全 文 ：1 引言
随着国内外对水体中污染化学物质研究的深入，
絮凝剂的水生态安全问题，尤其是有机絮凝剂对环境生
物和人体的危害得到极大关注，作为未来有机絮凝剂替
代品的微生物絮凝剂的环境安全问题亟待研究［1-3］。本
研究所筛选得到的一株高效絮凝剂产生菌，通过研究
该菌产生的絮凝剂MBFA9的生态安全性，展现了其
无毒无害的优越性和在水处理中的良好性能。
藻类作为水生生态系统的初级生产者，其种类的
多样性和初级生产量直接影响水生态系统的结构功
能，因而成为监测评价水环境质量的重要指标［4-5］。蛋
白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），单细胞绿藻，对
毒物敏感、个体小、繁殖快、培养简单，在较短时间内
可得到化学物质对其许多世代及种群水平的影响评
价，是一种常用的测试生物。因此，本实验选择蛋白核
小球藻作为受试生物，就絮凝剂MBFA9对其毒性效
应进行了研究，作为该絮凝剂的生态安全性能的评价。
2 材料与方法
2.1 实验材料
微生物絮凝剂产生菌 A9由东北大学环境工程
研究所微生物实验室保藏。
蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）购自中国
科学院武汉水生生物研究所。
2.2 培养基及培养条件
配制培养基，灭菌，接种絮凝剂产生菌，放入
30 ℃的恒温振荡培养箱，振荡速度 150 r/min，培养
基配方见表 1，培养 72 h后制得培养液。
2.3 微生物絮凝剂的提纯
培养液 12 000 r/min 离心 30 min 去除菌体，然
后浓缩、乙醇沉淀、氯仿正丁醇去除游离蛋白，抽滤
后真空干燥得到絮凝剂 MBFA9提纯品。
2.4 絮凝剂储备液制备
将制得的 MBFA9提纯品溶于水，浓度 1.0 g/L，
置于 4 ℃冰箱内，作为储备液备用。
2.5 实验步骤
参照“ISO 8692-2004水质——用单细胞绿藻类
MBFA9对蛋白核小球藻生长的影响研究
李键佳 1 邱雷 1 胡筱敏 2
（1.营口市环境保护科学研究所，辽宁营口 115003；2.东北大学，辽宁沈阳 110004）
摘 要：以蛋白核小球藻（ Chlorella pyrenoidosa）为实验生物，以生物量、叶绿素含量、可溶性蛋白含量及抗氧化酶活力的变
化为指标，研究了不同浓度的高效微生物絮凝剂 MBFA9 对蛋白核小球藻的毒性效应，结果表明：低浓度短时间内 MBFA9 可以抑
制蛋白核小球藻的生长，随着时间的延长，抑制作用减弱并最终消失；高浓度 MBFA9 最终可以轻微促进蛋白核小球藻生长，但
SOD 比活力和 POD 比活力稳定，表明未启动抗氧化酶系统和非酶抗性系统，对藻细胞不构成伤害。 初步证明，絮凝剂 MBFA9 无
急毒反应，是一种安全的、无毒的、对生态环境友好的微生物发酵制品。
关键词：环境毒理学；微生物絮凝剂；MBFA9；蛋白核小球藻
Abstract：This paper dealt with the studies on environmental toxicological characteristics of polysaccharide microbial flocculant by Chlorella
pyrenoidosa with the indicators of the biomass, chlorophyll content（Chl-a, Chl-b）, soluble protein content and antioxidant enzyme activity
（SOD, POD）.The results showed that: low concentrations of MBFA9 could inhibit the growth of Chlorella pyrenoidosa at the very start, but the
inhibiting effects weaken with time and disappear eventually; high concentrations of MBFA9 could promote the growth of Chlorella pyrenoidosa
slightly. Meanwhile , the activities of superoxide dismutase（SOD）and peroxidase（POD）keep stable. It showed that the antioxidase system and
the nonenzyme-resistance system were not started, and the algal cells were not injured. It was primarily testified that MBFA9 was a safe, non-
toxic, eco-friendlymicrobial fermentation product.
