全 文 ：小球藻紫外线诱变及高产藻株筛选
张学成1 , 时艳侠1 , 孟 　振2
(1.中国海洋大学生命学院 , 山东 青岛 266003;2.农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室
中国水产科学研究院黄海水产研究所 , 山东青岛 266071)
摘　要:　利用单细胞分离技术和紫外诱变育种技术 , 筛选高产小球藻株。通过单细胞分离技术获得的藻株 Chlorella vul-
garis Q7 , 生长速度和蛋白含量均优于其它藻株。以 C.vulgaris Q7 为出发株 ,进行紫外诱变 , 从 120株诱变单克隆中筛选出
3 个株系:M51 ,M59 ,M73。与出发株相比 , 突变株 M51 ,M59 ,M73 的生长速率分别提高了6.23%, 3.8%, 5.92%。蛋白含量
分别提高了 2.5%, 3.1%, 1.9%。研究了诱变株的最适生长条件 , 结果表明在 140 μmol·m-2·s-1 , 25 ℃时 ,诱变株具有最大
的生长速率和生物量。探讨了诱变株的遗传稳定性 ,结果表明诱变株可稳定遗传。
关键词:　小球藻;紫外诱变;蛋白含量
中图法分类号:　Q945　　　　　文献标识码:　A　　　　　文章编号:　1672-5174(2007)05-749-05
　　小球藻为(Chlorel la vulgaris Beijerinck)为普生性
单细胞绿藻[ 1] ,在自然界的分布广泛 ,以淡水水域为
多。它能利用光能自养 ,也能在异养条件下利用有机
碳源进行生长繁殖 ,生物量大 ,生长速度快 ,易于培养。
我国常见的种类有蛋白核小球藻(Chlorel la pyrenoi-
dosa)、椭圆小球藻(Chlorella el lipsoidea)、普生小球藻
(Chlorella vulgaris)等 。
小球藻的粗蛋白含量很高 ,可达 50%以上 ,而且蛋
白质品质也很好。作为非动物性资源 ,小球藻的必需
氨基酸组成是基本平衡的 ,达到联合国粮农组织(Food
and Agriculture Organization of the United Nations ,
FAO)对健康食品 8 种必需氨基酸的标准[ 1] 。与蛋白
质含量相比 ,小球藻的脂肪和糖类含量都很低 ,比大豆
低得多 ,粗纤维的含量(1%～ 4%)介于谷实类之间[ 1] 。
所以小球藻可作为蛋白质补充饲料 。同时 ,小球藻还
含有大量的叶绿素 、具生物活性的糖蛋白 、多糖及高达
13%的核酸等物质[ 2] 。小球藻中还富含小球藻生长因
子(Chlorella Grow th Factor , CGF)[ 3] ,具有多种医疗功
能[ 4-7] ,是人类理想的健康食品 ,具有较高的经济价值
和广阔的应用前景[ 8-9] 。
小球藻作为饲料 、食品的营养价值高 ,但营养成分
因品系 、培养方式不同而有所差异。本研究旨在从本
试验室保存的小球藻(C .vulgaris)中筛选出蛋白含量
高 ,生长速度快的藻株 ,以促进对小球藻的开发利用。
紫外线对高等植物具有较强的生物学效应 ,能够
在农业上进行诱变育种[ 10-11] 。本文先利用单细胞分离
技术从实验室保存的藻种中分离出生长快 、蛋白含量
高的株系 , 然后将其作为出发株 ,进行紫外线诱变育
种。
1　材料与方法
1.1 实验材料
采用中国海洋大学藻类遗传室保存的小球藻(C.
