全 文 ：第 44卷第 3期 中南大学学报(自然科学版) Vol.44 No.3
2013年 3月 Journal of Central South University (Science and Technology) Mar. 2013

耐高温小球藻紫外诱变育种及其耐高温性质研究

夏金兰 1, 2，宁进军 1，陈程浩 1，万民熙 1，聂珍媛 1, 2

(1. 中南大学 资源加工与生物工程学院 湖南 长沙，410083；
2. 中南大学 生物冶金教育部重点实验室，湖南 长沙，410083)

摘要：从内蒙古筛选得到 1株淡水小球藻 Chlorella sorokiniana CS-01，采用原生质体−紫外线诱变技术，以 55 ℃
高温培养为选择压力，得到 1株能在该温度下存活的突变藻株，该突变藻株能够适应利用烟道气 CO2培养造成的
高温环境。突变藻株适应的温度范围更广(15~55 ℃)，生长周期缩短，生物质产量增加；当通入装机容量为 500 MW
的火力发电厂烟道气，其生长周期较 Chlorella sorokiniana CS-01缩短 2 d，油脂质量分数提高 20%。传代培养 5
代，生长情形相同，具有较好的遗传稳定性；该藻株具有火电厂、冶金厂、水泥厂等高排放工业位点固定烟道气
CO2的应用价值，生物质经油脂提取和转酯反应可用于制取生物柴油。
关键词：紫外诱变；小球藻；耐高温性；生物柴油；烟道气
中图分类号：Q939.97 文献标志码：A 文章编号：1672−7207(2013)03−0867−07

UV mutagenesis breeding for high temperature
resisting Chlorella and its properties of thermotolerance

XIA Jinlan1, 2, NING Jinjun1, CHEN Chenghao1, WAN Minxi1, NIE Zhenyuan1, 2

(1. School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha 410083, China;
2. Key Laboratory of Biometallurgy of Ministry of Education, Central South University, Changsha 410083, China)

Abstract: A fresh water microalga named Chlorella sorokiniana CS-01 which was isolated from Inner Mongol was
mutated by UV mutagenesis of protoplasts and screened at high culture temperature (55 ℃), the mutated microalga can
withstand high temperature caused by the flue gas. It has a wider growth temperature (15−55 ℃) and shorter life cycle,
and a higher biomass yield. Pumping into a simulative 500 MW thermal power plant flue gas at 38 ℃, its life cycle is
shortened by 2 d and the oil content was raised by 20%. This mutated microalga has good stability of heredity, and it has
considerable commercial value for fixing CO2 of flue gases from high CO2 emission sites, e.g. thermo-power plants,
metallurgical plants and cement plants. The biomass by oil-extraction and esterification can be used to produce biodiesel.
Key words: UV mutagenesis; Chloreela sorokiniana; thermotolerance; biodiesel; flue gas


生物柴油是替代化石燃料最有潜力的清洁能源，
能有效减少化石燃料造成的温室气体排放[1−2]，是应对
全球能源危机的有效手段[3]。作为第三代生物能源，
微藻生物柴油在许多方面具有和化石燃料相当的优良
特性，其粘度、密度、闪点、浊点、流动点和铜条腐
蚀测试结果 6 项指标全部符合 E N 1 4 2 14 以及
ASTM6571 标准[4]。微藻的养殖范围很广，甚至能在
污水和盐湖中生长[5]，不与农作物争夺有限耕地[6]。微
藻生物柴油的制取过程分为养殖、采收、油脂提取和
转酯反应，由于生产成本过高，目前被认为尚无法大
范围工业应用[7]。为了解决这个难题，研究者试图将
微藻生物柴油技术与市政污水处理[8]、厌氧消化制取

收稿日期：2012−03−01；修回日期：2012−05−21
基金项目：国家自然科学基金资助项目(50621063)；湖南省研究生创新学位论文资助项目(2010ssxt246)；中南大学创新教育资助项目(2010bsxt05，
CL11029，CL11038)
通信作者：夏金兰(1964−)，男，湖南株洲人，博士，教授，从事微藻生物能源和矿物生物提取研究；电话：0731-88836944；E-mail: jlxia@csu.edu.cn
中南大学学报(自然科学版) 第 44卷 868

