全 文 ：第 27 卷第 2 期 大 连 海 洋 大 学 学 报 Vol． 27 No． 2
2 0 1 2 年 4 月 JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Apr ． 2 0 1 2
文章编号:2095 － 1388(2012)02 － 0162 － 04
用壳聚糖絮凝法采收小球藻及上清液再利用的研究
张鹏，李兴锐，张永奎
(四川大学 化工学院制药与生物工程系，四川 成都 610065)
摘要:针对工业化培养小球藻 Chlorella vulgaris时存在的采收困难以及后续上清液的循环利用问题，设计
了培养小球藻的新型循环模式，具体操作步骤为:用气升式反应器培养小球藻→加入壳聚糖絮凝→过滤藻
体得上清液→在上清液中补加营养成分→加入气升式反应器中再用于培养小球藻。结果表明:在 5 次小球
藻循环培养中，后 4 次循环培养藻体的生长速率和收获期浓度均比第 1 次培养的稍高;用壳聚糖作为絮凝
剂时其絮凝效果较好，且未产生絮凝抑制性;每次循环时在上清液中定量补加营养成分，NO －3 － N、PO
3 －
4
－ P含量变化均在无抑制积累的范围内。说明利用壳聚糖作为絮凝剂采收小球藻的效果及利用上清液循环
培养小球藻的效果都比较理想。
关键词:小球藻;壳聚糖;絮凝;上清液再利用
中图分类号:S968. 41 文献标志码:A
在生物能源和活性物质的开发中，微藻具有巨
大的优势［1 － 3］。但在微藻的工业化开发中还存在许
多瓶颈问题，如优良藻种的选育、培养模式的经济
化、藻体采集及后续可用物质的分离和纯化
等［4 － 5］。在工业化培养的藻种中，因小球藻富含蛋
白质和油脂等成分，其工业化前景更加诱人。但由
于小球藻在生长过程中悬浮于水面，采收过程中存
在一些困难，因而使运行成本增加，影响了其工业
化应用。
目前，采收小球藻的常用方法有絮凝法、过滤
法、离心法和气浮法等，絮凝法具有操作简单、成
本低廉的优点，可常与其它方法配合使用［1，4 － 5］。
在絮凝法中，选择絮凝剂是关键。壳聚糖是一种常
用的絮凝剂，具有絮凝效果好、絮凝物体积大、絮
凝速率快和无二次污染等优点，因而广泛用于微藻
的絮凝中［6 － 11］。在小球藻的絮凝采收中，国内外
学者的研究大多集中于絮凝剂的选择上［6 － 8，12 － 13］。
研究表明，壳聚糖对小球藻的絮凝效果较好［6，8，10］，
但关于絮凝后上清液的循环利用性能的研究较
少［8，14 － 16］。在微藻工业化生产中，培养液的体积
巨大，采集藻体后遗留的上清液若可循环利用，既
可以节省培养成本，又可以简化上清液的后续处理
操作，因而具有一定的经济意义。本研究中，作者
在自制的气升式反应器中培养小球藻，研究了用壳
聚糖作为絮凝剂采收小球藻后上清液的循环利用性
能，同时研究了壳聚糖对采用多次循环上清液培养
的小球藻的絮凝性能，旨在为工业化培养藻类的采
收及其上清液的循环利用提供参考资料。
1 材料与方法
1. 1 材料
试验用小球藻 Chlorella vulgaris (藻种编号为
FACHB—1072)购自中国科学院武汉水生研究所。
壳聚糖购自上海伯奥生物科技有限公司，脱乙酰度
≥90. 0%，黏度为 0. 1 Pa·s。
试验仪器包括 UV-1800PC 分光光度计，TDL-
5-A型低速台式离心机，85-2 恒温磁力搅拌器等。
SE培养基的配制:将 0. 25 g NaNO3、0. 075 g
K2HPO4·3H2O 、0. 075 g MgSO4·7H2O 、0. 025 g
CaCl2·2H2O 、0. 175 g KH2PO4和 0. 025 g NaCl 溶
于蒸馏水中，加入 A5浸出液 1 mL、土壤浸出液 40
mL和 Fe—EDTA液 1 mL，定容至 1 L。
A5 浸出液的配制:将 286 mg H3BO3、181 mg
MnCl2 · 4H2O、22 mg ZnSO4 · 7H2O、7. 9 mg
CuSO4·5H2O、3. 9 mg(NH4)6 Mo7O24·4H2O 溶于
收稿日期:2011 － 12 － 21
基金项目:闵恩泽最高科学技术奖科学研究基金资助项目
作者简介:张鹏 (1986 －) ，男，硕士研究生。E － mail:ydhysg@ 163. com
通信作者:张永奎，男，教授。E － mail:zhangyongkui@ scu. edu. cn
DOI:10.16535/j.cnki.dlhyxb.2012.02.014
蒸馏水中，并定容至 100 mL。
土壤浸出液的配制:取未施过肥的花园土 0. 5
kg置于烧杯或三角瓶中，加入蒸馏水 1 000 mL，
瓶口用透气塞封口，在水浴中沸水加热 2 h，冷却
后，在无菌条件下过滤，取上清液。将灭菌蒸馏水
加入上清液中至总体积为 1 000 mL，于 4 ℃下保存
备用。
Fe － EDTA 液的配制:将 0. 1 g Na2 EDTA 和
8. 1 mg FeCl3·6H2O 分别溶于 50 mL 蒸馏水和 50
mL的 HCl (0. 1 mol /L)中，然后混匀即可。
1. 2 方法
1. 2. 1 新型循环模式的设计 每次循环分为 4 个
步骤，具体操作方法如下:
1)在气升式反应器中培养小球藻。自制气升
式反应器体积为 3 L，装液量为 2. 5 L，通入空气
流量为 100 L /h。采用普通白炽灯光照，光照强度
为 3 000 lx，光照时间为 24 h。第 1 次循环中藻液