Key words：environmental toxicology; microbial flocculant;MBFA9;Chlorella pyrenoidosa
中图分类号：X703.5 文献标识码：A 文章编号：1674－1021（2009）09-0068-03
收稿日期：2009－06－16；修订日期：2009-09-04。
作者简介：李键佳，男，1983年生，工程师，主要从事环境影响评价及环境工程工作。
表 1 MBFA9培养基组分
药品
玉米淀粉
K2HPO4
MgSO4·7H2O
含量/（%）
1.50
0.60
0.02
药品
NaCl
酵母膏
pH
含量
0.01%
0.30%
8.0
68 环境保护与循环经济
C
hl
-a
/（
m
g·
L-
1 ）
0 h 24h ▲ 48h
72h 72h 120h
MBFA9浓度/（mg·L-1）
0 20 40 60 80 100
5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
图 3 MBFA9对蛋白核小球藻叶绿素-a含量的影响
进行的淡水藻类生长抑制性试验”［6］，实验步骤如下：
将 5 mL蛋白核小球藻原液接种到 70 mLSE培养基
中，温度 25±2℃，光强 3 500 Lux，光暗比 12 h∶12 h（L/
D），通气强度 0.5L/min，通气与光照同步。预培养 3代，
镜检细胞正常，进入对数生长期时加入测试絮凝剂。然
后每 24h测定藻液的吸光度（OD680）和叶绿素含量，96 h
时测定藻液的可溶性蛋白含量和抗氧化酶活力。
2.6 实验方法
蛋白核小球藻生物量以藻液 680 nm处的吸光
度表征；叶绿素含量采用分光光度法测定；可溶性蛋
白含量采用考马斯亮蓝 G-250染色法测定；超氧化
物歧化酶（SOD）活力采用氮蓝四唑光化学还原反应
法；过氧化物酶（POD）活力采用愈创木酚法。
藻类生长的抑制率计算公式：
抑制率=1- Ntn-Nt0Ncn-Nc0
×100%
式中，Ntn为处理组第 n次测定时藻液吸光度；Nt0为
处理组初次测定时藻液吸光度；Ncn为对照组第 n次
测定时藻液吸光度；Nc0为对照组初次测定时藻液吸
光度。
在本实验中取对照组和处理组的吸光度相等；
如果处理组的吸光度小于初始的吸光度，认为抑制
率为 100%；如果处理组的吸光度大于对照组的吸光
度，则抑制率为负值，表示刺激藻类生长百分率。
3 结果与讨论
3.1 藻细胞密度与吸光度之间的相关性
在不同藻细胞密度下，通过显微镜下血球计数
板计数的藻细胞密度 C（M个 cell/mL）和藻液的吸光
度 OD680之间表现出良好的线性关系。为了测定和计
算的方便，用藻液的吸光度来表征藻细胞的生物量。
3.2MBFA9对蛋白核小球藻生长的影响
不同时间各浓度 MBFA9对蛋白核小球藻生长
的影响如图 1。
不同时间各浓度 MBFA9对蛋白核小球藻的抑
制率见图2。
由图 1、图 2可以看出，24 h处 MBFA9低浓度
（0.02 ~0.6 mg/L）对蛋白核小球藻生长有一些抑制作
用，最高抑制率为 25%；高浓度（0.6 ~100 mg/L）对蛋
白核小球藻生长有促进作用，最高促进生长率为
87.5%。48 h以后，低浓度 MBFA9（0.02～0.6 mg/L）对
蛋白核小球藻的生长影响不明显，抑制率和促进生
长率大多在 10％以内，高浓度（0.6 ~100 mg/L）对蛋
白核小球藻生长有促进作用，4.64 mg/L 48 h的促进
生长率最大为 82.57%，随着时间的增加，促进生长
率逐步降低，120 h实验结束时，促进生长率稳定在
13％左右。
MBFA9对蛋白核小球落叶绿素-a含量的影响
见图3。
MBFA9对蛋白核小球藻叶绿素-b的含量的影
响见图4。
0 20 40 60 80 100
40
20
0
-20
-40
-60
-80
-100
24h ▲48h 72h
96h 120h
抑
制
率
/（
%
）
MBFA9浓度/（mg·L-1）
图 2 不同时间各浓度 MBFA9对蛋白核小球藻的抑制率
0 20 40 60 80 100