vulgaris)。
1.2 培养液成分
(NH2)2CO3 300 mg/L , KH2PO4 50 mg/L , MgSO4
300 mg/L ,FeSO4 8 mg/L ,NaCl 1 000 mg/L ,NH4HCO3
500 mg/L。
1.3 单细胞分离技术获得紫外诱变出发株
取对数期生长的小球藻 ,分别稀释 10 , 100 , 1 000
和 10 000倍涂抹于固体培养基上 ,在 23 ℃,光照 100
μmol·m-2·s-1[ 12] ,光周期 12L/12D 的条件下培养。
7 d后挑取深绿色单克隆藻菌落接种于液体培养液中 ,
选用 100 mL 三角瓶 ,内有 50 mL 培养液。共挑取了
120个单克隆藻菌落 ,在与前相同的条件下培养 ,每天
摇动 2次 。14 d后 ,去除贴壁严重的和颜色发黄的 ,挑
选出 50株藻液颜色浓绿 、不贴壁的小球藻。将这 50
株小球藻分别接种于新的液体培养液 , 2个平行样 ,相
同培养条件下 ,每天摇动 2次 ,以原有小球藻种作为对
照 ,每天计算它们的细胞密度。8 d后 ,根据其生长速
度和最终生物量 ,挑选出 15 株小球藻 ,生长速度和生
物量均大于对照 ,且藻液浓绿 ,无贴壁现象。
将 15株小球藻分别接种于新的液体培养液 ,换用
250 mL 三角瓶 ,内装 150 mL培养液 ,设置3个平行样 ,
　收稿日期:2007-01-05;修订日期:2007-03-15
　作者简介:张学成(1940-),男 ,教授 ,博导 , Tel:0532-82032789 , E-mail:xczhang@ouc.edu.cn
　 第 37卷　第 5期 　
2007年 9月　
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSIT Y OF CHINA
37(5):749～ 753
Sept., 2007
培养条件同上。以原有藻种作为对照 ,每天计算细胞
密度 。培养14 d后[ 13] ,各取 100 mL 在4 ℃离心 ,倒去
上清 , 将余下藻体在冷冻干燥机中干燥 , 冷井温度
-35 ℃,干燥 48 h后称重 ,此后每 1 h称重 1次 ,直至
恒重 。用凯氏定氮仪(KDN-4型蛋白质测定仪 ,上海纤
检有限公司)测粗蛋白含量 ,综合蛋白含量和生长速度
挑选出紫外诱变的出发株 。
1.4 紫外线诱变处理
1.4.1 紫外线诱变预试验　　分别取对数生长期的出
发株藻液 Chlorel la vulgaris Q7 1 mL 置小培养皿中 ,
再往培养皿中加入 4 mL 培养液 ,使藻液在培养皿底部
铺一薄层 ,在磁力搅拌[ 14]下 ,参照其他相关研究[ 15-19] ,
用 30 W 的紫外灯 ,照射距离为 15 cm 进行不同时间的
照射 ,分别为:0 , 1 , 2 , 5 , 10 ,20 , 30 min ,设置 3 个平行
样。根据致死率 ,确定适合本实验的诱变剂量 。
1.4.2 紫外线诱变　　以上述预试验中确定的诱变剂
量对出发株进行诱变 。
1.4.3 诱变后培养及突变株的筛选　　诱变后将全部
藻液转移到 100 mL 三角瓶中 ,遮光 5 h 以避免光修
复 ,3 d后将藻液涂于固体培养基上 ,12 d后 ,挑取体积
较大 、颜色浓绿的藻落 120株于 100 mL 三角瓶中培
养 ,培养液体积为 50 mL。经初步筛选(比较藻液颜
色 、是否贴壁),选择 50 株 ,将这 50 株接种到 100 mL
三角瓶中 ,培养液体积为 50 mL ,2个平行样 ,在与前相
同条件下培养。以 Q7 为对照 ,每隔一天计算细胞密
度 ,14 d后 ,根据终细胞密度选出 15株 。将 15株接种
到 250 mL 三角瓶中培养 ,设置 3个平行样 ,培养液体
积为 150 mL ,条件与前相同。以 Q7为对照 ,计算各株
藻的细胞密度 , 14 d后 ,离心 ,干燥 ,用凯氏定氮仪测粗
蛋白含量 。
1.5 光照对诱变株生长的影响
光照设置 4个梯度:60 ,100 ,140和 180 μmol·m-2
·s-1[ 13 , 20-23] 。培养温度为(25±1)℃,每一梯度设置 3
个平行样 ,隔天测其细胞密度 ,求平均值 ,实验重复 1
次。
1.6 温度对诱变株生长的影响
温度设置 4 个梯度(22 , 25 ,28 , 30℃)[ 13 , 20-23] 。光
照条件为 140μmol·m-2·s-1 ,每一梯度设置 3个平行
样 ,隔天测其细胞密度 ,求平均值 ,实验重复 1次。
1.7 对筛选出的高产诱变株进行传代稳定性分析
将诱变株分别接种入新鲜培养液中连续培养 5
