全 文 ：小球藻异养培养的研究进展
闫　海 ,张　宾 ,王素琴 ,李雅雯 ,刘　硕 ,杨　帅
(北京科技大学应用科学学院生物科学与技术系 ,北京 100083)
摘要:单细胞绿藻在水产养殖 、环境保护 、人类健康食品和重要生命活性物质生产等众多领域的研究与应用得到不断扩展 ,
而如何高效培养出超高细胞浓度小球藻来满足各个应用领域的需要是我国亟待解决的藻类生物技术关键课题。主要针对小球
藻的异养培养和重要生命活性物质的生产等方面的国内外最新研究进展进行了综述 ,并对重要的研究领域进行了展望。
关键词:小球藻;异养培养;生命活性物质
中图分类号:Q914.82　 文献标识码:A　 文章编号:0253-4320(2007)04-0018-04
Advances in the heterotrophic culture of Chlorella sp
YAN Hai , ZHANGBin , WANGSu-qin , LI Ya-wen , LIU Shuo , YANG Shuai
(Department of Biological Science and Technology , School of Applied Science , Beijing University of Science and
Technology , Beijing 100083 , China)
Abstract:The research and application of unicellular green microalgae in many fields of aquiculture , protection of
environment , human health food and the production of biological active substances have been increased rapidly , however how to
culture Chlorella sp with very high cell density to meet the need of every application field is a key project in the field of
microalgal biotechnology.Here the research advances in the effective heterotrophic culture of Chlorella sp and the production of
biological active substances are reviewed , and some promising research fields in Chlorella sp are prospected.
Key words:Chlorella sp;heterotrophic culture;biological active substances
　收稿日期:2007-01-15;修回日期:2007-03-02
　基金项目:北京市自然科学基金资助项目(8063029),北京市教委共建项目和北京科技大学创新基金联合资助项目
　作者简介:闫海(1962-),男 ,博士 ,教授 ,研究方向为藻类生物学 、微生物环境生物学 , 010-62333177 , haiyan@sas.ustb.edu.cn。
　　作为最简单的光合作用有机体 ,微藻有时又被
称为单细胞藻类 。微藻中的小球藻是一种具有重要
经济价值的生物资源 ,有着巨大的应用和开发潜力 。
小球藻富含蛋白质 、不饱和脂肪酸 、类胡萝卜素 、叶
黄素 、虾青素和多种维生素 ,具有极高的营养价值和
提高免疫力的功能。另外小球藻还含有一种非常重
要的成分———小球藻生长因子 ,它既具有诱发干扰
素 、激发人体防御和免疫组织中的巨噬细胞 、T 细胞
和B细胞的功能 ,又具有促进人体对环境污染有害
物质解毒和排泄的作用[ 1] 。微藻属于低等植物 ,主
要吸收二氧化碳通过光合作用合成有机物 ,但采用
此种方法培养出的藻细胞浓度一般较低 。进入 20
