全 文 ：第 16卷第 2期 上 海 水 产 大 学 学 报 Vo .l 16, No. 2
2007年 3月 JOURNAL OF SHANGHAI F ISHERIES UN IVERSITY M ar. , 2007
文章编号:1004 - 7271(2007)02 -0135 -05
小球藻蛋白质的分离 、纯化及抗氧化特性
收稿日期:2006-06-28
基金项目:江苏省教育厅自然科学研究指导性计划(NK0410193)
作者简介:魏文志(1970 -),男 ,湖北天门人 ,讲师,主要从事生物饵料方面的研究。 E-m ail:w zw ei38@ sohu. com
魏文志1, 2 , 夏文水 1 , 吴玉娟2
(1. 江南大学食品学院 , 江苏 无锡　214036;
2.扬州大学动物科学与技术学院 , 江苏 扬州　225009)
摘　要:从小球藻中提取蛋白质 , 并研究了小球藻蛋白质抗氧化特性。通过反复冻融 、细胞破碎 、离心 、盐析和
凝胶层析 ,从小球藻中得到两种蛋白质(P roⅠ 和 P roⅡ ),获得率分别为 0. 280%和 0. 664%。经 SDS-聚丙烯酰
胺凝胶电泳显示为单条带 , 分子量分别为 20. 2 ku和 20. 4 ku。紫外可见光谱显示 , P roⅠ在 280 nm 有一特征
吸收峰 , P roⅡ在 280 nm和 675 nm处各有一特征吸收峰。 体外设计清除超氧阴离子自由基(O 2― )和羟自
由基( OH)实验 , 结果显示两种蛋白质能清除超氧阴离子自由基 ,黑暗条件下能清除羟自由基 , 但光照条件
下生成羟自由基。
关键词:小球藻;蛋白质;分离纯化;抗氧化活性
中图分类号:S 963. 2;S 917　　　文献标识码:A
Isolation, purification and property of anti-ox idation
of the proteins from Chlorella pyrenoidosa
WEIW en-zhi1, 2 , XIA W en-shui1 ,WU Yu-juan2
(1. School of Food S cience and Technology, Southern Yang tzeUn iversity,Wuxi　214036, China;
2. College of Anima l Science and Technology, Yangzhou Un iversity, Yangzhou　225009, China)
Abstract:The prote ins o fCh lorella pyrenoidosa were ex tracted and the p roperty of anti-ox idation o f prote ins
w as stud ied. Through repea ted freezing and thaw ing, ce ll crush ing, cen trifug ing, salting out and column
chromatography, the tw o pro te ins (ProⅠ and ProⅡ )were obtained from Chlorella pyrenoidosa. The ex traction
ra te of P roⅠ and ProⅡwas 0. 280% and 0. 664%. It has been demonstrated by SDS-PAGE as a sing le band
and the irmo lecularw eigh tw as 20. 2 ku and 20. 4 ku respective ly. UV scanning spectrum show s that ProⅠ has
abso rption at point 280 nm and ProⅡ has absorption at po int 280 nm and 675 nm. In order to estimate the
antioxida tion activity of ProⅠ and ProⅡ , supe roxide an ion(O 2― )and hydroxy l rad ica ls( OH)in vitrowere
designed respectively. The re sults show ed that bo th P roⅠ and ProⅡ could scavenge supe roxide anion and
genera te hydroxy l radicals in ligh t, but scavenge hydroxy l radica l in dark.