代 ,对第 5代藻株测其生长曲线与第一代诱变株比较。
1.8 数据处理
文中数据采用 Excell结合 SPSS软件进行处理。
2　结果
2.1 单细胞分离法筛选实验结果
最后一轮的 15株小球藻筛选时 ,在起始密度相同的
情况下 ,14 d后 ,Q7的终细胞密度为 35.56×106 mL-1(见
图1),高于对照(23.91×106 mL-1)和其他株小球藻 ,而
且颜色深绿 ,细胞分散均匀 ,无结块 ,沉底的藻细胞经
轻轻摇动即可浮起 ,不紧附于底部。从蛋白含量上来
看(见图 2),最高的是 Q95 达到 62.83%,其次是 Q7
为 57.86%。但 Q95 株系终细胞密度显著低于对照
株 ,生长速率不理想 ,因此 ,选择 Q7作为紫外诱变的出
发株 。
图 1　单细胞分离藻株的终密度
F ig.1　The cell density of strains obtained
by the single cell clone
图 2　单细胞分离藻株蛋白含量
Fig.2　The protein content of strains obtained
by the single cell clone
2.2 紫外线诱变预试验结果
用紫外线处理小球藻细胞后 ,藻液颜色由原来的
绿色变浅甚至变白色 ,照射时间越长 ,颜色越浅 ,照射
时间为 1 , 2 , 5 min 的藻液变为浅绿 ,照射时间为 10 ,
20 , 30 min的藻液变为混浊白色 ,30 min的藻液可看到
有糁装固体。在显微镜下观察 ,存活细胞数目随着照
射时间的延长而降低。在照射后第 3 天时藻细胞死亡
率稳定下来 ,统计其死亡率(见图 3)。实验中使用的各
种紫外线剂量对小球藻细胞都有致死作用 ,辐射时间
从 10 min增至 20 min 时 ,藻细胞死亡率增加 2倍多 ,
说明此时的辐射量是处于多数细胞的敏感区域与耐受
极限 。为了获得较多的突变型 ,又不至于因为辐射剂
量过大造成大部分细胞死亡而残留一些不活跃的细
胞 ,作者认为 30 W紫外灯 、照射距离 15 cm ,辐射时间
20 min适合本次实验 。
750 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 7 年
图 3　不同剂量紫外线照射致死率
Fig.3　The mor tality of Q7 by UV at different doses
注:图中数据为三个重复组平均数(Date in the table is the average
of three repeating groups)。
2.3 诱变后优良藻株的选育
在最后一轮的 15株藻培养 14 d后 ,终细胞密度最
高的 3株藻为 M51 , M59和 M73 。M51的终密度达到
43.78×106 mL-1;M59 为 40.5×106 mL-1;M73 为
42.69×106 mL-1 ,高于 Q7(34.79×106 mL-1)及其他
株藻(见图 4)。Q7 的蛋白含量为 56.97%,诱变株
M51为 58.42%;M59为 58.73%;M73为 58.06%,均
比Q7 高出 1 ～ 2 个百分点(见图 5)。M51 , M59 和
M73在培养过程中藻液由鲜绿到浓绿 ,藻细胞分布均
匀 ,不沉底 ,不贴壁 ,这些都是在大生产中优良株系应
具备的生理特征 。经上述终密度 、蛋白含量的比较等 ,
筛选出 3个优良藻株:M51 ,M59和 M73。
图 4　诱变株细胞密度
Fig.4　The cell density of mutants
图 5　诱变株蛋白含量
Fig.5　The pro tein content of mutants
2.4 光照对诱变株 M51 ,M59和 M73生长的影响
从图 6可以看出 ,3个诱变株生长的最适光照均为
140μmol·m-2·s-1 。在 60 ～ 140μmol·m-2·s-1范围内
诱变株的终细胞密度随着光强的增大而增大 ,当光强
高于 140μmol·m-2·s-1时诱变株的终细胞密度呈下降
趋势 ,说明高光强下 , 诱变株的生长出现光抑制 。在
140 μmol·m-2·s-1时 ,M51的终细胞密度可达 43.9×
106 mL-1 ,M59的终细胞密度为40.3×106 mL -1 , M73
的终细胞密度为 41.1×106 mL-1 。M51的终细胞密
度高于 M59 和 M73。另外 ,在 60 μmol·m-2·s-1和
100 μmol·m-2·s-1下时 , M51 的终细胞密度也高于
M59和 M73 ,这反映了 M51比 M59和 M73更具有潜
