全 文 ：西北植物学报 , 2004, 24( 1): 65— 69
Acta Bot . Boreal .-Occident. Sin.
文章编号: 1000-4025( 2004) 01-0065-05
植物激素 IBA与 6-BA对摇瓶分批流加异养
培养小球藻的生长及化学组成的影响
刘世名1 ,陈靠山 1 ,梁世中 2
( 1山东大学 生命科学学院 ,济南 250100; 2华南理工大学 食品与生物工程学院 ,广州 510640)
摘　要: 研究了植物激素 IBA与 6-BA对摇瓶分批流加异养培养小球藻的生长及化学组成的影响 . 结果表明 , IBA
与 6-BA处理摇瓶分批流加异养培养的小球藻 ,促进了小球藻的生长 ,提高了小球藻的生物量 ( 15. 0% )与对糖转化
率 ( 14. 8% ) ,同时也提高了小球藻的蛋白质含量 ( 16. 3% ) . 氨基酸分析结果表明 , IBA与 6-BA能提高摇瓶分批流
加异养培养的小球藻的 α-氨基酸含量 (含量达 31. 2% ,而对照的仅 26. 0% ) ,增加必需氨基酸的含量及比例 ,尤其
两种重要α-氨基酸 Arg和 Lys的含量分别提高达 22. 9%和 30. 1% ,强化了异养小球藻的营养价值 . IBA与 6-BA
能提高摇瓶分批流加异养培养的小球藻叶绿素及类胡萝卜素含量 . 培养工艺研究与化学组成分析将为植物激素应
用于小球藻的异养培养奠定基础 .
关键词: 小球藻 ; IBA; 6-BA;分批流加异养培养 ;化学组成
中图分类号: Q943. 1　　　文献标识码: A
Effects of plant hormones, IBA and 6-BA, on flask fedbatch
heterotrophic culture and constituents of Chlorella vulgaris
LIU Shi-ming
1
, CHEN Kao-shan
1
, L IAN G Shi-zhong
2
( 1 School of Life Science, Shandong University, Jinan 250100, China; 2 College of Food and Biotech nology, Sou th China Universi-
ty of Tech nology, Guangzhou 510640, China)
Abstract: The ef fects of plant ho rmones, IBA and 6-BA, on the flask fed-batch heterot rophic culture and
the consti tuents of Chlorella vulgaris were researched in this paper. The obtained results indicated that
w ith the treatments o f IBA and 6-BA, th e g row th of flask fed-ba tch hetero trophic cultured Chlorella vul-
garis was promo ted, the biomass and the g lucose-transferring rate increased by 15. 0% and 14. 8% respec-
tiv ely, the pro tein contents could be enhanced by 16. 3% . Furthermo re, i t can be concluded from the resul ts
o f amino acid analy ses that IBA and 6-BA could increase the contents of to talα-amino acids in f lask fed-
batch heterot rophic cul tured Chlorel la vulgaris , w hich got to 31. 2% contra st to that o f the contro l of
26. 0% . With the treatments of IBA and 6-BA, the contents of essence amino acids in f lask fed-batch het-
ero trophic culturedChlorella vulgaris and i ts ratio in the to talα-amino acids could be increased, especially,
the contents of two kinds of impo rtant amino acids, arginine and lysine could increase by 22. 9% and
30. 1% respectiv ely , so the nutrient va lue o f Chlorel la vulgaris was enhanced. On the o ther hand, IBA and
6-BA could incra se the contents o f chlorophylls and carotenoid in flask fed-batch hetero t rophic cultured
Chlorella vulgaris. Bo th the culture techno logy resea rches and the consti tuent analyses wi ll lay a foundation
收稿日期: 2002-09-06;修改稿收到日期: 2003-09-30
基金项目:广东省科技厅重点项目 ;山东省优秀中青年科学家奖励基金项目 ;山东大学青年教师基金项目资助
作者简介:刘世名 ( 1970- ) ,男 ,博士 ,副教授 .
fo r the application of plant ho rmones in the heterot rophic culture o f Chlorella vulgaris.
