全 文 ：小球藻细胞活性物质的提取及对啤酒酵母的生理效应＊
胡开辉＊＊　周山勇
(福建农林大学生命科学学院 , 福州 350002)
Extraction of active substance from Chlorella vulgaris cells and its physiological effects on Saccharomyces cere-
visiae.HU Kaihui , ZHOU Shanyong(School of Li fe Sciences , Fujian Agriculture and Forestry University ,
Fuzhou 350002 , China).-Chin.J.Appl.Ecol., 2005 , 16(8):1573～ 1576.
The study showed that freezing- thawing method could have a higher cellwall breakage rate , and a light injury to
the active substance , w hich could no t only increase the cell fission and grow th , delay the death of Saccharomycete
cells , but also enhance CO 2 production rate and quicken fermenta tion pro cess w hen the cells were exposed to the
medium w ith 0.5% active substance.
Key words　Chlorella vulgaris , Active substance , Extraction , S accharomycete , Physiological effects.
文章编号　1001-9332(2005)08-1573-04　中图分类号　TS262　文献标识码　A
＊国家自然科学基金项目(30471028 、30200170)和福建省教育厅资
助项目(K04042).
＊＊通讯联系人.
2004-08-16收稿 , 2004-12-15接受.
1　引　　言
小球藻(Chlorella vulgaris)为绿藻门普生性单细胞藻
类 ,因其具有极为丰富均衡的营养成分 , 常作为医疗保健
品[ 3 , 5 , 28] , 或用于食品 、轻工业以及饲料添加剂 , 并可用于重
金属的生物吸附[ 7 , 13 , 16 , 21 , 23] 、污水处理[ 10 , 20 , 24] 及环境评
价[ 17 ～ 19 , 27 , 29] 等方面.小球藻生长因子(Chlorella G row th
Factor , CGF)又称小球藻精 , 为其细胞活性物质 , 含有氨基
酸 、核酸 、多糖 、多肽 、蛋白质 、酶 、维生素 、矿物质等成分[ 3] ,
被誉为“类荷尔蒙” [ 11] .国外对其医疗功能有较多的研究 , 其
药理作用主要有激活淋巴细胞 、增强人体免疫能力 、活化人
体细胞 、加快儿童生长发育 、抵抗外来疾病入侵和促进人体
受伤组织修复等.CGF对有机物 、重金属中毒具有迅速康复
作用 , 还能防治胃溃疡 、高血压和心血管等疾病[ 2 , 12] .近来 ,
小球藻生长因子提取技术及其生理活性研究成为英 、美 、日
等国家和我国台湾地区的研究热点[ 4 , 26 , 30] .本文在比较几种
小球藻破壁方法的基础上 , 研究其活性提取物对啤酒酵母
(Saccharomycete cerev isiae)的生理效应 , 以期为今后将其应
用于酵母工业 、提高酵母菌产率 、缩短生产周期及降低生产
成本等提供理论依据.
2　材料与方法
2.1　材料
以粉核小球藻(Chlorella vulgaris)(福建莆田神州生物
公司提供)、啤酒酵母(Saccharomycete cerevisiae)(本校微生
物实验室保存)为供试材料.粉核小球藻培养基为 NH4Cl
0.475 g , KH2PO 4 0.136 g , CaCl2 0.02 g , EDTA 0.001 g ,Mg-
SO4 0.024 g , Na2CO3 0.002 g , 加水至 1 000 ml , 调 pH7.0 ,
121 ℃高压灭菌 30 min.啤酒酵母采用麦芽汁培养基:称取
500 g麦芽粉 , 加水至 2 000 ml ,于水浴锅内 65 ℃糖化 2 h ,
双层纱布过滤 ,滤液煮沸 30 min , 4 层纱布过滤 , 用糖度计测
定外观浓度为 12 Bx , 分装 , 121 ℃湿热灭菌 30 min 备用.崩
解液:NaCl 0.9 g , Na2HPO 4·2H2O 2.61 g , 柠檬酸·H2O 0.36
g , 加水至 100 ml , 121 ℃高压灭菌 30 min.
2.2　小球藻细胞活性物质的提取
2.2.1 纯种培养与收集　按 1∶10 接种小球藻 , 28 ℃光照培
养 1 周 , 长至浓绿 , 无菌条件下取 500 ml摇匀 , 离心 10 min
(4 000 r·min-1),弃上清液 , 沉淀用无菌水离心洗涤 3 次 , 得
纯净无菌藻泥.
2.2.2 破壁方法　1)机械匀浆破壁法:用无菌水将无菌藻泥
稀释 , 使小球藻的密度达到 1 010 CFU·ml-1 , 无菌条件下用
高速组织捣碎机匀浆30 s(12 000 r·min-1), 3 次重复 ,取样 ,
显微镜下用血球计数板计数 , 统计完整细胞数;2)机械研磨
破壁法:将无菌藻泥在研钵中加少量石英砂研磨 30 min;3)
超声波破壁法:用超声波破碎仪进行处理;4)冻融破壁法:
用崩解液将无菌藻泥稀释 ,将样品置 4 ℃冰箱预冻 2 h , 再置
-22 ℃冰箱冷冻过夜 , 次日取出 , 加水融化 , 融化至一半时
剧烈振摇 30 min , 再放回-22 ℃冰箱冷冻过夜 ,重复 12 次.
2.2.3 细胞活性物质的提取　将破壁后的小球藻转移至无
菌离心管中 , 8 000 r·min-1离心 15 min ,上清液移至无菌透
析袋透析除盐 , 得细胞活性物质浓缩液.用 1 ml无菌注射器
以 0.5 ml·支-1分装至 2 ml安培瓶中 , 冷冻干燥无菌封口 ,
得细胞活性物质冻干品(图 1).