沼气[9]、烟道气 CO2固定耦联，从而增加这项技术的
经济可行性。火力发电厂、水泥厂、冶金厂烟道气中
含有大量的 CO2气体，直接排放会导致严重的温室效
应。哥本哈根会议严格规定了各国承担的减排义务。
《清洁发展机制(CDM)的实施与管理》规定了项目级
的碳减排量抵消额的转让与获得，企业参与碳减排，
可以获得实实在在的经济收益。利用烟道气中的高浓
度CO2培养微藻，能够显著提高微藻细胞的生长速度、
细胞浓度和油脂含量[7−8]，从而降低微藻生物柴油的成
本。烟道气含有硫氧化物、氮氧化物、粉尘及高热，
这些因素使微藻细胞的生长受到抑制。能耐受一定的
高温环境的微藻藻株，对生物柴油的制取以及烟道气
CO2 的固定是至关重要的。紫外诱变技术以其简便快
捷和效果显著，备受诱变育种研究者的青睐。配合原
生质体诱变技术[10]，增加了细胞对辐射的敏感程度，
使紫外诱变的效果更佳。近年来利用紫外诱变这一经
典手段对微藻改性的研究很多，如降低对 O2 的敏感
度[11]、增大对 CO2 的耐受性[12]、获得耐高温性质[13]
等。本研究从内蒙古筛选得到的 1 株淡水小球藻
Chlorella sorokiniana CS-01[14]为出发藻株，采用原生
质体−紫外线诱变技术，高温(55 ℃)环境培养为选择
压力，获得 1株在该温度下存活的突变藻株。通入模
拟的 500 MW火电厂烟道气培养，评价该突变的藻株
的工业应用价值。

1 材料和方法

1.1 材料
1.1.1 菌种和培养基
淡水小球藻 Chlorella sorokiniana CS-01(专利号
200910252395.3)，为本实验室自行筛选得到的藻株，
该藻株的特点是能高效利用高浓度CO2[15]。采用BG11
作为培养基。
1.1.2 微藻细胞壁破除复合酶溶液
微藻细胞壁破除复合酶溶液中含 2%(质量分数，
下同)纤维素酶，0.5%半纤维素酶，1.5%离析酶，0.6
mol/L渗透压调节剂，pH=6.0。
1.1.3 实验仪器
SPX-250B-G 微电脑光照培养箱，Sunrise Remote/
Touch Screen 酶标仪，紫外定时诱变仪，Beckman
avanti j-E 离心机。
1.2 实验方法
1.2.1 培养方法
将培养基单个成分按照 1 000倍浓度配成工作母
液，分开存储。培养时，按 1 mL/L添加母液至蒸馏水
中，高压灭菌；其中 CaCl2和 A5土壤营养液分开灭菌，
并在超净工作台中添加，以免高温环境使 A5土壤营养
液成分失活，钙离子沉淀。取对数生长期的微藻，接
种量为 6.5×105 个/mL，温度为 25 ℃，通气量为 0.05
(kPa·m3)/h，光照强度为 5 000 lx，光暗比为 14:10，置
于光照培养箱培养。
1.2.2 细胞浓度测定
每天取样，样品添加至 96孔酶标板，用分光光度
计，700 nm波长下测量光密度(OD)值。每次测 OD值
之前，先测空白标板的吸光值，相减得到样品的吸光
度。利用血球计数板对已知 OD值的样品计数，建立
细胞浓度对 OD 值的函数关系，为 Y=(5.159X+
0.008 4)×107个/mL，其中(Y为细胞浓度，X为 OD值，
相关系数 R2=0.999 2)。
1.2.3 紫外诱变育种
小球藻细胞外包被了一层厚厚的细胞壁，对紫外
线有很强的阻碍作用。利用复合酶溶液去除细胞壁后
的原生质体[16]，对紫外线辐射更为敏感。实验方法见
文献[16]。
将制好的原生质体平铺于灭菌的培养皿，迅速放
入紫外定时诱变仪，15 W紫外灯，30 cm，分别设置
0，1，2，4，6，8，10，15，20，30 min辐照时间，
3个平行组。藻液放置黑箱过夜后，稀释至合适浓度，
涂平板，计算致死率。选择合适的诱变时间，对
Chlorella sorokiniana CS-01进行诱变。紫外处理之前
去除细胞壁。经紫外处理的原生质体黑箱过夜后，细
胞壁再生，涂平板，置于光照培养箱培养，温度为 55
℃，光照强度为 5 000 lx，光暗比为 14:10。
1.2.4 突变藻株的耐高温性质研究
将在高温环境下存活的突变藻株，转接和扩大培
养(5 L光反应器，光照强度为 5 000 lx，通气量为 0.05
(kPa·m3)/h，接种量为 6.2×105个/mL)。分别设置 15，
25，35，45和 55 ℃，3个平行实验组。在相同的条件
下，以出发藻株为对照组，研究该突变藻株在不同温
度下的生长速率、生物量以及油脂含量的变化情况。
按已优化的 Bligh-Dyer法测定微藻的总脂含量[17]。
1.2.5 通入模拟火电厂烟道气扩大培养
扩大培养突变藻株，5 L 光反应器，接种量为
6.3×105个/mL，温度为 38 ℃，光暗比为 10:14，光照
强度为 5 000 lx，通气量为 0.05 (kPa·m3)/h(将装机容量
500 MW的火力发电厂烟道气的模拟气体，通入突变
藻株的培养液中)。由于烟道气中的硫氧化物会造成酸
雨，危害很大，因此，烟道气排放之前都有除硫工序。
第 3期 夏金兰，等：耐高温小球藻紫外诱变育种及其耐高温性质研究 869
模拟气体成分不含 SO2。
1.2.6 突变藻株的遗传稳定性研究
活化突变藻株，取第二代为M1，连续传代 5次，
保持每一代培养条件(5 L光反应器，接种量为6.3×105
个/mL，温度为 40 ℃，光暗比为 10:14，光照强度 5 000
lx，通气量为 0.05 (kPa·m3)/h)相同，每日测定细胞浓
度，绘制藻株的生长曲线。

