全 文 ：　收稿日期:1999-01-20
＊基金项目:广东省科技攻关资助项目
　论文联系人:梁世中
　作者简介:刘世名(1970-), 男 , 博士生,现在山东大学生命科学院工作, 主要从事微生物发酵工程研究.
生物反应器高密度异养培养小球藻＊
刘世名1 , 孟海华2 , 梁世中1 , 尹建云2 , 麦平珍2
(1.华南理工大学 食品与生物工程学院 , 广东 广州 510640;
2.广东江门生物技术开发中心 , 广东 江门 529081)
摘　要:首先用摇瓶实验确定异养流加分批培养小球藻中起始葡萄糖及 KNO3 的适宜浓度与流加
葡萄糖及 KNO3 浓度的控制范围和补料液中最适 C/ N 值.培养基中起始添加 10 g·L-1葡萄糖和
1.6 g·L-1KNO3 较适宜.在此前提下 , 流加分批培养时葡萄糖和 NO3-质量浓度应分别控制在
6.17～ 2.45 g·L-1和≤0.44 g·L-1 , 补料液中最适 C/N 值为 41.2.据此结果 , 经 5L 通风搅拌反
应器放大培养实验 , 效果良好.连续流加分批异养培养小球藻 59 h , 总糖 60 g·L-1 , 得藻生物量
34.1 g·L -1 , 葡萄糖转化率为 56.8%, 实现了高密度培养.
关键词:小球藻;高密度;搅拌反应器;异养培养
中图分类号:TQ 920.6　　文献标识码:A　　文章编号:1000-565X(2000)02-0081-06
微藻具有多种重要功能和商业价值 , 已在食品 、农业 、废水处理及水产养殖等领域得到广
泛应用 , 还成为多种贵重化学制剂和药物的来源 , 如:EPA(Eicosapentaenoic Acid), DHA(De-
cosahexaenoic Acid), 藻胆蛋白(Phycobiliprotein), β -胡萝卜素(β -carotene), Vc , 叶黄素
(Xanthophy ll), 虾青素(Astaxanthin)等[ 1～ 4] .
微藻多为光合自养 , 同化 CO2 成葡萄糖 , 提供细胞结构物质单元和代谢能量以生长繁
殖.但一般光合自养微藻的生物量均较低 , 如工厂化生产的螺旋藻产量还不到 1.0g·L-1.异
养培养微藻可以克服光自养培养诸多缺陷 , 是提高微藻产量与产率的有效途径 , 在国外已引
起高度重视 , 已筛选出多种具有异养功能和高产量的微藻种[ 2 , 3 , 5] .Ky le 等[ 2] 筛选到的
Crypthecoainium 种 , 异养培养 60 ～ 90 h , 生物量可达 40g·L-1;筛选到的 Nitzschia 种 , 异养
培养 64 h , 生物量可达 45 ～ 48g·L-1.而国内对于微藻高密度异养培养研究还处在萌芽阶段.
用生物反应器连续流加限制性基质培养细胞 , 可以实现高密度培养.但首先得确定限制
性基质的起始浓度和流加浓度.溶氧是摇瓶培养细胞浓度不高的一个限制因子.异养培养中
有机 C源和 N源是细胞生长的限制性基质.所以 , 可以用摇瓶模拟实验来确定异养流加分批
培养中起始葡萄糖和 KNO3 的适宜浓度与流加葡萄糖及 KNO3 的浓度 , 为进一步放大 、高密
度培养提供理论依据.
本文中利用小球藻(Chlorella vulgaris), 首先在摇瓶水平上 , 研究了葡萄糖和 KNO3 及
两者的正交组合对小球藻异养培养的影响;同时 , 将异养小球藻生长速率与葡萄糖及 KNO3
的消耗状况结合起来 , 分析出流加葡萄糖和 KNO3的浓度范围.在此基础上 , 进行了5L 通风
华 南 理 工 大 学 学 报(自 然 科 学 版)
第 28 卷第 2 期 Jour nal of South China Universi ty of Technology Vol.28　 No.2
2000 年 2 月 (Natural Science Edition) February　2000
搅拌反应器的连续流加分批培养实验.
1 材料与方法
1.1　小球藻种及其培养
小球藻种由香港大学陈峰博士惠赠.培养基参照文献[ 6]所示的A 培养基 , pH=6.5.另
外 , 依实验条件添加不同量葡萄糖.摇瓶培养时 , 250 ml三角瓶装培养液 100 ml.5L 搅拌反
应器(日本 L.E.MARUBISHI 公司生产)培养时 , 工作容积为 3L.121 ℃灭菌 30 min , 超净
台上接种 , 于 30℃、140 r/min(摇瓶)或 350 r/min(搅拌反应器 , 通无菌空气量 0.8 vvm)、黑
暗培养.