世纪 70年代以来 ,国外学者发现 ,有些小球藻可以
在无光照条件下生长于有机物中[ 2-3] ,这不仅大幅
度提高了小球藻的生长速度 ,而且获得了很大的藻
生物量 ,从而引起了单细胞藻类培养的一次重要革
命。当前 ,美国 、日本 、以色列等国家和我国台湾地
区等已成为小球藻的主要生产地 ,而我国大陆尚未
发现有超高细胞浓度小球藻异养培养产业化生产的
报道 。
1　小球藻的培养
1.1　自养培养
1890年荷兰微生物学家 Beijerinck等首先在琼
脂平板上成功分离得到了小球藻的纯培养物 。
Otto Warburg 于1919年将这一纯培养物在实验室进
行纯培养 ,作为研究植物生理学的材料 ,研究发现 ,
小球藻可以进行光合作用 ,从而为小球藻的自养培
养研究拉开了序幕。小球藻的自养培养既可利用自
然光 ,也可利用人工光照 ,培养基主要由无机化合物
组成 ,最适 pH为 6.5 ～ 7.5 ,最适光照强度为 36 ～ 90
μmol/(m2·s),温度为 20 ～ 30℃。于贞等[ 4]的研究结
果表明 ,pH是影响小球藻生长的重要因素 ,光照强
度和通气量通过影响小球藻光合作用强度而调节小
球藻的生长 。小球藻可以利用铵盐 、硝酸盐和尿素
作为氮源 ,添加适量的含有痕量有机酸和微量元素
的土壤浸出液有利于小球藻的生长 。
1.2　异养培养
异养培养与自养培养最大的区别是前者利用有
机物作为碳源和能源 ,对小球藻异养培养的研究较
·18·
Apr.2007 现代化工 第 27卷第 4期
Modern Chemical Industry 2007年 4月
DOI :10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2007.04.005
自养培养起步晚。1953 年 , Lewin 等[ 5] 首先发现了
一些藻类能利用有机物作为唯一碳源和能源进行异
养生长 ,目前对微藻异养生长机理的研究还处于初
级阶段。Gladue 等针对有些微藻不能进行异养生长
这一现象推测有 3种假说:①缺乏利用有机物的酶
类 ,如一些微藻缺乏利用某些有机物的酶。 ②通透
性障碍。有机物必须通过细胞膜进入细胞内部才能
被藻类利用 ,然而有些藻类缺乏吸收有机物的机制 ,
为了克服这一问题 ,必须选取合适的有机物 。 ③限
制性的呼吸能力 。藻类通过呼吸作用分解自身储存
的物质 ,获得能量 ,维持细胞的存活 。然而 ,有些藻
类在异养条件下呼吸所产生的能量不足以维持生长
及运输外界环境中的有机物 。Endo 等检测了小球
藻利用包括糖 、有机酸和醇类等60多种有机碳源的
能力 ,结果表明 ,只有葡萄糖 、半乳糖 、乙酸 、乙醇 、乙
醛 、丙酮酸可分别作为唯一碳源支持小球藻的生长 ,
其中葡萄糖 、半乳糖和醋酸盐可在无光照条件下支
持蛋白核小球藻的快速生长。目前 ,小球藻异养培
养中应用最广泛的培养基是 Basal改良培养基[ 6] 和
K2N培养基[ 7] 。
近年来 ,对于小球藻的异养培养研究受到了众
多学者的重视 ,特别是高细胞浓度培养技术得到了
较深入和广泛的探索 ,取得了一系列重要的研究进
展[ 1 ,8-9] 。异养培养小球藻可以克服光自养培养的
诸多缺陷 ,是提高小球藻产量与产率的有效途径 。
笔者所在课题组于 2004年从天然水体中成功筛选
出了能够异养生长的小球藻种[ 1] ,发现当小球藻接
种量较低时 ,无论是自养培养还是异养培养 ,生长都
非常缓慢 ,延迟期达到 3 d以上 。当增大初始藻生
物量时 ,在黑暗条件下 ,小球藻生长迅速进入对数
期 ,培养第 2 d 就达到了最大生物量。在高的初始
藻生物量培养条件下 ,无光照异养培养小球藻的生
长速度远高于光照培养 ,因此黑暗异养培养超高细
胞浓度小球藻显示出了非常大的优势和潜力 。
Shi等[ 10]研究了不同葡萄糖浓度对小球藻生长
的影响 ,研究结果表明 ,当初始葡萄糖质量浓度在
10 ～ 80 g/L 时 ,所得小球藻细胞浓度随葡萄糖含量
的升高而增大 ,最大细胞干质量浓度可达 31.2 g/L。
但当初始葡萄糖质量浓度达到 100 g/L 时 ,小球藻
的延迟期相对较长 ,生长受到抑制。Sasaki等[ 11] 在