2 结果与讨论

2.1 诱变条件的确定
去除细胞壁的微藻原生质体，对紫外线非常敏感，
处理 5 min时超过 50%细胞死亡，15 min时致死率达
到 100%。紫外线诱变育种方法对于有细胞壁包被的
细胞难以奏效的原因是细胞壁降低了细胞对辐射的敏
感度，尽管该方法简单易行，却效果不佳。紫外诱变
育种研究中，多选择致死率 99%以上的诱变剂量，以
便减小筛选的工作量，同时确保较大的突变率，但是，
存在诱变剂量过高、菌体死亡的问题。本研究由于采
用的筛选压力十分有效，不需要花费大量时间进行筛
选，因此，可以使用相对较小的剂量来进行诱变，处
理 8 min，致死率为 81%左右，能保证辐射剂量足够，
引起突变数量较多。


图 1 不同剂量紫外线对小球藻 Chlorella sorokiniana CS-01
的致死情况
Fig.1 Lethality of Chlorella sorokiniana CS-01 under
different dosages of UV

2.2 突变藻株细胞形态的变化
经纤维素复合酶溶液破壁后的小球藻细胞，由紫
外线处理 8 min后，在黑箱过夜，细胞壁再生。通过
显微镜观察，耐高温的小球藻突变藻株，细胞形态较
出发藻株 Chlorella sorokiniana CS-01，并未发生改变。
紫外线辐射改变了藻细胞的 DNA，造成酶的改变，激
活了与耐受高温相关的酶的合成与表达，但是并未引
起细胞形态的改变。


(a) 出发藻；(b) 突变藻
图 2 出发藻株和突变藻株在显微镜下的细胞形态
Fig.2 Cell morphologies of Chlorella sorokiniana CS-01 and
mutated alga under microscope