1.2　小球藻生物量的测定
用 721型分光光度计测定.以藻液在 540 nm 处的光密度 A 540值表示小球藻细胞密度.
藻液经离心后用蒸馏水冲洗再离心 , 重复 3次 , 将藻泥于烘箱中烘至恒重(60 ℃), 称重得藻
生物量.
1.3　葡萄糖含量的测定
采用 3 , 5-二硝基水杨酸法测定[ 7] .A 610对葡萄糖量[ y(g·L-1)]的直线回归方程为
　　y =-0.108 9+4.366 6 A 610 , r=0.999 7.
1.4　NO3-含量的测定
采用二磺酸酚法测定[ 8] .A450对 NO3-量[ y(g·L-1)]的直线回归方程为
　　y =-0.003 154+0.168 73 A 450 , r =0.995 4.
2 结果与分析
2.1　分批培养最适葡萄糖浓度的确定
在培养基中添加 0 、 5 、10 、 20 、 40 、 60 、100 g·L-1葡萄糖(分别记为C0 , C5 , C10 , C20 ,
C40 , C60 , C100), 小球藻异养生长动力学曲线如图 1所示.异养条件下 , 没有葡萄糖 , 小球
藻 A 540几乎不增加.而高浓度糖(>40 g·L-1)则抑制小球藻异养生长.说明葡萄糖是藻异养
生长的一种限制性基质.葡萄糖浓度≤40 g·L-1时 , 添加 5 、 10 、20 g·L-1葡萄糖的小球藻分
别在培养 24 , 32 , 56 h后进入生长平衡期.最终 , 添加 5 ～ 100g·L-1葡萄糖的小球藻 A540最
大净增长量分别为 8.65 、 17.35 、 27.48 、 29.83 、 26.81和 24.25.
图2 表明 , 以 5 ～ 20 g·L-1葡萄糖作 C 源 , 糖几乎全部被小球藻利用 , 而添加 40 ～
100 g·L-1葡萄糖的培养基中最终还含有一定量的糖 , 葡萄糖消耗量在 30.24 ～ 33.25 g·L-1
之间.说明在此培养条件下 , 小球藻最多只能利用糖 33.25 g·L-1.折算糖对 A 540的转化率 ,
分别为 173.0%、 173.5%、137.4%、91.6%、80.6%和 80.2%, 可知 , 添加 10 g·L-1葡萄糖
可获得最大的糖对细胞转化率.另外 , 考虑 A 540与培养时间等因素 , 以 10 g·L-1葡萄糖异养
培养小球藻最适宜.
2.2　分批培养最适 NO3-浓度的确定
在最适葡萄糖浓度下(10 g·L-1), 改变培养基中的 NO3-浓度(0.8 、 1.2 、 1.6 、 3.2 、
6.4 g·L-1 KNO3 , 分别记为 N8 、N12 、N16 、N32及 N64), 异养小球藻的生长曲线表明(如
82　 华 南 理 工 大 学 学 报 第 28 卷　
　　
图 3所示), 随NO3-浓度提高 , 小球藻生长加快 , 到 1.6 g·L-1KNO3 时生长最快 , 最终净增
长 A 540为 16.5 , 之后 , NO3-浓度增加 , 则小球藻生长减慢 , 且浓度越大 , 生长速率下降越
大.表明了 10 g·L-1糖条件下 , 1.6 g·L-1KNO3 为藻生长的最适浓度.各处理中 , 小球藻在
生长过程中 NO3-消耗量也不一样(如图 4所示), 添加 0.8 ～ 3.2 g·L-1KNO3的小球藻在 72
h内基本耗完NO3- , 而添加 6.4g·L-1KNO3 的还含有相当浓度的NO3-未被吸收.这说明小
球藻吸收 NO3-的量有一定范围.依据图 4 , 在 10 g·L-1糖浓度下 , 小球藻的最大 NO3-吸收
量在 1.5 g·L-1左右.