小球藻与细菌混合培养的污水处理体系中研究了葡
萄糖浓度对小球藻生长规律的影响 ,发现当葡萄糖
浓度较低时 ,藻细胞浓度也低 ,相对高的葡萄糖起始
质量浓度(如 50 g/L)可用于培养高细胞浓度的小球
藻。王素琴等[ 12]的研究结果表明 ,当初始葡萄糖质
量浓度大于 17.3 g/L 时 ,会抑制小球藻的生长 ,因
此推测在用发酵罐发酵培养小球藻的过程中 ,应该
依据小球藻的生长状况和葡萄糖的利用情况进行葡
萄糖的流加控制 ,这样可避免高葡萄糖浓度对小球
藻生长的抑制。刘世名等报道 ,流加分批培养小球
藻时 ,补料液中最适碳氮比为 41.2。张丽君等[ 13]认
为 ,在以葡萄糖和硝酸钾分别作为小球藻生长的碳
源和氮源时 ,碳氮比维持在 4 ～ 5是一种比较优化的
控制条件。王素琴等[ 12] 采用葡萄糖和硝酸钾对小
球藻进行异养培养的结果表明 ,初始碳氮比为 25∶1
时最好。导致最佳碳氮比差异的原因既可能与实验
　　(上接第 17页)
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·19·2007年 4月 闫海等:小球藻异养培养的研究进展
的藻种类不同有关 ,也可能由于所采用的碳 、氮化合
物种类不同所致。一般来说 , 碳占藻干质量的
49%～ 70%,而氮占藻干质量的 1%～ 11%,碳氮比
应该在 5 以上。因为在异养培养条件下 , 大约有
50%的葡萄糖会转化为二氧化碳 , 也就是说只有
50%左右的葡萄糖能够被藻类利用 ,因此在异养培
养小球藻过程中碳氮比应该在 10 以上。又因为小
球藻可以在一定限度内进行缺氮生长 ,因此培养基
中的碳氮比可能更高为好 。在批量培养条件下 ,一
般获得的小球藻细胞干质量浓度都在 10 g/L 以下 ,
而笔者筛选培养的小球藻细胞干质量浓度却可以高
达 26 g/L[ 1] ,说明不同种类的小球藻的异养生长能
力存在较大差异 。
由于批量培养不能进行碳 、氮源的补料和 pH
的控制 ,存在培养初期营养物质浓度高而抑制藻类
生长 ,而培养后期营养物质缺乏限制藻类生长的缺
点。采用发酵培养方式可以根据藻类的生长状况进
行流加补料 ,因此可以培养出高细胞浓度的藻类 。
Shi等[ 6]利用 Basal改良培养基在 30 L 发酵罐中培
养原核小球藻(Chlorella protothecoides CS-41),最大
细胞干质量浓度达到 16.4 g/L。Shi等[ 10]用 K2N 培
养基培养 Chlorella sorokiniana ,细胞干质量浓度可达
9 g/L。Liang 等[ 14]应用流加工艺在 5 、50 、200 、800 、
4 000 L机械搅拌发酵罐中大规模异养培养小球藻 ,
最高细胞干质量浓度达到 43.31 g/L ,比生长速率达
到0.069/h ,细胞生产率达到 0.62 g/(L·h)。Ogbon-
na等[ 15]研究了异养 、自养相结合培养小球藻的方
式 ,最终获得的细胞干质量浓度为 14 g/L。桂林
等[ 16]以大米糖化醪为碳源在发酵罐中培养蛋白核
小球藻 ,最高细胞干质量浓度达到了 18.3 g/L。笔
者最近进行的在 50 L 发酵罐中异养培养小球藻的
结果显示 ,通过流加碳 、氮源 ,并对 pH进行控制 ,可
以在 2 d内获得藻细胞干质量浓度高达 40 g/L以上
的产量 。上述研究结果表明 ,利用传统的机械搅拌
发酵罐大规模异养培养小球藻效率高 ,具有良好的
产业化应用前景 。
2　小球藻中的生命活性物质
2.1　细胞色素
小球藻细胞中叶绿素 a 的含量(质量分数 ,下
同)为 1.97%～ 2.04%,叶绿素b的含量为 0.55%～
0.58%, 胡 萝 卜 素 的 含 量 为 0.0441% ～
0.0448%[ 17-19] 。Shi 等[ 10]研究了不同葡萄糖浓度
对叶黄素产量的影响 ,结果表明 ,细胞中的叶黄素含
量随葡萄糖浓度的升高而增加 。当初始葡萄糖质量
浓度从10 g/L提高到 40 g/L时 ,叶黄素质量浓度也
从19.39 mg/L上升到 75.65 mg/L。王素琴等[ 12] 的
