 
2.1. CE instrumentation 
The  experiments  were  performed  on  a  Beckman 
P/ACE TM  MDQ system  (Beckman Coulter,  Fullerton, 
CA, USA) equipped with a photodiode array detector as 
well  as  the  32  Karat TM  software  version  5.0  (Fullerton, 
CA, Beckman). The bare fused silica capillaries (365 μm, 
75 μm) were purchased from Yongnian Optical Fibers 
(Hebei, China).  The  total  and  effective  lengths  of  the 
capillary  were  30.2  cm  and  20  cm,  respectively.  The 
detector wavelength was set at 214 nm. 
2.2. Reagents 
All chemicals were of analytical grade unless otherwise 
indicated. Tris base (ultrapure), acetic acid and dimethyl 
sulfoxide (DMSO) were purchased from Beijing Chemical 
Reagent Factory (Beijing, China). The deionized water 
was  prepared  using  a  Millipore  Milli  Q­Plus  system 
(Millipore,  Bedford,  MA,  USA).  Tris­HAc  (30 mM), 
served  as  running  buffer,  was  prepared  by  dissolving 
0.9108 g Tris in 250 mL of deionized water, and its pH 
was adjusted to 7.45 at 25 °C using diluted acetic acid. All 
CE solutions were  filtered  through 0.45­μm membranes 
(Agilent, Waldbronn, Germany) before use. 
The peptide, corresponding to the R15K, was obtained 
from Chinese Peptide in Hangzhou (China), which was 
subsequently  purified  (purity≥95.8%)  and  characterized 
by  RP­HPLC  and  MS.  The  synthesized  amino  acid 
sequence of R15K was Arg­Ile­Gln­Arg­Gly­Pro­Gly­ 
Arg­Ala­Phe­Val­Thr­Ile­Gly­Lys.  RT was  supplied  by 
Ambion  Inc  (TX,  USA).  The  different  extracts  of 
Artemisia  rupestris  L.  were  provided  by Dr.  Yong  Jiang 
(Department of Pharmacognosy, School of Pharmaceutical 
Sciences,  Peking  University).  The  extracts  of  Artemisia 
rupestris L. were petroleum ether extracts, ethyl acetate 
extracts and chloroform extracts. 
2.3. Sample preparation 
The stock solution of R15K, prepared by dissolving 
the R15K in 30 mM Tris­HAc to the concentration of 
2 mM, was diluted to desired concentrations by adding 
appropriate amounts of  buffer. The methanol was evapo­ 
rated  under  nitrogen  stream  before  it  was  redissolved. 
DMSO was diluted to 1‰ (v/v) and then added different 
extracts of Artemisia rupestris L. 
The  petroleum  ether  extracts,  ethyl  acetate  extracts 
and chloroform extracts of Artemisia rupestris L. were 
dissolved in methanol as stock solutions. The methanol 
was  evaporated  under  nitrogen  steam  before  it  was 
redissolved.  The  saturation  solutions  of  the  different 
extracts were used in the present study. 
To investigate the interactions between RT and different 
extracts  of Artemisia  rupestris  L.,  the  extracts  and  RT 
were mixed (1:1, v:v) and incubated at 37 °C for 30 min 
before CE analysis.
627 Zhao, Y.R. et al. / J. Chin. Pharm. Sci. 2015, 24 (9), 625–629 
2.4. ACE conditions 
Before each measurement, the capillary was sequen­ 
tially  rinsed with  0.1 M  sodium hydroxide,  deionized 
water  and  running  buffer.  Samples  containing a  fixed 
concentration  of  corresponding  compounds  (different 
extracts  of  Artemisia  rupestris  L.)  were  injected  into 
the running buffer with increasing concentration of R15K. 
The  electrophoretic  mobility  of  each  extract  was 
determined.  The  applied  voltage  was  set  at  +15  kV 
after  optimization. The  samples were  injected  using 
the pressure injection mode at 0.5 p.s.i.  for 5 s. The 
interactions were monitored by DAD at a wavelength of 
214 nm. Different  volumes  of  the R15K  stock  solution 
were  then  added  into  Tris­HAc  as  the  ACE  running 
buffer.  In  addition,  1‰ DMSO  (v/v)  in  samples was 
used as an internal standard. 