Key words: Chlorel la vulgaris; IBA; 6-BA; fed-ba tch heterot rophic cul ture; consti tuents
　　小球藻 (Chlorel la vulgaris )中蛋白质、氨基酸
含量高 ,是一种良好的单细胞蛋白源 ,同时 ,还是多
种贵重化学试剂和药物的来源 [ 1～ 4] ,在多个领域得
到了广泛应用 .小球藻是 3种已产业化的微藻之一 ,
主要是以开敞池光自养系统和密闭光生物反应器系
统来生产 [ 4～ 7] ,生物量低 ,加上小球藻是一种单细胞
绿藻 ,直径仅 3～ 12μm,分离成本非常高 ,且受光限
制等 ,严重制约着小球藻的供应 . 近年来 ,发展了异
养培养系统 ,不受光限制 ,培养周期短 ,细胞密度大
幅度提高 ,且已实现生物反应器的高密度培
养 [8～ 12 ] ,给小球藻的广泛应用带来了好的前景 .
植物激素 IBA和 6-BA能促进摇瓶批次培养的
异养小球藻的生长 [ 10] ,能否在采取流加操作方式 ,
中间补料 ,实现高密度培养的异养培养小球藻工艺
中同样表现促进效应有待研究 .
小球藻经异养转化 ,其组成会发生较大变
化 [13～ 15 ] . 对自养小球藻的化学组成已有报道 [16, 17 ] ,
但异养小球藻的化学组成还未见报道 .为此 ,本研究
在对前文 [12 ]报道补充原则的基础上 ,延续前文 [10 ]的
工作 ,用摇瓶模拟生物反应器对异养小球藻进行分
批流加培养 ,探讨 IBA与 6-BA处理异养小球藻的
效应 ,并分析小球藻的化学组成变化 ,主要包括影响
小球藻产品质量的几个重要指标 ,如蛋白质、氨基
酸、叶绿素及类胡萝卜素等的含量 ,为植物激素在小
球藻异养培养中得到广泛应用提供依据 .
1　材料与方法
1. 1　小球藻种及其培养
　　小球藻 (Chlorella vulgaris )种由香港大学陈峰
博士惠赠 . 培养基按文献 [18]所示 A培养基 . 250
m L三角瓶装培养液 100 mL, 121℃灭菌 30 min,无
菌超净工作台上接种 ,于 30℃、 140 r /min暗中培
养 . IBA和 6-BA(生化试剂 ,均为中国科学院上海生
化研究所东风生化技术公司产品 )的用量分别为
20. 0 mg /L和 1. 0 mg /L.
1. 2　小球藻生物量的测定
用 721分光光度计测定 .以藻液在 540 nm处的
光密度 A540值表示小球藻的细胞密度 .培养结束 ,藻
液经离心后用蒸馏水冲洗再离心 ,重复 3次 ,将藻泥
于烘箱中烘至恒重 ( 60℃ ) ,称重得生物量 .
1. 3　小球藻总蛋白质含量的测定
用半微量凯氏定氮法 [19 ]测定 .
1. 4　培养基质中葡萄糖含量的测定
藻液经 4 000 g离心 10 min,取上清液 ,参照
3, 5-二硝基水杨酸比色法 [20 ]测定 .
1. 5　培养基质中 NO-3 含量的测定
藻液经 4 000 g离心 10 min,取上清液 ,参照浓
H2 SO4-水杨酸法 [21 ]测定 .
1. 6　氨基酸含量测定
精确称一定量的小球藻藻粉 ,加 6 mol /L HCl
(含 1%的苯酚 )水解 24 h(温度 105℃ )后蒸干 ,用异
硫氰酸苯酯衍生 ,用美国 Wasters高效液相色谱仪
的 PICO. T AG氨基酸分析柱层析 ,在 38℃ , 254 nm
处检测氨基酸含量 ,流速为 1 mL /min.
1. 7　叶绿素及类胡萝卜素含量测定
叶绿素及类胡萝卜素含量的测定分别按文献
[2 ]和文献 [23]方法进行 .