2.3 突变藻株耐受高温的性质
Chlorella sorokiniana CS-01是从内蒙古选育得到
的 1 株淡水小球藻，生长速度快，油脂质量分数为
18%，特别是该藻株能够耐受高浓度 CO2，具有应用
于工业烟道气固定 CO2的潜力。该藻株为常温养殖，
最适生长温度为 25~30 ℃，超过 40 ℃时基本上不能
生长。工业烟道气含高热，而为了缩短改造工序，对
烟道的改造一般不设置专门的冷却装置，从而会引起
微藻养殖池的温度大幅度提高。有人利用烟道气进行
温水水产养殖[18]，高温实际上会让生长活动加速，生
产周期降低。
经诱变处理的微藻细胞，放置于 55 ℃环境下培
养，得到 1株存活的藻株。经过扩大培养后平板再次
纯化。以出发藻株为对照，研究不同温度下藻株的生
长曲线、生物质产量和油脂含量，结果如图 3所示。
从图 3可看出：低温培养时，二者的生长都很缓慢，
细胞浓度低；高温培养时，突变藻株的优势越发明显：
中南大学学报(自然科学版) 第 44卷 870
35 ℃是突变藻株较合适的培养温度，稳定期的细胞浓
度达到 2.08×108个/mL，而对照组的小球藻生长情况
已经接近低温(15 ℃)培养时的状态，细胞浓度很低。
图 3(f)所示为 40 ℃之后的情形，对照组的原始小球藻
已经没有生长迹象，培养液发白，而突变藻株在 40 ℃
时仍然具有相当高的生长活性，进一步表明该突变藻
株在 30~40 ℃范围内生长都很旺盛；高于 40 ℃时，
生长受到抑制，但在 55 ℃仍能维持基本生长。这在淡
水小球藻中是非常罕见的。温水养殖技术，利用的是
废热，水温设置一般为 18~34 ℃[19]。火电厂烟道气将
导致温度更大幅度提升，会达到 40 ℃左右，在开放池
培养体系中，一般不超过 45 ℃。突变的小球藻藻株耐
高温的性质基本能满足烟道气温水养殖的需求。
生物质产量也有相同的规律。图 4描述了出发藻
株和突变藻株在不同温度培养下 5 L藻液的生物质产
量，比较了突变藻株和原始的藻株的稳定期藻粉湿质


培养温度/℃：(a) 15；(b) 20；(c) 25；(d) 30；(e) 35；(f) 40~55
图 3 不同温度培养下出发藻株和突变藻株的生长曲线
Fig.3 Growth curves of Chlorella sorokiniana CS-01 and mutated alga cultured at different temperatures
第 3期 夏金兰，等：耐高温小球藻紫外诱变育种及其耐高温性质研究 871



(a) 出发藻株；(b) 突变藻株
图 4 不同温度培养出发藻株和突变藻株的生物质产量
Fig.4 Biomass yields of Chlorella sorokiniana CS-01 and
mutated alga cultured at different temperatures

量和干质量。从图 4可见：在 25 ℃左右，二者的产量
基本一致，这再次证明了突变藻株在低温时与原始藻
株的一致性。超过 30 ℃时，出发的原始藻株的生物质
产量开始略微下降，与此不同的是，突变株的生物质
产量大幅度增加，这正是由于 2种细胞对高温不同的
耐受性。突变株由于能抵抗高温对细胞的抑制，与新
陈代谢相关的酶在 30~35 ℃下活性更高，生命活动更
加旺盛，在同样的时间内，累积的生物质相应更多。
从图 4还可计算出：经 4 000 r/min离心的湿藻中水的
质量分数约为 60%。
表 1 所示为突变藻株与原始出发藻株的油脂含量
对比。经过紫外辐射作用之后，突变藻株的油脂含量
略微降低，可能是旺盛的生长与脂质累积是相冲突的。
值得注意的是，突变藻株的平均油脂质量分数为 25%，
在淡水小球藻中属于中上水平，加之它相当高的生长
速度以及生物质产量，其最终的油脂产量仍然是很高。
这对于工业应用十分重要。
表 1 出发藻株(A)和突变藻株(B)不同温度培养下油脂含量
(质量分数)
Table 1 Oil content of Chlorella sorokiniana CS-01(A) and
mutated alga(B) cultured at different temperatures %
温度/℃ A B
15 30.20 —
20 22.40 —
25 27.20 25.10
30 32.00 —
35 28.80 26.00
45 — 22.90
55 — 30.80