2.5. CZE conditions 
To  study  the  interactions  between RT  and  different 
extracts of Artemisia rupestris L., the temperature of the 
cartridge  was  set  at  25  °C.  Before  each measurement, 
the capillary was sequentially rinsed with running buffer 
(30 mM Tris­HAc,  pH  7.45).  Samples  containing  the 
mixtures  of  RT  and  different  extracts  of  Artemisia 
rupestris L. were  injected using the pressure injection 
mode at 0.5 p.s.i.  for 5 s. The applied voltage was set 
at  +15  kV.  The  capillary  was  washed  between  runs 
using the running buffer. 
3. Results and discussion 
3.1. Optimization of ACE 
In  the  present  study,  pH  7.45  was  selected  as  the 
buffer  pH  value  in  order  to  analyze  the  interaction 
under  the  physiological  conditions.  The  baseline  and 
peak shape were good when 30 mM Tris­HAc was used 
as the running buffer. Voltage of +15 kV and capillary 
length of 30 cm (effective length of 20 cm) were selected 
to shorten  the  separation  time.  In  this  investigation, 
the stability of protein was investigated. R15K solutions 
(1 mM) were  analyzed  after  different  incubation  time 
(0, 0.5, 1, 2, 4 and 8 h) at room temperature. The RSD 
value of the height and the retention time of the protein 
peak were 1.7 and 0.3, respectively. The result indicated 
that R15K was  stable within  8 h  at  room  temperature 
and could be used for the interaction study. 
3.2. Interactions between Artemisia rupestrisL. extracts 
and R15K 
Figure 1 shows the electropherograms of the interactions 
between  extracts  from Artemisia  rupestris L.  and  R15K. 
DMSO  was  used  as  the  non­interacting  marker  in 
the  running  buffer. When 3­sialyllactose was  used  as 
positive  control and D­galactose was  used  as negative 
control, R15K  remarkably  changed  the mobility  of 
3­sialyllactose, and the peak of D­galactose could not 
be separated from the peak of DMSO with the increase 
of R15K concentration  in  the running buffer [7] . In our 
present  study,  the  complexation  of  compounds  with 
R15K resulted in a decrease of the charge to mass ratio, 
which  lowers  the  mobility  and  extends  the  retention 
time. The mobility of Artemisia rupestris L. shifts turned 
to  a  gradually  decreased  trend  as  the  concentrations  of 
R15K  were  increased.  The  results  suggested  that  the 
chloroform extract of Artemisia rupestris L. could interact 
with R15K. Above all, the binding of chloroform extract 
of Artemisia rupestris L./R15K should be stronger than 
that of 3­sialyllactose/R15K due to the less amount of 
R15K that could get positive result. 
3.3.  Interactions  between  Artemisia  rupestris  L. 
extracts and RT 
Figure 2 shows the electropherograms of the interactions 
between  extracts  from Artemisia  rupestris L. and RT. 
Curve 1 represents each extract only, whereas curve 2 
represents the mixture of RT and different extracts at a 
ratio of 1:1 (v:v). The peak of RT could not be separated 
from  the  peaks  of  the  extracts.  As  a  result,  the  peak 
height  of  the mixture  of  petroleum  ether  extracts  and 
RT was  increased accordingly. The peak shape of  the 
mixture  of  ethyl  acetate  extracts  and RT  extended  for 
the same reason. Apparently, these two types of extracts 
had  no  interactions  with  RT.  The  peak  height  of  the 
mixture of chloroform extracts and RT was decreased. 
This  finding  indicated  that  the  chloroform  extracts  of 
Artemisia rupestris L. could interact with RT, leading 
to the decrease of the peak height.