2　结果与分析
2. 1　 IBA与 6-BA对摇瓶分批流加异养培养小球
藻生长的影响
设计培养时间 72 h,在前文 [12 ]报道的补料原则
基础上 ,本实验分别在 24、 36、 45及 58 h各补料 1
次 (每次藻液增加 4. 0 g /L葡萄糖及 1. 0 g /L
KNO3 ) . 摇瓶分批流加异养培养小球藻的生长及基
质含量变化曲线如图 1所示 .结果表明 ,在 24～ 45 h
区段 ,小球藻处在对数生长期 ,此后小球藻生长开始
减缓 , IBA与 6-BA促进了异养小球藻的生长 ,后期
更加明显 ,至 72 h时 , A540净增长 40. 5,而对照为
35. 4,净增长率为 14. 4% . 另外 ,相对对照 , IBA与
6-BA抑制了培养前中期异养小球藻对葡萄糖的吸
收 ,但加速了培养后期葡萄糖的吸收 ,最终 ,对照与
处理均基本消耗完所添加的 26. 0 g /L葡萄糖 ;同
时 , IBA与 6-BA促进了异养小球藻对 NO-3 的吸
收 , NO-3 总添加量为 3. 44 g /L,最后 ,处理的仅剩
余 0. 49 g /L,而对照的剩余 0. 84 g /L, NO-3 利用量
提高 13. 5% .在培养前中期 ,相对对照 , IBA与 6-BA
处理抑制了葡萄糖的吸收 ,但小球藻的生长还是加
快 ,其原因主要是 IBA与 6-BA提高了小球藻对葡
萄糖的利用率所致 . 用 IBA与 6-BA处理异养小球
藻 ,摇瓶分批流加培养小球藻的生长及基质含量变
66 西　北　植　物　学　报 24卷
化趋势与摇瓶批次培养的 [10 ]类似 .
图 1　 IBA和 6-BA对摇瓶分批流加异养
培养小球藻生长的影响
Fig. 1　 Effec ts o f IBA and 6-BA on g row th o f fla sk
fed-ba tch hete ro trophic Chlorella vulgaris
培养结束 ,分离出小球藻 ,烘干称重 ,得生物量 ,
并检测其蛋白质含量 . 结果 (图 2)表明 , IBA与 6-
BA处理提高了异养小球藻的生物量 ,也提高了其
蛋白质含量 ,小球藻的生物量与蛋白质含量分别为
12. 88 g /L和 43. 7% ,提高率分别为 15. 0%与
16. 3% . 结合培养过程中葡萄糖的消耗量 (均为 26.
0 g /L) ,折算对糖转化率分别为 49. 5% ( IBA与 6-
BA处理 )及 43. 1% (对照 ) . 可见 , IBA与 6-BA处
理提高了小球藻对糖的转化率 ( 14. 8% ) .
图 2　 IBA和 6-BA对摇瓶分批流加异养培养
小球藻生物量及蛋白质含量的影响
Fig. 2　 Effects o f IBA and 6-BA on biomass and
pro tein contents o f fla sk fed-batch
he tero trophic Chlorella vulgaris
2. 2　 IBA与 6-BA对摇瓶分批流加异养培养小球
藻的氨基酸组成的影响
小球藻是一种良好的单细胞蛋白源 ,蛋白质含
量高 ,同时 ,氨基酸丰富 ,全面、均衡 ,且必需氨基酸
( EAA)比例高 [16, 17 ] . 氨基酸的含量与组成是决定小
球藻产品质量的一个重要指标 . 分析实验所得摇瓶
分批流加异养培养小球藻 α-氨基酸组成的结果如
表 1所示 .
　 表 1　 IBA和 6-BA对摇瓶分批流加异养培养小球藻氨基酸组成的影响
Table 1　 Effec ts o f IBA and 6-BA on amino acid constituents in flask fed-batch h etero trophic Chlorella vul garis*
( mg /100 g干 C. vulgaris)
氨基酸
Amino acids
CK IBA+ 6-BA
氨基酸
Amino acids
CK IBA+ 6-BA
Asp 2208. 24 2300. 55 Val 1572. 21 1858. 36
Glu 3557. 25 4311. 12 Met 560. 04 680. 65
Ser 1426. 38 1794. 57 Cys 21. 22 15. 25
Gly 1603. 49 1982. 52 Ile 995. 00 1204. 10
His 876. 81 986. 52 Leu 2016. 77 2490. 55
Arg 1639. 43 2015. 27 Ph e 1505. 44 1826. 13
Th r 1344. 42 1587. 04 Lys 1732. 03 2254. 48
Ala 2034. 98 2359. 93 总氨基酸量 26029. 52 31187. 50
Pro 1964. 24 2266. 63 EAA量 9725. 91 11901. 31
Tyr 971. 56 1253. 85 EAA比例 (% ) 37. 40 38. 20
　　* Trp未测 , Asn与 Gln分别包含在 Asp与 Glu中 .