2.4 突变藻株的遗传稳定性
由于获得突变株经过几次传代之后，优良性状难
以继续维持，出现退化，因此，在评价一个突变体性
质时，其遗传稳定性是一个必须要考察的指标。图 5
所示为突变株连续接种 5代，在 38 ℃、其他培养条件
均严格保持一致的条件下，各代的生长情况。图中标
识为 M1的实际为该突变株的第 3代。由于经过了多
次转接和平板活化，此时藻株的生长活力是最强的。
在该温度下，各代的生长都很旺盛，很好地继承了耐
高温的性质；生长情形相似，细胞浓度很大，呈现墨
绿色。稳定期细胞浓度高达 1.3×108/mL。


图 5 突变藻株的遗传稳定性
Fig.5 Genetic stability of mutated alga

2.5 模拟烟道气扩大培养
参照湖南长沙附近的火电厂(华电集团长沙电
厂)，模拟烟道气企业装机容量为 500 MW，烟气中除
了不含有硫氧化物(工厂均有除硫装置，烟气中含硫量
很小)，其余气体成分按比例混合配制。
中南大学学报(自然科学版) 第 44卷 872
表 2 装机容量 500 MW的火力发电厂烟道气成分
Table 2 Flue gas components of 500 MW thermal
power plant
气体成分 体积分数/%
CO2 13
O2 6.6
N2 80
SO2 0.35
NO 0.03
NO2 0.03

将烟气通入培养微藻的开放池，势必造成水温过
高。用温控型光照培养箱直接设置 38 ℃，通入模拟气
体培养，结果见图 6。图 6表明：模拟气体的通入头 3
d，微藻细胞处于适应过程，细胞无增殖现象；第 4
天进入对数期后，第 7天就达到生长顶峰，细胞浓度
达 1.3×108/mL。烟道气中高浓度的 CO2气体有效地
促进了藻细胞的生长，生长周期缩短 2 d。


图 6 通入模拟烟道气培养突变藻株的生长曲线
Fig.6 Growth curve of the mutated alga cultured under
pumping of simulated flue gas

5 L藻液离心收集后冷冻干燥，得到 4.4 g干藻粉，
提取得到 1.8 g油脂，油脂质量分数达 40.7%，与出发
藻株油脂质量分数相比提高近 1倍。高浓度的 CO2显
然对突变藻株的生长、油脂累积同样起到了积极的作
用。生长周期缩短对工业生产意义重大，这能大幅度
消减成本。油脂含量的提高同样可以增加单位油脂产
量。只要生产成本降低到可接受的程度，这项最有前
景的清洁能源计划将能付诸实施。
本研究将瞄准工业烟道气 CO2固定，以获得耐高
温藻株为目标。若期望获得油脂含量高的突变藻株，
只需在本研究的基础上，对筛选环节进行改进即可。
在原生质体−紫外诱变处理之后，结合尼罗红细胞染
色技术，用荧光显微镜观测，细胞内的油脂成分与尼
罗红染料特异结合，产物能激发荧光，荧光强度能线
性表征油脂含量。尼罗红染色解决了评价藻细胞油脂
含量的技术难题，适合大量多批次的重复性研究。

3 结论

(1) 本研究采用原生质体−紫外线诱变技术进行
育种，效果良好，细胞壁的去除极大增大了细胞对紫
外辐射的敏感程度。
(2) 获得 1 株遗传稳定的耐高温的淡水小球藻，
并且在较高温度有较好的生理生化表现，适合作为烟
道气 CO2 固定以及微藻生物柴油生产的工业应用
藻种。
(3) 模拟 500 MW火电厂烟道气成分扩大培养该
突变藻株，对烟道气中有毒成分适应之后，高浓度 CO2
使生长周期缩短 2 d，油脂含量提高近 1倍。突变藻株
获得耐高温的性质的同时，未丢失原始藻株对高浓度
CO2的耐受能力。
(4) 该突变微藻对烟道气 CO2的固定效率有待进
一步进行研究，这对于工业应用是至关重要的。

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(编辑 何运斌)