在的养殖性能 。在 180μmol·m-2·s-1时 , M51 的终细
胞密度略低于 M73 ,可能是因为 M51对强光的适应性
低于 M73。出发株在 60 μmol·m-2·s-1 , 100 μmol·
m-2·s-1 ,140 μmol·m-2·s-1下生长时 ,终细胞密度均
低于诱变株 ,在 180μmol·m-2·s-1下时 ,其终细胞密度
稍高于诱变株 ,这可能归于出发株耐受高光强的能力
稍强的缘故。
图 6　光照对诱变株生长的影响
Fig.6　The effect of light on the grow th of mutants
图 7　温度对诱变株生长的影响
Fig.7　The effect of tempreture on the grow th of mutants
2.5 温度对诱变株生长的影响
从图7上可以看出 ,3个诱变株生长得最适温度均为
25 ℃。在 30 ℃时生长情况最差 ,M51在 25 ℃时的终细
胞密度为43.6×106 mL-1 ,是 30 ℃时终细胞密度的 1.8
倍;M59在 25 ℃时的终细胞密度为 40.5×106 mL-1 ,是
30 ℃时的 2.2 倍;M73 在 25 ℃时的终细胞密度为
7515期 张学成 ,等:小球藻紫外线诱变及高产藻株筛选
42.5×106 mL-1 ,是 30 ℃时的 1.8倍。M51的生长状
况最好 ,在 4个温度梯度下培养时 ,其终细胞密度都高
于M59和 M73。出发株在 22 ℃下时 ,终密度稍高于
M59 ,低于 M51和 M73;在 25 ℃时 ,出发株的终密度
低于诱变株 ,在 28 ℃和 30 ℃时 ,稍高于 M59 ,低于
M51和 M73。综合上述光照实验 ,可看出 M51生长速
率优于 M59 和 M73 ,与筛选时得到的结果一致 , M51
最具备工业化养殖的潜力 。
2.6 诱变株传代稳定性分析
诱变株稳定性分析见图 8。诱变株第一代以 M51
为代表 ,诱变株 M51 , M59和 M73 的第 5 代生长曲线
与第 1代 M51相比并未发生明显变化 ,说明选育的变
异藻种具有良好的遗传稳定性 。
图 8　诱变株第 1 代与第 5 代生长曲线比较
Fig.8　Comparison o f g rowth curves of 1st generation
and 5th generation mutants
2.7 原藻种 、出发株 、诱变株生长曲线比较
图 9所示为原藻种 、出发株和诱变株的生长曲线
比较 ,诱变株以 M51为代表。原藻种在第 11 d时达到
生物量的最高峰 ,细胞密度为 24.22×106 mL-1 。Q7
在第 11 d时依然保持较高的生长速度 ,在第 14 d时细
胞密度达到最高值:35.56×106 mL-1 。可见出发株
C .vulgaris Q7比原藻种生长期长 、生物量高 。诱变
株的生长速率一直远高于原藻种和出发株 ,在生长到
第7 d时细胞密度已高于原藻种的最高细胞密度。它
的生长期和出发株 Q7相似 ,在生长到第 14 d时 ,细胞
密度达到最高值:43.78×106 mL -1 。
图 9　原藻种 、出发株 、诱变株 M51生长曲线比较
Fig.9　Comparison of grow th curves of original species ,
parent strain and mutants
3　讨论
在小球藻的大规模生产中 ,高生物量 、高蛋白含量
的藻种是关键的 ,因此研究者一直致力于筛选生长速
度快 、蛋白含量高的小球藻。紫外线诱变是一种有效
的育种方法。它干净;易处理 ,并能使培养达到无菌 ,
深得研究者青睐。紫外线照射 DNA 后 ,形成嘧啶二聚
体 ,严重影响 DNA的复制和转录 ,引起基因突变和染
色体畸变 ,产生各种各样的变异[ 16 ,24] 。通过人工选择
再加上育种上的一些措施 ,可以培育出生产上需要的
各种优良品种 。紫外线诱变育种广泛用于工业微生物
和农业植物 ,在藻类方面报告甚少。黄世玉等用紫外
线辐射坛紫菜离体细胞 , 认为它是一种有效诱变因
子[ 16] ;庄惠如等用紫外线诱变雨生红球藻 ,结果表明 ,
与出发株相比 ,诱变株虾青素积累率提高 37.85%,但
生长速率有所下降[ 15] 。
本文通过紫外诱变筛选出的 3 株小球藻 , M51 ,
M59 ,M73 ,14 d后的细胞终密度平均比通过单细胞分
离的出发株 C.vulgaris Q7高出约 26%,平均生长速
率比出发株分别提高了 6.23%,3.8%, 5.92%。在这
3株藻中 ,M51的生长速率提高的最多 ,M59的蛋白含
量提高的最多 ,这是由紫外线辐射造成的不同变异引