* Trp was not measu red and Asn and Gln w ere includ ed in Asp and Glu respectiv ely.
　　由表 1可知: ( 1)对照及 IBA与 6-BA处理的小
球藻的总α-氨基酸含量都较高 ,分别为 26. 0%和
31. 2% (处理的提高率为 20. 0% ) ,α-氨基酸含量全
面 ,较均衡 ; ( 2)除 Cys比对照低外 , IBA与 6-BA处
理的小球藻的其它氨基酸含量均比对照高 ; ( 3)对照
及 IBA与 6-BA处理的小球藻的 EAA含量都较
高 ,分别为 9. 7%和 11. 9% ,虽然处理的总α-氨基酸
含量提高 ,但其 EAA占总 α-氨基酸的比例为
38. 2% ,比对照的高 (对照为 37. 4% ) ,强化了小球
藻的氨基酸营养价值 ; ( 4)处理的 Arg和 Lys含量
671期 刘世名 ,等 :植物激素 IBA与 6-BA对摇瓶分批流加异养培养小球藻的生长及化学组成的影响
比对照的提高 ,其含量分别为 2. 02%和 2. 25% ,而
对照的分别为 1. 64%和 1. 73% ,提高率分别达
22. 9% 和 30. 1% , Ly s为人体八种必需氨基酸之
一 ,而 Arg也是鱼类必需氨基酸之一 ; ( 5)结合处理
和对照的总蛋白质含量 (图 2,分别为 43. 7%及
37. 6% ) ,折算 α-氨基酸占总蛋白质的比例分别为
71. 4%及 69. 1% ,占的比例都较大 ,α-氨基酸即是蛋
白质氨基酸 ,又是蛋白质的组成成分 . 总之 ,异养小
球藻的氨基酸含量丰富 ,必需氨基酸含量高 ,经 IBA
与 6-BA处理的小球藻的营养价值进一步得到了强
化 .
2. 3　 IBA与 6-BA对摇瓶分批流加异养培养小球
藻的叶绿素与类胡萝卜素含量影响
小球藻属于单细胞绿藻 ,结构简单 ,但有一杯状
叶绿体 ,含有叶绿素 ( chlorophylls )及类胡萝卜素
( caro tenoid)等 ,外观上异养小球藻与自养的无差
异 ,都现绿色 .叶绿素及类胡萝卜素等的含量与比例
很大程度上决定了小球藻产品的外观 ,叶绿素含量
高比例大 ,小球藻更绿 .本实验测定了实验所获摇瓶
分批流加异养培养小球藻的叶绿素与类胡萝卜素含
量 . 结果 (表 2)表明 ,经 IBA与 6-BA处理的小球藻
的叶绿素 a, b含量均比对照的显著增加 ,总叶绿素
含量提高 21. 4% . 处理的类胡萝卜素含量也比对照
高 ,且增幅更大 ( 33. 6% ) . 可见 , IBA与 6-BA处理
异养小球藻 ,大大提高了小球藻的色素含量 ,培养的
小球藻更绿 ,并符合绿藻产品标准 [24 ] .