Key words:Chlorella pyrenoidosa;pro tein;iso lation pu rifica tion;an tioxygenic ac tiv ity
　　蛋白核小球藻(Ch lorella pyrenoidosa)分类上属于绿藻门 、绿球藻目 、小球藻科 、小球藻属 ,为单细胞
植物。小球藻可快速繁殖和生长 ,是地球上植物中唯一能在 20 h增长 4倍的物种。小球藻营养价值
高 ,其干粉的蛋白质含量在 50%以上[ 1] 。已经证明小球藻热水抽提物具有促进免疫 、抗肿瘤的作
用 [ 2, 3] ,但小球藻的哪些成分有这些作用 ,则有进一步研究的必要 。小球藻蛋白质的分离纯化的报道很
少 ,而小球藻蛋白抗氧化作用的研究至今没有见到报道。本文以小球藻藻泥为原料 ,经反复冻融 、细胞
破碎 、离心 、盐析和凝胶层析得到两种分子量不同的蛋白质 ,并对两种蛋白质的抗氧化特性进行了研究 ,
为进一步探讨小球藻蛋白质促进免疫 、抗肿瘤的作用提供基础和理论依据。
1　材料和方法
1. 1　实验材料和主要仪器
小球藻藻泥 (Ch lorella pyrenoidosa)(江苏农科院微藻研究中心);Sephadex G - 75(Pharmacia Co)、
标准蛋白(宝生物工程 (大连)有限公司)
超声波细胞破碎机 (JD - 600型 ,宁波邱隘金达超声波仪器厂 )、高速冷冻离心机 (5810R, 德国
Eppendo rf)、核酸蛋白检测仪 (HD - 21 -1型 ,上海青浦沪西仪器厂)、电泳仪 (EPS300,上海天能科技有
限公司 )、真空冷冻干燥机 (FD - 5型 ,上海离心机械研究所 )。
1. 2　小球藻蛋白质的粗提
1. 2. 1　粗提
称取 200 g小球藻藻泥 ,悬浮于 2000 mL pH7. 0的 0. 001 mol /L磷酸缓冲液 (PBS)中 ,反复冻融 3
次 。然后用超声波细胞破碎机在冰浴中破碎细胞 9 m in(每 90 s间歇 60 s)。 4 ℃12 000 r /m in离心
30 m in,去细胞碎片获上清液。
1. 2. 2　盐析
在上清液中加 30%饱和度硫酸铵 ,边缓慢搅拌边加入。 4 ℃静置盐析 24 h后 , 12 000 r /m in 4 ℃离
心 30m in,上清液和沉淀分别收集 。上清液用超滤杯浓缩至 200 mL,为上柱样品 。沉淀用少量 PBS溶
解 ,置入透析膜于 pH7. 0的 0. 001mo l /L PBS中搅拌透析 2 d ,聚乙二醇 -6 000包埋浓缩至 60mL,为上
柱样品 。
1. 3　纯化
SephadexG - 75充分溶胀抽气后装柱 ,柱型 1. 6 cm ×50 cm ,流速 0. 5 mL /m in,核酸蛋白检测仪灵敏
度为 0. 5 A ,记录仪走纸速度 3 cm /h,管速 7管 /h,以 pH7. 0的 0. 001mo l /L磷酸缓冲液 (PBS)为洗脱
剂 ,根据洗脱峰 ,收集较浓部分 。
1. 4　纯度鉴定和分子量测定
采用 SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳[ 4] ,分离胶浓度 12%,电极缓冲液为 T ris -甘氨酸电泳缓冲液 ,
水∶异丙醇∶冰醋酸 (13∶5∶2)的 0. 1%考马斯亮蓝 R - 250染色 ,水∶乙醇∶冰醋酸(17∶1∶2)脱色 ,采用标
准分子量蛋白质作标准 ,溴酚蓝为指示剂 ,以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作标准曲线 ,根据
蛋白质的迁移率从标准曲线上读取分子量 。
1. 5　氨基酸测定
称取蛋白质样品置于水解管中 ,加入 6mo l /L的 HC1溶液 ,真空封口 ,在 110℃下水解 24 h,冷却后
定容 、过滤 、蒸干 ,再加入 0. 02mo l /L的 HC l溶液在空气中放置 30m in,上氨基酸分析仪 (HP1100型 ,美
国 A gilen t公司 )测定氨基酸的含量 。
1. 6　光谱测定
紫外可见吸收光谱采用 UV - 2401PC分光光度计 (日本岛津公司 ),室温条件下测定 。
1. 7　类 SOD活性测定
采用邓碧玉等 [ 5]的方法。测定时 ,于 4. 5mL 50 mmo l /L pH8. 3磷酸缓冲液中加入 10 μL 50mmo l /L