628  Zhao, Y.R. et al. / J. Chin. Pharm. Sci. 2015, 24 (9), 625–629 
4. Conclusions 
In  the  present  study,  we  analyzed  the  interactions 
between  different  extracts  from  Artemisia  rupestris  L. 
and R15K by ACE. Moreover, the interactions between 
different  extracts  from Artemisia  rupestris  L.  and  RT 
were  analyzed  by  CZE.  The  results  suggested  that 
the  chloroform  extract  of  Artemisia  rupestris  L.  could 
interact  with  R15K  and RT,  suggesting  the  existence 
of potential antagonists of R15K and inhibitors of RT. 
Furthermore, the results showed that the active ingredients 
in the chloroform extract of Artemisia rupestris L. might 
exhibit anti­HIV activity by binding to the V3 loop of 
gp120  and  by  targeting  RT.  Taken  together,  in  the 
present  study, an efficient, rapid and sensitive method 
was developed to identify natural plants’ bioactive extracts 
that can interact with specific drug targets, such as R15K 
or RT, under physiological conditions. 
Acknowledgements 
This work was financially supported by the National 
Natural Science Foundation (Grant No. 81373372) and 
Specialized Research Fund  for the Doctoral Program of 
Higher Education  of  China  (Grant No.  20110001110021 
and 20130001110059). 
References 
[1] Teixeira, C.; Gomes, J.R.B.; Gomes, P.; Maurel, F. Eur. 
J. Med. Chem. 2011, 46, 979–992. 
[2] Lian, W.; Wu, M.Y.;  Huang,  N.;  Gao,  N.;  Xiao,  C.; 
Li, Z.; Zhang, Z.G.; Zheng, Y.T.; Peng, W.L.; Zhao, J.H. 
Biochim. Biophys. Acta. 2013, 1830, 4681–4691. 
[3] Haqqani, A.A.;  Tilton,  J.C.  Antiviral.  Res.  2013,  92, 
158–170. 
[4] Tilton, J.C.; Doms, R.W. Antiviral. Res. 2010, 85, 91–100. 
Figure 1. Electropherograms of (a) petroleum ether extracts, (b) ethyl acetate extracts, (c) chloroform extracts under different concentrations of 
R15K in the running buffer. Capillary: capillary of 30.2 cm (effective length: 20 cm), 75 µm. Running buffer: 30 mmol/L; Tris­HAc, pH 7.45. 
Monitored by absorption at a wavelength of 214 nm. 
Figure 2. Electropherograms of interactions of (a) petroleum ether extracts, (b) ethyl acetate extracts, (c) chloroform extracts and RT. The ratio 
was 1:1 (v:v). Capillary: capillary of 30.2 cm (effective length 20 cm), 75 µm. Running buffer: 30 mmol/L; Tris­acetic acid, pH 7.45. Monitored 
by absorption at a wavelength of 214 nm. 
(a) 
5 mAU 
[R15K] (µM) 
0 
1 
0  2  4 
t (min) 
(b) 
5 mAU 
[R15K] (µM) 
0 
1 
0               2               4               6 
t (min) 
(c) 
5 mAU 
[R15K] (µM) 
0 
0  2                  4  6 
t (min) 
0.05 
0.1 
0.5 
1 
(a) 
2 mAU 
1 
2 
0                2                4 
t (min) 
(b) 
2 mAU 
1 
2 
0  2  4  6 
t (min) 
(c) 
2 mAU 
1 
2 
0  2  4                6 
t (min)
629 Zhao, Y.R. et al. / J. Chin. Pharm. Sci. 2015, 24 (9), 625–629 
[5]  Garg,  H.;  Francella,  N.;  Tony,  K.A.;  Augustine,  L.A.; 
Barch,   Jr,  J.J.;  Fantini,  J.;  Puri,  A.;  Mootoo,   D.R.; 
Blumenthal, R. Antiviral. Res. 2008, 80, 54–61. 
[6] Yahi, N.; Sabatier, J.M.; Baghdiguian, S.; Gonzalez­Scarano, 
F.; Fantini, J. J. Virol. 1995, 69, 320–325. 
[7] Li, Z.J.; Zhao, Y.R.; Lin, W.W.; Ye, M.; Ling, X.M. J. 