表 2　 IBA和 6-BA对摇瓶分批流加异养培养小球藻叶绿素及类胡萝卜素含量的影响
Table 2　 Effects of IBA and 6-BA on quantities of chlo rophy lls and
ca ro tenoid in fla sk fed-batch hetero tr ophic Chlorella vulgaris
叶绿素 Ch lorophyll s( mg /k g)
叶绿素 a
Ch lorophyl l a
叶绿素 b
Chlo roph yll b
总叶绿素
Total ch lorophyl ls
类胡萝卜素
Caro tenoid
(m g /kg)
CK 2994. 0 789. 0 3783. 0 2081. 011
IBA+ 6-BA 3609. 0 985. 0 4594. 0 2780. 787
3　讨　论
本实验在前文 [12 ]补料原则的基础上 ,采用分批
流加操作方式 ,用摇瓶培养异养小球藻 ,延续前
文 [10 ]的工作 ,探讨了植物激素 IBA与 6-BA对摇瓶
分批流加培养的异养小球藻生长的影响 .结果表明 ,
IBA与 6-BA同样促进了摇瓶分批流加培养的异养
小球藻的生长 ,与前文 [10 ]报道的批次培养结果相
符 ,提高了异养小球藻的生物量及对糖转化率 ,也提
高了小球藻的蛋白质含量 . IBA与 6-BA处理小球
藻 ,小球藻对培养基质 (葡萄糖和 NO-3 )含量变化的
影响也与批次培养的基本一致 , IBA与 6-BA抑制
了培养前中期摇瓶分批流加异养培养小球藻对葡萄
糖的吸收 ,而加速了培养后期葡萄糖的吸收 ,同时 ,
IBA与 6-BA促进了异养小球藻对 NO-3 的吸收 .在
培养前中期 ,相对对照 , IBA与 6-BA处理抑制了葡
萄糖的吸收 ,但小球藻的生长还是加快 ,其原因主要
是 IBA与 6-BA提高了小球藻对葡萄糖的利用率所
致 .说明 ,植物激素 IBA与 6-BA同样可应用于异养
小球藻的摇瓶分批流加培养 ,但其作用机制有待进
一步研究 .
成分分析结果表明 ,用 IBA与 6-BA处理的小
球藻 ,与对照相比 ,除了蛋白质含量存在差别外 ,氨
基酸组成和叶绿素与类胡萝卜素的含量也发生了变
化 . IBA与 6-BA处理的小球藻叶绿素与类胡萝卜
素含量均得到了提高 ,小球藻颜色更深 . IBA与 6-
BA处理更丰富了异养小球藻的氨基酸总量及必需
氨基酸含量与比例 ,强化了异养小球藻的营养价值 .
异养小球藻的蛋白质、氨基酸等成分都较丰富 ,放大
培养工艺基本成熟 ,必将推动异养小球藻的研究与
应用 .
参考文献:
[1 ]　 KYLE D. Production and use of lipids f rom microalgae[ J] . Lip id . Technol . , 1992, 4( 3): 59- 64.
[2 ]　 RUNNING J A, HU SS R J, OSLSON P T. Hetero trophic production of as corbic acid b y microalgae[ J ]. J . Appl . Phycol . , 1994, 4( 2): 99-
104.
[3 ]　 BOROWIT ZKA M A. Microalgae sou rce of ph armaceu ticals and oth er biologically activ e com pounds [ J ]. J . Appl . Phycol . , 1995, 7( 1): 3-
15.
[4 ]　 CHENG F. High cell densi ty cul ture of microalgae in h eterot rophic grow th [ J]. Trend s in B iotechnol , 1996, 14( 3): 421- 426.
68 西　北　植　物　学　报 24卷
[5 ]　 M AYO A W, NOIKE T. Effect s of glucose loading on the g row th behavior of Chlorrela vulga ris and h etero trophic bacteria in mixed cul-
tu re[ J] . Water Res. , 1994, 28(5) : 1 001- 1 008.
[6 ]　 M AYO A W. Effect s of tem perat re and pH on the kinetic g row th of u nialga Chlorrela vulga ris cul tu res con taining bacteria [ J]. Wa ter En-
viron. Res. , 1997, 69( 1): 64- 72.
[7 ]　 LI SHW(李师翁 ) , LI H Q(李虎乾 ) . Studies on th e large scale culture of Ch lorella pyrenoidosa in a tub ular pho tobioreactor [ J ]. Chin . J.
B iotech. (生物工程学报 ) , 1997, 13( 1): 93- 97 ( in Chines e) .
[8 ]　 ENDO H, N AK JIM A K, CHINO R, SHIROT A M. Grow th characteris ti cs and Chlor rela regularis , heterot roph ic fas t g row ing s t rain [ J ].
Agr . Biol .Chem. , 1974, 38( 1): 9- 18.
[ 9 ]　 LIU SH M (刘世名 ) , CHEN F, LIAN G SH ZH(梁世中 ) . Res earch es on the heterot rophic cul tu re of Ch lorel la vulgri s- optimization of
carbon sources , ni t rog en sou rces , inoculum size and ini tial pH[ J] . J. South Ch ina Univ. of Tech. (华南理工大学学报 ) , 1999, 27( 4): 111-
115( in Chinese) .