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
吸
光
度
/O
D
68
0
MBFA9浓度/（mg·L-1）
图 1 不同时间各浓度 MBFA9对蛋白核小球藻生长的影响
0h 24h ▲ 48h
72h 72h 120h
69
C
hl
-a
/（
m
g·
L-
1 ）
0 h 24h ▲ 48h
72h 72h 120h
MBFA9浓度/（mg·L-1）
0 20 40 60 80 100
2.5
2
1.5
1
0.5
0
图 4 MBFA9对蛋白核小球藻叶绿素-b含量的影响
MBFA9对蛋白核小球可溶性蛋白含量影响见
图 5。
MBFA9对蛋白核小球藻 SOD，POD活力影响见
图 6。
随着对数生长期的结束，各浓度测试藻液的吸
光度稳定在 1.43~1.66之间。由图 1、图 3和图 4可以
看出，叶绿素-a含量与叶绿素-b含量随着蛋白和小
球藻的生长稳步增长，叶绿素含量变化曲线与生长曲
线基本一致，充分说明藻类叶绿素是估算其生物量
的良好指标。计算可得，Chla/Chlb比值在 1.7~2.0之
间，表明蛋白核小球藻叶绿素的合成正常。
由图 5、图6可以看出，96 h时，随着 MBFA9浓
度的增加，蛋白核小球藻培养液的可溶性蛋白含量
有所增加，当 MBFA9 浓度为 100 mg/L 时，可溶性
蛋白含量达到最大值，是对照的 112.6%。SOD是需
氧生物体内普遍存在的一种重要的超氧阴离子自
由基清除剂，SOD 活力稳定在 5.0 unit 左右。POD
是植物代谢的末端氧化酶之一，POD 活力稳定在
2.3 unit左右。
3.3MBFA9影响蛋白核小球藻机理分析
MBFA9主要由糖醛酸、中性糖和氨基糖组成，
絮凝性能极佳。低浓度 MBFA9使蛋白核小球藻部分
凝聚，局部范围内形成藻密度过大，抑制了藻类的生
长。随着时间的增加，MBFA9降解，对藻细胞束缚减
小，降解的小分子产物有可能被藻类吸收，刺激其生
长。MBFA9对蛋白核小球藻的叶绿素合成和蛋白质
含量的影响与生物量的影响一致，并未启动体内的
抗氧化酶系统和非酶抗性系统，说明 MBFA9对藻细
胞未构成伤害。
4 结论
（1）通过对蛋白核小球藻的急性毒性试验，初
步证明：絮凝剂 MBFA9无急毒反应，是一种安全的、
无毒的微生物发酵制品，对生态环境友好，证实了前
人从理论上对微生物絮凝剂无毒无害的推断。
（2）新型安全的微生物絮凝剂应尽快替代已
暴露了众所周知的对人体及生态循环有毒性作用
的无机及有机化学絮凝剂，尤其是在给水处理上
的应用。
参考文献
［1］国家环境保护总局污染控制司. 中国环境污染控制对策
［M］.北京：中国环境科学出版社，2006.
［2］中华人民共和国国务院.国家中长期科学和技术发展规划
纲要（2006—2020年）［R］.2005.
［3］联合国环境规划署.环境署国际生物技术安全准则［S］.1996.
［4］国家环境保护局.化学品测试准则［M］.北京：化学工业出
版社，1990.
［5］AWWA.Researchneedsforalumsludgedischarge［J］.Journal
AmericanWaterWorkAssociation，1978，79（6）：199.
［6］International Standards Organization. ISO 8692-2004 Water
quality-Freshwateralgalgrowthinhibition testwith unicellular
greenalgae［S］.2004.
图 5 MBFA9对蛋白核小球可溶性蛋白含量的影响
可
溶
性
蛋
白
含
量
/（
m
g·
L-
1 ）
0 20 40 60 80 100
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
MBFA9浓度/（mg·L-1）
图 6 MBFA9对蛋白核小球藻 SOD，POD活力影响
超
氧
化
物
酶
活
力
/u
ni
t
0 20 40 60 80 100
8
7
6
5
4
3
2
1
0
MBFA9浓度/（mg·L-1）
SOD POD
70 环境保护与循环经济