生长至稳定期，取出部分藻液进行后续操作，后 4
次循环中藻液在气升式反应器中的培养时间均为 3
d。每天定时测定反应器中藻液的吸光度值 ODi。
2)加入壳聚糖絮凝。取出反应器藻液体积的
60% (1. 5 L) ，测定藻液吸光度值 ODa。利用醋酸
调节藻液的 pH为 6. 00，然后在每升藻液中加入 10
mg 壳聚糖，利用机械搅拌器以 300 r /min 搅拌 3
min，搅拌后静止 10 min，测量距液面 2 cm处藻液
的吸光度值 ODb。
3)过滤分离藻体得上清液。使用慢速定量滤
纸抽滤除去沉淀的絮体，得到上清液，取出适量体
积的上清液，用于 NO －3 － N、PO
3 －
4 － P的测定。
4)在上清液中补加营养成分。向上清液中补
加 SE培养基，并用蒸馏水将上清液的体积补加至
1. 5 L (补加蒸馏水的体积低于 0. 1 L) ，不调节上
清液的 pH为 7. 00。
至此一个循环完成，然后将处理后的上清液加
入气升式反应器中，再次进行小球藻的培养，如此
循环 4 次。
1. 2. 2 分析方法 用紫外分光光度计在波长为
680 nm处测定藻液浓度，用吸光度值 OD表示小球
藻藻液的浓度。采用何腊平等［16］的方法测定藻液
中 NO －3 － N、PO
3 －
4 － P的浓度。
采用下列公式计算壳聚糖的絮凝效率 (μ) :
μ =
ODa － ODb
ODa
× 100 %。
2 结果与分析
2. 1 循环培养小球藻的生长曲线
从图 1 可见:在后 4 次循环培养中，小球藻的
生长曲线基本类似，说明小球藻的生长速率基本相
近，而且后 4 次循环收获期藻液的浓度与第 1 次藻
液的浓度非常接近 (表 1)。可见利用壳聚糖作为
絮凝剂，采用在过滤后的上清液中补加营养成分，
然后再次作为培养液，对微藻的生长无抑制作用，
说明上清液可以数次循环利用。
图 1 小球藻的生长曲线
Fig. 1 Growth curve of alga Chlorella vulgaris
表 1 5 次循环收获期藻液的吸光度值(λ =680 nm)
Tab. 1 Absorbance values in five － cycle alga solution(λ =
680 nm)
收获时间 /d
harvesting time
藻液吸光度值
absorbance values in alga solution
5
8
11
14
17
3． 408
3． 436
3． 450
3． 430
3． 440
据报道，微藻在生长过程中可以产生化感性物
质，并将此物质排放至培养液中，对其它微藻产生
抑制或刺激作用，从而影响其生长［17 － 19］。本试验
中，利用上清液作为培养液循环培养小球藻 5 次，
小球藻的生物量及生长速率均正常，对藻类的生长
无明显抑制作用或刺激作用，这可能与藻体的采集
及分离方式有关。虽然上清液中的化感性物质会在
絮凝过程中富集，但可以随絮体一同被过滤掉，因
而循环使用的上清液中化感性物质很少。在后 4 次
的循环培养中，每次循环反应器中剩余的 40%藻
361第 2 期 张鹏，等:用壳聚糖絮凝法采收小球藻及上清液再利用的研究
液可以作为下次循环培养的藻种，但藻种在长期培
养过程中可能产生老化现象［14］，影响藻种的生命
活力。如果能接种新鲜的藻种，收获期藻液的浓度
会更高，这样会延长上清液循环培养的周期。
2. 2 壳聚糖对藻体的絮凝效率
在每次加入壳聚糖之前，需先利用醋酸调节藻
液的 pH为 6. 00，然后才能加入壳聚糖进行絮凝操
作。据报道，藻液在不同的 pH 下具有不同 ξ 电位
值，同时不同 pH值对壳聚糖在藻液中的作用也有
很大影响［13］。藻液 pH 为 6. 00 左右时，藻体 ξ 电
位值接近于零，而壳聚糖可以增加其分子链的带正
电荷的氨基数量。根据絮凝电中和理论，藻液 pH
为 6. 00 左右时，壳聚糖的使用量可以降低。每次
循环收获期的藻液 pH 在 8. 00 以上，而采用此方
式得到的上清液呈酸性，在加入反应器后中可调节
藻液的 pH值接近中性，有利于藻体的生长。
5 次循环絮凝操作中，壳聚糖的使用量均相同
(10 mg /L藻液)。从图 2 可见，5 次循环中壳聚糖
的絮凝效率虽呈下降趋势，但絮凝效率均在 95%
以上。据报道，在同一个培养液中多次使用壳聚
糖，会产生絮凝抑制现象，这与藻体生长中排放的
物质有关［20 － 21］。但本试验中，壳聚糖均具有较高
的絮凝性能，可能与培养液中抑制絮凝物质的浓度
有关。
图 2 5 次循环壳聚糖的絮凝效率
Fig. 2 Efficiency of chitosan flocculation in five cycles
2. 3 循环利用的上清液中 NO －3 － N和 PO
3 －
4 － P含
量的变化
在每次循环培养中都要补加营养成分，为微藻
的生长和繁殖提供所需的营养物质。研究表明，微
藻所需的营养物质存在一个最佳浓度范围，低于或
高于此范围都会对微藻的生长产生抑制作用，甚至
导致微藻死亡。在小球藻的培养中，NO －3 － N、
PO3 －4 － P浓度对其生长有较大的影响，故本试验中
研究了 5 次循环培养中 NO －3 － N、PO
3 －
4 － P浓度的
变化，为上清液中补加营养成分提供参考。
本试验中，SE 培养基中初始 NO －3 － N、PO
3 －
4
－ P的浓度分别为 182、153 mg /L。从表 2 可见，
在 5 次循环利用的上清液中，NO －3 － N 的浓度为