邻苯三酚 ,迅速摇匀 ,倒入光径 1 cm的比色杯中 ,在 325 nm波长下每隔 30秒测吸光度值 1次 ,要求自
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氧化速率每分钟 OD值变化约 0. 07。活力测定方法与上相同 ,加入邻苯三酚前 ,加入待测样品溶液 ,得
数据按下式计算酶活力。酶活单位定义:每毫升反应液中 ,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达 50%的
酶量为 1个酶活单位 (U /mL):
酶活性 (U /mL)=
0. 070 -A325nm /m in
0. 070
×100
50% ×反应液总体积 ×样液稀释倍数样液体积
1. 8　羟基自由基清除率的测定
采用周站平等[ 6] α-脱氧核糖法 ,取 0. 2mL的 FeSO 4 -EDTA混合液 (10 mmol /L)于具塞试管中 ,
加入 0. 2 mL的 α-脱氧核糖法溶液(20mmol /L),然后再加入 0. 2 mL测试样品 ,并用磷酸缓冲液 (pH
为 7. 4)定容至 1. 8mL,最后加入 0. 2mL的 H2O2(10 mmo l /L), 37 ℃水浴 1 h,然后加入 1mL 2. 8%的
三氯乙酸终止反应 ,再加入 1 mL 1%的硫代巴比妥酸 (TBA),混匀后沸水浴中加热 10 m in,冷却后于
532 nm处测吸光度 As。不加样品 ,同样操作处理 ,测定其对比吸光度 Ac。样品自由基清除能力 SA%
(scaveng ing activity)=(A s -Ac) /A s
2 　结果与分析
2. 1　小球藻蛋白质的纯化
上清液样品上样后 ,可见到淡绿色区带洗脱下来 ,见图 1。沉淀样品上样后 ,可见到较深的绿色区
带洗脱下来 ,见图 2。洗脱后样品经透析袋透析 、浓缩 、冷冻干燥 ,得固体样品 。 ProⅠ和 ProⅡ获得率分
别为 0. 280%和 0. 664%。 ProⅠ为淡绿色 , ProⅡ为绿色。
图 1　上清液 SephadexG -75层析图谱
F ig. 1　Ch rom a tog raphy pa ttern o f the superna tant
图 2　沉淀 SephadexG -75层析图谱
F ig. 2　Chroma tog raphy patte rn o f the sediment
2. 2　小球藻蛋白质纯度鉴定和分子量测定
从图 3可以看出 ,两种蛋白质经 SDS-PAGE电泳 ,均显示一条带 ,说明两种蛋白质均为电泳纯。与
标准蛋白质分子量比较 ,结果显示 ProⅠ分子量大约为 20. 2 ku, ProⅡ分子量大约为 20. 4 ku。
2. 3　氨基酸测定
两种小球藻蛋白质的 17种氨基酸质量分数见表 1。酸性氨基酸有 Asp和 G lu,在 ProⅠ中 A sp和
G lu含量最高 ,在 ProⅡ中 Asp含量较高 ,而 G lu含量低一些 。碱性氨基酸有 H is、A rg和 Lys,在 ProⅠ和
ProⅡ中含量均较低 ,说明 ProⅠ和 ProⅡ均为酸性蛋白。
2. 4　紫外可见光谱测定
两种蛋白质经紫外可见光扫描(图 4), ProⅠ在 280 nm有一特征吸收峰 , ProⅡ为除了在 280 nm有
一特征吸收峰外 ,在可见光区 675 nm处有一特征吸收峰。
1372期　　　　　　　　　　　　　魏文志 , 等:小球藻蛋白质的分离 、纯化及抗氧化特性
图 3　两种蛋白质电泳图谱
F ig. 3　E lectropho re tic pa tterns of the tw o pro teins
2. 5　类 SOD活性测定
从图 5可以看出 ProⅠ和 ProⅡ都能抑制连苯三
酚自氧化速率 ,从而对 O 2― 具有一定的清除能力 ,
且随着浓度的升高 ,清除率是逐渐升高的 。
2. 6　羟自由基清除率的测定
羟自由基是化学性质最活泼的活性氧 ,几乎能
和生物体内所有的分子发生反应 。图 6结果显示在
光照条件下两种蛋白质具有生成羟自由基的作用 ,
浓度越高生成羟自由基的能力越强。图 7结果显示
在黑暗条件下两种蛋白质均具有清除羟自由基的作
用 ,浓度越高清除羟自由基的能力越强。
3　讨论
林芃等 [ 7]提取纯化小球藻蛋白质得到四种蛋白
质 ,且四个峰的峰值近似。本实验经粗提 、凝胶层析
同样得到四个峰 ,但有两个峰的峰值很低 。可能是
同一属的植物 , 种不一样 , 组成藻类的成分不一