起的 。作者推测紫外线辐射提高了小球藻的细胞增殖
能力或者激活了与叶绿体的 DNA蛋白质合成体系有
关酶的活性 ,从而刺激了叶绿体的发育 ,提高了光合作
用的能力 ,提高了生长速率及生物量。
对比图 1 和图 4 可看出 ,采用单细胞分离技术得
到的各藻株终密度差异较大 ,紫外诱变得到的各藻株
终密度差异相对较小。究其原因 ,可能是原藻种在长
期的培养过程中 ,产生了各种各样的自发突变 ,形成性
状各异的株系 ,而紫外诱变的株系来源于同一单细胞
(C .vulgaris Q7),性状相对统一 ,相对来说 , 差异较
小。
藻的蛋白含量 ,无论是单细胞分离技术筛选出的
各藻株之间 ,还是紫外诱变后筛选出的各藻株之间 ,都
差异不显著。原藻种虽存在各种自发突变 ,但各株株
系的蛋白含量仍接近(见图 2),不如生长速率的变化显
著 ,经过紫外诱变筛选出的各株系 ,见图 5 ,蛋白含量也
是差异不大 , 最后确定的有工业养殖潜力的 M51 ,
M59 ,M73的蛋白含量也仅比出发株 C .vulgaris Q7
高出约 2.5%,由此推测小球藻的蛋白含量比较稳定。
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The UV-Irradiation of Chlorella .vulgaris Beijerinck and
Screening of Productive Strain
ZHANG Xue-Cheng1 , SHI Yan-Xia1 , MENG Zhen2
(1.Colleg e of Marine Life Science , Ocean University of China, Qingdao 266003 , China;2.Key Laboratory for Sustainable U ti-
lization of Marine Fisheries Resource , Ministry of Ag riculture , Yellow Sea Fisheries Research Institute , Chinese Academy of Fishery
Science , Qingdao 266071 , China)
Abstract:　Productive st rains of Chlorella.vulgaris Beijerinck were f ilt rated by sing le cell clone combined
w ith ult raviolet-i rradition.Chlorella.vulgaris Q7 , which g row s faster and contains more protein than the
o thers , was selected by single cell clone.Then the C .vulgaris Q7 was irradiated by ult raviolet to obtain mu-
tants.We obtained 3 st rains of mutants , named M 51 , M59 and M 73 , f rom 120 clones.Compared with the
parent st rain , the g row th rates of mutants M51 , M59 and M73 w ere increased by 6.23 , 3.8 and 5.92%, re-
spectively and their protein contents w ere increased by 2.5 , 3.1 and 1.9%, respectively .The most sui table
foster situation of product ive st rains w as studied.It showed that the product ive st rains have the g reater g row th
rate and bio-mass at 140μmol·m-2·s-1 , 25 ℃.Their genetic stabili ty w as analysed also.Good genetic stabili-
ty w as concluded.
Key words:　Chlorella vulgaris;ult raviolet-irradition;protein content
责任编辑　于　卫
7535期 张学成 ,等:小球藻紫外线诱变及高产藻株筛选