　第 2 期 刘世名等:生物反应器高密度异养培养小球藻 83　
2.3　葡萄糖与 NO3-的正交实验
为进一步证实上述单因子的效应 , 设计 C 、N源正交实验.实验所设处理如表 1标识.在
不同 C/N 值条件下 , 小球藻的异养生长速率不一样(如图 5所示).缺 C 源时 ,尽管提供 N
源 , 小球藻也几乎不增殖 ,但是吸收不同程度的 NO3-;缺 N 源但提供 C 源 , 小球藻虽生长
慢 , 但还可一定程度的增殖 , 并且利用一定量的葡萄糖.同时 , 相对于 10 、20 、40 g·L-1葡萄
糖 , 分别添加 1.6 、3.2及3.2 g·L-1KNO3 , 即 C/N值分别约为 45 、 45及90时 , 小球藻生长
最快 , 最大净增长 A 540分别为16.0 、26.7及 34.5.实验测得这三个处理最终只有C40N32还
剩葡萄糖 12.1 g·L-1 , 折算糖对 A 540的转化率分别为 1.60 、 1.34及 1.24.可知 , C10N16为
图 5　C/N 值对小球藻异养生长的影响
F ig.5　The eff ect of r atio of ca rbon to nitr ogen on the
heterotr ophic growth of Chlorella vulgaris
最好 C/N值 , 与单因子实验结果相符.
表 1　葡萄糖和 KNO3 的用量及其组合的标识
Table 1　The using amounts of glucose and KNO3
and the marks of their combina tions
KNO 3浓度/(g·L -1)
标　　识
01) 101) 201) 401)
0 C0N0 C 10N0 C20N0 C40N0
0.8 C0N8 C 10N8 C20N8 C40N8
1.6 C0N16 C 10N16 C20N16 C40N16
3.2 C0N32 C 10N32 C20N32 C40N32
6.4 C0N64 C 10N64 C20N64 C40N64
　1)为葡萄糖浓度 , 单位 g·L -1
2.4　流加培养中葡萄糖与 NO3-浓度的控制范围与补料液中最适C/N 值
微生物细胞生长一般包括延滞期 、对数生长期 、平衡期和衰亡期四个阶段.其中 , 对数
生长期生长速率快 , 基质消耗速率最快.所以 , 要维持对数生长期高的生长速率 , 必须满足
生长的最适营养需要.本实验将上述正交实验最好处理(C10N16)的藻生长速率及糖与 NO3-
消耗速率的结果绘制成曲线(如图 6所示), 探讨生长与营养基质消耗之间的关系 , 以确定维
持藻高生长速率的营养基质的最适浓度范围 , 并以摇瓶结果模拟推算反应器连续流加培养补
料液中最适C/N 值.
图 6表明藻生长速率在 24 ～ 36 h区段最大 , 即对数生长期.相应地 , 此段培养时间的糖
与 NO3-浓度范围为藻高速生长的糖与 NO3-适宜浓度范围;同时 , 说明 36 h 时应补加糖与
NO3
-以维持藻的高生长速率 , 且补料量应以糖和 NO3-浓度回复到 24 h的浓度为原则(分别
为 6.17 g·L-1和 0.44 g·L-1), 即糖与 NO3-的添加量分别为 3.72 g·L-1与 0.40 g·L-1 , C/
N 值为 41.2.
2.5　生物反应器连续流加分批培养
据上述实验结果配制最适培养基与补料液 , 用 5L 通风搅拌反应器连续流加分批培养小
球藻 , 设计总糖 60 g·L-1 , 添加 0.005%的泡敌消泡 , 同时添加 20 mg·L-1 IBA 和 1 mg·L-1
6-BA(此两种植物激素复合显著促进小球藻的异养生长 , 另文发表), 在 22.5 h , 糖浓度已
降至 2.12 g·L -1 , 开始补料 , 培养 65 h.结果如图7所示 , 59 h时 , 基本消耗完所配葡萄糖 ,
84　 华 南 理 工 大 学 学 报 第 28 卷　
A 540达 115.0 , 生物量为 34.1 g·L-1 , 糖转化率为 56.8%;不补料继续培养 6 h , A 540下降至
97.5 , 生物量降到 26.5 g·L-1.说明 , 因无糖缺营养 , 藻开始衰亡.
可见 , 生物反应器连续流加分批培养基本实现了藻的高密度培养.