Pharm. Biomed. Anal. 2015, 111, 28–35. 
[8]  Yeni,  P.G.;  Hammer,  S.M.;  Hirsch,  M.S.;  Saag, M.S.; 
Schechter, M.; Carpenter, C.C.; Fischl, M.A.; Gatell, J.M.; 
Gazzard,   B.G.;   Jacobsen,   D.M.;  Katzenstein,   D.A.; 
Montaner, J.S.; Richman, D.D.; Schooley, R.T.; Thompson, 
M.A.;  Vella,  S.;  Volberding,  P.A.  J.  Am. Med.  Assoc. 
2004, 292, 251–265. 
[9]  Chun,  T.W.;  Davey  Jr.R.T.;  Engel,  D.;  Lane,  H.C.; 
Fauci, A.S. Nature. 1999, 401, 874–875. 
[10] Finzi, D.; Hermankova, M.; Pierson, T.; Carruth, L.M.; 
Buck, C.;  Chaisson, R.E.; Quinn,  T.C.;  Chadwick, K.; 
Margolick, J.; Brookmeyer, R.; Gallant,  J.; Markowitz, 
M.; Ho, D.D.;  Richman, D.D.; Siliciano, R.F.  Science. 
1997, 278, 1295–1300. 
[11] Xiao, W.; Sirafil, A.B.; Li, Z.J. Lishizhen Med. Mater. 
Med. Res. 2008, 19, 2836–2838. 
[12] Wang, C.; Li, J.; Tu, P.F. J. Chin. Pharm. Sci. 2014, 23, 
778–782. 
[13] Xin, W.Y.;  Song,  J.K.;  He,  G.R.;  Du,  G.H.  Chin.  J. 
New Drug. 2013, 22, 647–659. 
[14] Sun, L.; Li, Y.; Champion, M.M.; Zhu, G.; Wojick, R.; 
Dovichi, N.J. Analyst. 2013, 138, 3181–3188 
[15] Kanoatov, M.; Cherney, L.T.; Krylov, S.N. Anal. Chem. 
2014, 86, 1298–1305. 
[16]  Li, M.N.;  Lei,  L.;  Jia,  L.H.;  Ling, X.M.;  Zhang,  J.M.; 
Zhao, Y.R.; Wang, K.W.Anal. Biochem. 2014, 449, 99–105. 
利用亲和毛细管电泳和毛细管区带电泳快速筛选新疆一支蒿提取物中
与HIV­1包膜蛋白gp120上V3环以及逆转录酶相互作用的活性成分
赵怡然 1 , 李中杰 1 , 姜勇 2 , 张晓丹 1 , 凌笑梅 1* 
1. 北京大学医学部 药学院 化学生物学系, 北京 100191 
2. 北京大学医学部 药学院 天然药物学系, 北京 100191 
摘要:  HIV­1侵入宿主细胞的过程中与一系列受体和协同受体结合。这些受体和协同受体都由HIV­1的包膜蛋白 
gp120识别, 在病毒入侵过程中是重要环节之一。逆转录酶拮抗剂是最早针对抗病毒治疗的几个靶点之一, 对其的改进对
于寻找新型拮抗剂十分关键。许多天然植物如新疆一支蒿被报道具有抗病毒的生物活性。这些天然植物也许就是潜在
的靶向针对包膜蛋白gp120上V3环或者逆转录酶的艾滋病毒抑制剂。V3环结构中的相对保守的肽段R15K可以被用来研
究蛋白的相互作用。本研究利用毛细管亲和色谱方法研究了R15K与新疆一支蒿各种粗提物之间的相互作用。利用毛细
管区带电泳法研究了逆转录酶与新疆一支蒿各种粗提物之间的相互作用。实验结果表明, 新疆一支蒿的氯仿层提取物与 
R15k和逆转录酶之间均存在较明显的相互作用。本研究提供了一种可以快速高通量筛选天然植物中抗艾滋病毒的活性
成分的方法。
关键词: HIV; V3环; R15K;逆转录酶;亲和毛细管电泳;毛细管区带电泳