[10 ]　 L IU SHM(刘世名 ) , LIAN G SH ZH(梁世中 ) . Role of plan t h ormones in h eterot rophic cul tu re of Chlorella vulgari s [ J] .Chin. Bot . Bul l.
(植物学通报 ) , 1999, 16( 6): 696- 700; 690( in Chin es e) .
[11 ]　 LIU SH M(刘世名 ) , LIANG SH ZH(梁世中 ) . Ef fects of lanthanum on heterot roph ic culture and chlorophyll conten t of Ch lorella vul-
garis [ J]. Chin. Rare. Earth s. (稀土 ) , 1999, 20( 3): 51- 54( in Chinese) .
[12 ]　 LIU SH M(刘世名 ) , LIANG SH ZH(梁世中 ) . High cell densi ty h eterot rophic cul tu re of Chlorel la vulgaris w ith bioreactor [ J] . J . South
China Univ .of Tech . (华南理工大学学报 ) , 2000, 28( 2): 81- 86( in Chin es e) .
[13 ]　W U Q Y(吴庆余 ) , KUANG M(匡　梅 ) , Grant N G. Dif ference of g row th, energet ic ch arg es and pig men ts b etw een tw o Chlorel la lines
in photoau tot rophic and heterot rophic cultures [ J] . Acta Phytophysiol . S in. (植物生理学报 ) , 1992, 18( 3): 293- 299( in Chinese) .
[14 ]　 WU Q Y (吴庆余 ) . Cell ul t ras t ructure and relating chemical cons ti tu ents of autoph oto trophic Chlorel la af ter t rans ferring into h et-
erot rophic g row th [ J ]. J . Nanj in g Univ. (南京大学学报 ) , 1993, 29( 2): 275- 278( in Chines e) .
[ 15 ]　 WU Q Y(吴庆余 ) , SHENG G Y(盛国英 ) , FU J M (傅家谟 ) . Comparis on of lipophi lic compounds betw een photoau tot rophic and h et-
erot rophic Chlorel la [ J] . Acta B otany Sin . (植物学报 ) , 1993, 35( 11): 849- 858( in Chines e) .
[16 ]　 LI SH W(李师翁 ) , LI H Q (李虎乾 ) . Res earch es on nut ri ti on and toxici ty of dried Chlorel la pow der [ J] . Chin . Food Sci . (食品科学 ) ,
1997, 18( 7): 48- 51( in Chines e) .
[17 ]　 CAO J X(曹吉祥 ) , LI D SH(李德尚 ) , WANG J Q(王金秋 ) . Studies of nut ri ti onal cons ti tuents of ten kind s of no rmal plankton algae
[ J] . J. Zhongshan Un iv. (中山大学学报 ) , 1997, 36( 2): 22- 27( in Chinese) .
[18 ]　 OH-HAM A T, M IY ACHI S.Chlorella [ A] . Borowi t zka M A, Borowi t zka L J, et al. Micoalgal biotech nology [ C] . London: Cambridge U-
niversi ty Press , 1988: 13.
[19 ]　天津轻工业学院 ,大连轻工业学院 ,无锡轻工业学院合编 .工业发酵分析 [M ].北京:轻工业出版社 , 1991: 29- 31.
[20 ]　黄伟坤编著 .食品检验与分析 [M ] .北京:轻工业出版社 , 1989: 583.
[ 21 ]　 HECHT U, MO HR H. Factors cont rolling ni t rate and ammonium accumulat ion in mu stard ( Sinpis alba ) seedlings [ J] . Physiol . Plant ,
1990, 78( 3): 379- 387.
[22 ]　江苏农学院植物生理教研组编 .植物生理生化实验 [M ] .江苏扬州:江苏农学院 , 1989: 38- 40.
[23 ]　 YANG A G(杨爱光 ) , ZHANG L Y(张利亚 ) . M easu rement of cartenoid in foods [ J ]. Chin . Food Sci . (食品科学 ) , 1982, 3( 11): 18- 25
( in Chinese) .
[24 ]　中国台湾食用绿藻标准 [ S ]. CNS N5134.
691期 刘世名 ,等 :植物激素 IBA与 6-BA对摇瓶分批流加异养培养小球藻的生长及化学组成的影响