图 7　生物反应器异养培养小球藻的生长曲线
F ig.7　The he terotr ophic growth for Chlorella
vulgaris in biore actor
3 讨 论
本实验结果表明 , 葡萄糖为小球藻异养生长的限制性营养基质.添加 5 、 10 、 20g·L-1葡
萄糖 , 小球藻分别在培养 24 h 、 32 h及 56 h 进入生长平衡期.主要原因是此三组处理中的葡
萄糖此时已消耗完 , 得消耗细胞本身的能量物质来维持细胞的代谢(如图 2所示).缺 C 源
时 , 尽管提供 N 源 , 小球藻也几乎不增殖 ,但是吸收不同程度的 NO3-;缺 N源时 , 如提供 C
源 , 小球藻虽生长慢 , 但还可一定程度的增殖 , 并且利用了一定量的葡萄糖(如图 3 、图 4所
示).其原因可能是接种时小球藻种中还含有少量的 N 源 , 小球藻生长需求的 C源量远远高
于 N源 , 少量的 N 源可维持小球藻一定时间的增殖.
据摇瓶实验结果进行反应器培养放大实验获得成功 , 但二者又有不同.如本实验 , 摇瓶
培养推算时 , 培养 36 h才应补料 , 而在反应器中培养 22.5 h 时糖浓度已降至补料水平.所
以 , 补料时间只能根据实际情况而定 , 但本实验结果证明营养基质浓度范围按摇瓶实验结果
控制是可行的.
本实验获得 34.1 g·L-1反应器高细胞密度 , 以此进行进一步放大培养试验研究 , 其应用
开发前景广阔.
参考文献:
[ 1] 　CHEN F.High cell density cultur e of m icroalgae in he terotr ophic growth [ J] .TIBTECH , 1996 , 14:
421-426.
[ 2] 　KYLE D.Production and use of lipids f rom microalgae [ J] .Lipid Technol , 1992 , 4(3):59-64.
[ 3] 　BOROWITZKA M A.Microalgae source of pharmaceutic als and other biologically active compounds
　第 2 期 刘世名等:生物反应器高密度异养培养小球藻 85　
[ J] .J of Appl Phyco , 1995 , 7:3-15.
[ 4] 　RUNNING J A , HUSS R J , OLSON P T.H eterotroph ic production of ascorbic acid by m icroalgae
[ J] .J of Appl Phyco , 1994 , 4:99-104.
[ 5] 　ENDO H , NAKAJIMA K , CHINO R , et al.Growth char acter istics and Chlorella regularis , het-
erotrophic f ast growing strain [ J] .Agr i Biol Chem , 1974 , 38(1):9-18.
[ 6] 　OH_HAMA T , MIYACHI S.Chlor ella.I n:BOROWITZKA M A , BOROWITZKA L J , eds.Micro_
algal biotechnology [ M] .London:Cambridge Universit y Press , 1988.13.
[ 7] 　黄伟坤等.二硝基水杨酸法测定还原糖 [ A] .食品检验与分析 [ M] .北京:轻工业出版社 , 1989.583
[ 8] 　曾北危.二磺酸酚比色法测定 NO3-[ A] .环境分析化学 [ M] .长沙:湖南人民出版社 , 1974.100-
102.
High Density Heterotrophic Culture of Chlorella
Vulgaris in Bioreactor
LIU Shi_ming1 , MENG Hai_hua 2 , LIANG Shi_zhong1 , YIN Jian_yun 2 , MAI Ping_zhen 2
(1.College of Food Engineer ing and Biote ch., South China Univ.of Tech., Guangzhou 510640 , Ch ina;
2.Guangdong Jiangmen Centr e for Biotech., Jiangmen 529081 , China)
Abstract:The appr opria te init ial concentrat ion , the beneficial concentrat ion of glucose
and KNO3 contr olled for the cont inuously fed_batch and the opt imum rat io of carbon to ni-
trogen in the complements were determined for the continuously fed_batch he terot rophic
culture of Chlorella vulgaris by using the flask_simula ted method.I t was indica ted that
10 g·L-1 glucose and 1.6 g·L-1 KNO3 should be added into the medium at the beginning.
Based on this finding , in the continuously fed_ba tch cul tur e , the concentrat ions of glucose
and NO3
-
should be controlled between the range fr om 2.45 g·L-1 to 6.17 g·L-1 and e-
qual to 0.44 g·L-1 or less than it respectively , the optimum r atio of car bon to ni trogen
should be 41.2.According to the above , Chlorel la vulgaris was cultured in 5L st irred_tank
fermenter with 60 g·L-1 glucose for 59 h and 34.1 g·L-1 biomass was achieved.The trans-
f ormat ion efficiency of biomass to glucose was 56.8%.Results showed a high density het-
er ot rophic culture of Chlorella vulgaris .
Key words:Chlorel la vulgaris ;high density;stir red_tank fermenter;heter ot rophic cul ture
86　 华 南 理 工 大 学 学 报 第 28 卷