研究结果表明 ,异养培养出的小球藻细胞中含有叶
黄素 ,在不同培养方式下小球藻细胞中的叶黄素含
量会发生明显变化 ,变化范围为 0.5 ～ 1.5 mg/g ,主
要由碳氮比来控制。桂林等[ 19] 发现 , V(甲醇)∶
V(二氯甲烷)=2∶1的混合溶剂是从藻细胞中提取
叶黄素的较好试剂 ,提取率达到了 87.1%。
2.2　不饱和脂肪酸
目前 ,利用微藻生产多不饱和脂肪酸(PUFAs)
如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA),
是藻类生物技术的一个研究热点 。PUFAs具有降血
脂 、抑制血小板聚集 、降血压和抗动脉粥样硬化等多
方面的保健和药用价值[ 20-21] 。小球藻油脂中 EPA
质量分数高达 90%以上[ 20] 。我国台湾研究人员对
海水微细小球藻在不同盐度 、pH 情况下产 EPA 能
力进行了研究 ,使小球藻培养物中的 EPA 含量达
90.4 mg/g , 显示出海水微细小球藻具有良好的产
EPA能力[ 22] 。为了进一步提高普通小球藻产 EPA
的能力 ,可以采用细胞融合技术获得一种杂交小球
藻 ,它能更有效地生物合成EPA[ 23] 。林学政等[ 24]研
究发现 ,普通小球藻细胞中的 DHA 含量也很高 ,可
达28%。Chen等[ 7] 报道 ,在小球藻的异养培养中 ,
PUFAs的产量与氮源添加量有关 ,如果控制氮源供
给 ,可以避免藻体生物量增长过快 ,使 PUFAs 累积
量相对提高 。因此通过控制小球藻的培养条件 ,可
以提高PUFAs的产量。
2.3　生长因子
小球藻生长因子(Chlorella Growth Factor , CGF)
也叫小球藻精 ,它的主要成分是以短链多肽蛋白与
珍贵的天然核酸复合形式存在 ,含有17种游离氨基
酸 ,其中有 8种人体必需但只能通过外源补充的氨
基酸[ 25] 。此外 ,还含有核酸 、多糖 、多肽 、蛋白质 、
酶 、维生素 、矿物质等成分 ,被称为“类荷尔蒙”[ 26] ,
具有增强人体免疫能力 、活化人体细胞 、促进儿童生
长发育 、抵抗外来疾病的入侵 、促进人体受伤组织的
修复等功能。人服用小球藻后可以增加人体抵抗有
机污染物和重金属的能力 ,同时还可以防治胃溃疡 、
高血压和心血管疾病等。胡开辉等[ 27]的研究结果
表明 ,小球藻细胞活性物质可显著促进酵母发酵和
增强酵母抵抗杂菌的能力 。研究发现 ,从小球藻中
提取的 2种相对分子质量分别为 120 000和 70 000
的糖蛋白均具有抗肿瘤活性[ 28] 。此外 ,小球藻多糖
·20· 现代化工 第 27卷第 4期
和糖蛋白对肝癌 、白血病等恶性肿瘤也显示了抗肿
瘤活性 。前苏联 、日本等国均有将小球藻水溶性提
取物添加到护肤品和口红等化妆品中的专利[ 29] 。
目前 ,小球藻生长因子的提取技术及其生理活性的
研究已成为英国 、美国 、日本等国家研究开发的热
点。
3　研究展望
目前 ,关于细菌和动物细胞基因的研究较多 ,而
关于微细藻类方面的分子生物学研究尚不多见 ,因
此采用分子生物学和基因工程的最新研究成果 ,从
分子水平上研究自养和异养小球藻之间的基因差
异 ,无论对于基础研究还是应用研究都具有重要的
意义 ,这将成为未来藻类生物技术研究的热点之一 。
其次通过基因操作技术控制小球藻的代谢途径 ,增
加小球藻生产某种重要生命活性物质如叶黄素等的
量 ,在基础研究和应用研究方面也具有非常重要的
意义。另外 ,异养小球藻是目前植物界生长速度最
快的种类 ,以小球藻作为一种重要的出发藻种 ,通过
转基因技术将能够产生重要生命活性物质的基因转
入小球藻 ,通过培养小球藻来完成重要生命活性物
质的生产 ,这在解决一些药用植物生长缓慢问题方
面具有重要的应用价值 。随着科技的进步 ,异养小
球藻的研究与应用会越来越多 ,通过研究与开发 ,必
将使藻类生物技术得到大力发展 ,使之更好地造福
于人类。
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·21·2007年 4月 闫海等:小球藻异养培养的研究进展