21. 2 ～ 28. 3 mg /L，PO3 －4 － P 的浓度为 13. 9 ～ 19. 6
mg /L，变化范围不大。这说明藻体利用营养成分
的能力基本不变，同时也说明在循环利用上清液时
必须补加营养成分。
表 2 5 次循环上清液中 NO －3 － N、PO
3 －
4 － P含量的变化
Tab. 2 Change in NO －3 － N，PO
3 －
4 － P contents in the
supernatants in five cycles mg /L
循环次数 cycles ρ(NO －3 － N) ρ(PO3 －4 － P)
1
2
3
4
5
21． 2
24． 8
23． 9
25． 5
28． 3
13． 9
16． 7
17． 8
15． 7
19． 6
3 讨论
在微藻絮凝采收中，絮凝剂的种类对絮凝效果
和上清液的循环利用性能有较大的影响。本研究结
果表明，5 次循环培养的上清液中小球藻均能正常
生长，而壳聚糖的絮凝效率也在 95%以上，NO －3
－ N、PO3 －4 － P含量无抑制积累。这说明壳聚糖在
小球藻絮凝采收中具有一定的应用价值，但如果进
行更多次的循环培养，效果如何，还需进一步深入
研究。研究表明:上清液在循环利用时，微藻在生
长过程中会出现化感现象，通过化感作用影响自身
或其它藻体的生长能力，化感作用的方式为藻体将
化感性物质排放至培养液中;此化感性物质会改变
自身或其它藻体的表面结构，从而影响藻体对营养
物质的吸收能力和藻体排放体内代谢废物的能力;
在多次循环的上清液中化感性物质势必会积累，不
仅会影响藻体的生长，同时也会影响絮凝剂对藻体
的絮凝性能，导致上清液的循环利用性能下
降［14，17 － 21］。而选择合适的絮凝剂或在多次循环后
改用其它絮凝剂，或者选择絮体与上清液合适的分
离方法，都可降低上清液中化感物质的积累，从而
提高上清液的循环利用性能。一些研究表明，壳聚
糖对多种微藻均具有较高的絮凝效率［6，8 － 11］。但目
前关于上清液循环利用性能方面的研究较少，希望
本研究结果能为其它微藻的研究提供一些参考资
461 大 连 海 洋 大 学 学 报 第 27 卷
料。
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Green alga Chlorella vulgaris harvesting by chitosan
flocculation and reutilization of the supernatant
ZHANG Peng，LI Xing-rui，ZHANG Yong-kui
(Department of Pharmaceutical and Biological Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China)
Abstract:A new recycling mode to culture green alga Chlorella vulgaris was designed to solve the difficulties in
harvesting and recycling of the supernatant． The concrete procedures included the alga culture with air － lift reac-
tor，flocculate by addition of chitosan，collection of the supernatant through filtration，addition of nutrients into su-
pernatant，and putting supernatant into air － lift reactor to culture further． The result showed that there were slightly
higher growth rate and harvest levels of the algae in the next four cycles compared to the first cycle of the alga cul-
ture． The flocculation of chitosan was found to be effective，without inhibition． The supernatant supplemented with
quantitative nutrients，nutrients representative NO －3 － N，PO
3 －
4 － P content were accumulated in the absence of in-
hibition within each cycle． In conclusion，the effect of chitosan flocculation and the recycling supernatant harvested
for the alga culture is quite acceptable．
Key words:Chlorella vulgaris;chitosan;flocculation;recycling of supernatant
561第 2 期 张鹏，等:用壳聚糖絮凝法采收小球藻及上清液再利用的研究