样 [ 8] 。两种蛋白质经 SDS - PAGE电泳 , 显示一条
带 ,说明两种蛋白质均为电泳纯 。
表 1　两种蛋白质氨基酸组成
Tab. 1　Am ino ac ids of the two proteins
名　称 含量(g /100g)
ProⅠ P roⅡ 名　称
含量(g /100 g)
P roⅠ ProⅡ
Asp 0. 550 0. 308 Cys 0. 013 0. 006
G lu 0. 425 0. 156 Val 0. 257 0. 183
S er 0. 228 0. 114 M et 0. 097 0. 140
H is 0. 122 0. 062 Phe 0. 272 0. 425
G ly 0. 280 0. 164 Ile 0. 191 0. 096
Th r 0. 226 0. 107 Leu 0. 353 0. 190
A la 0. 339 0. 170 Lys 0. 185 0. 079
A rg 0. 196 0. 113 Pro 0. 175 0. 040
Tyr 0. 226 0. 129
图 4　两种蛋白质紫外可见吸收光谱
F ig. 4　U ltrav io let and v isible spectrum s
o f the two prote ins
图 5　两种蛋白质不同浓度对类 SOD活性的影响
F ig. 5　The e ffects of concentrations o f
the two prote ins on the like - SOD ac tivity
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图 6　光照条件下两种蛋白质对生成羟自由基的能力
F ig. 6　 OH producing capacities on diffe rent
concentrations o f the two p ro te ins in light
图 7　黑暗条件下两种蛋白质清除羟自由基的能力
F ig. 7　 OH scaveng ing capacities on different
concen tra tions of the tw o pro teins in da rk
　　机体新陈代谢产生的自由基是人体生命活动中生物化学反应的中间产物 ,包括羟基自由基 、超氧阴
离子自由基等。许多疾病的发生 、发展与自由基对组织的损伤有密切关系 ,它们可以损伤碳水化合物 、
蛋白质 、脂类 、核酸等生物大分子物质 ,可导致功能和代谢紊乱 ,可加快机体的衰老过程 ,可诱发癌症 、心
血管疾病等 [ 9] 。正常情况下 ,机体产生和清除自由基处于动态平衡 。但当物理或生物的因素引起自由
基不能被及时清除 ,外源自由基清除剂可以降低体内自由基水平 ,使机体维持一个良好的状态 [ 10] 。
在碱性条件下 ,连苯三酚会发生自动氧化反应 ,释放出超氧阴离子 。连苯三酚自氧化速率与超氧阴
离子产生的浓度有关 ,自氧化速率被抑制的大小显示超氧阴离子自由基 O 2― 被清除的强弱 。生物体
内 SOD是机体用于消除 O 2― ,从而消除自由基对机体氧化损伤的酶 。目前发现的大多数 SOD几乎都
是酸性蛋白 ,两种小球藻蛋白质也是酸性蛋白 ,可能它们清除 O 2― 的机理和 SOD是一样的 ,即与机体
内的 Cu2+、Zn2+等共存的方式起作用的 [ 11] 。
羟自由基是化学性质最活泼的活性氧 ,其反应速度快 ,是对机体危害最大的自由基 。 FeSO4 -H 2O 2
脱氧核糖体系在 pH7. 4的磷酸缓冲液中反应时 ,产生的 OH进攻脱氧核糖 ,最终降解形成丙二醛
(MDA), TBA与 MDA在酸性环境中结合生成粉红色化合物 。本研究说明小球藻蛋白质对自由基的清
除作用是有条件的 ,具有生成和清除的双重功能。这与周站平等 [ 6]报道钝顶螺旋藻的别藻蓝蛋白在光
照下具有生成羟自由基的能力 ,而在黑暗下却表现为清除羟自由基的实验结果是相似的。小球藻蛋白
质是小球藻的捕光色素蛋白 ,光照条件下 ,当存在适当的电子供体或电子受体 ,小球藻蛋白质能给出电
子 ,从而产生自由基。在黑暗条件下 ,小球藻蛋白质与羟自由基反应的速率大于脱氧核糖 ,保护了脱氧
核糖免受氧化损伤 ,从而具有清除自由基的作用[ 12] 。
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