2.3　啤酒酵母生长测定
2.3.1 泡沫变化　取 7 支装有 9 ml麦芽汁培养基的试管 , 每
支分别接种 1 ml 啤酒酵母菌液 , 按 2.0%、1.0%、0.5%、
0.25%、0.1%、0.05%加入细胞活性物质冻干品 , 摇匀 , 28
℃恒温箱培养 48 h , 观察泡沫高度变化 , 3 次重复.
应 用 生 态 学 报　2005 年 8 月　第 16 卷　第 8 期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY , Aug.2005 , 16(8)∶1572 ～ 1576
DOI :10.13287/j.1001-9332.2005.0199
图 1　小球藻活性物质冻干品
Fig.1 Products of act ive substance f rom Ch lorella v ulgarisby freezing-
d ry method.
2.3.2 CO2 失重测定　取 6 瓶装有 100 ml麦芽汁培养基的
三角瓶 , 每瓶分别接种 1 ml啤酒酵母菌液 , 取 1 瓶作为对
照 ,另 5 瓶分别加入细胞活性物质 1、0.5、0.25 、0.1 和 0.05
g ,摇匀 , 28 ℃恒温箱培养 ,每 6 h 称重一次 , 直至恒重 , 3 次
重复.
2.3.3 菌体量测定　取 3 支装有 9 ml麦芽汁培养基的试管 ,
每支分别接种 1 ml啤酒酵母菌液 ,取 1 支作为对照 , 另 2 支
分别加入 0.1 和 0.05 g的细胞活性物质冻干品 , 摇匀 , 28 ℃
恒温箱培养 ,于 24 和 48 h 取样计数 , 3 次重复.
2.3.4 酵母菌死亡率测定　取 3 支装有 9 ml麦芽汁培养基
的试管 , 每支分别接种 1 ml啤酒酵母菌液 , 取 1 支作为对
照 ,另 2 支分别加入 0.1 和 0.05 g 的细胞活性物质冻干品 ,
摇匀 , 28 ℃恒温箱培养.发酵 7 d 后 , 置 4 ℃冰箱保存 , 于
30 、60 和 90 d 取样制片(加次甲基蓝染色), 并用血球计数板
统计染色酵母菌数 ,计算酵母死亡率 , 3 次重复.啤酒酵母菌
死亡率=染色酵母菌数/总菌数×100%.
2.3.5 比生长率计算　 U =(lnN t
2
-lnN t
1
)/(t 2- t 1)
2.4　数据处理
实验数据采用 SPSS 软件分析和处理[ 6 , 14 , 22] .
3　结果与分析
3.1　不同破壁方法的效果比较
小球藻体积小 ,细胞壁坚固 , 破壁较难, 破壁成为提取活
性成分的关键.从表 1 可以看出 , 超声波法、冻融法与机械匀
浆法 、机械研磨法相比差异达到极显著水平 ,机械匀浆法与机
械研磨法差异不显著.可见 ,以冻融法破壁效果最佳(图 2).
表 1　不同小球藻破壁方法的效果
Table 1 Effect of di ffferent methods to break cell wall
方法
Methods
匀浆法
Homogenate
研磨法
Grinding
超声波法
Ult rasonic
w ave
冻融法
Froze-
thaw ing
破壁率(%)
Broken rates
11A 6A 30B 90C
破壁率=(细胞总数-完整细胞数)/细胞总数×100% Broken rates=
(Total number of cell-complete cell number)/ total number of cell×100%;
表中数据为 3次平均值 Data in the table w ere the average values of three
replicat ions;不同字母表示差异显著(P<0.01)Different let ters represent
significantly dif ferent at 0.01 level.下同 The same below.
图 2　冻融法的破壁效果
Fig.2 Effect of f roze-thaw ing method on C.v ulgaris celll w all.
3.2　细胞活性物质对发酵过程酵母菌数的影响
从表 2 可以看出 , 不同浓度小球藻活性物质对酵母的生
长具有显著影响 , 其比生长速率明显高于对照.在培养基中
添加 0.5%的提取物 , 发酵 24 h 后啤酒酵母菌数是对照的
1.8 倍 , 48 h 后是对照的 6.8 倍.说明细胞活性物质具有提
高酵母菌细胞分裂速度和促进生长的作用(图 3).
图 3　细胞活性提取物对酵母生长的影响
Fig.3 Effect s of adding active substance f rom C.vulgari s on the grow th
of S .cerevisiae.
表 2　细胞活性物质对发酵过程啤酒酵母菌数的影响
Table 2 Effect of active substance from cel ls on the amount of
S.cerevisiae in fermentation process
项目
T reatments
比生长速率
Specific grow th rate
(u·d-1)
0～ 24 h 24～ 48 h
细胞数
Numbers
(105CFU·ml-1)
0 h 24 h 48 h
CK 2.23 2.78 0.12 1.12 18
0.25% 2.44 4.21 0.12 1.38 93
0.5% 2.72 4.22 0.12 1.83 125
3.3　细胞活性物质对啤酒酵母发酵过程中产生泡沫的影响
从图 4 和图 5 可以看出 , 细胞活性物质具有促进啤酒酵
母的发酵 、提高啤酒酵母产气量的作用 , 且泡沫高度随活性
物质添加量的增加而增加.当添加量达到 0.5%以上时 , 增
加量趋于平缓.
3.4　细胞活性物质对啤酒酵母发酵过程中 CO 2 失重影响
由图 6 可见 , 在加入细胞活性物质的培养基中 , 啤酒酵
母发酵产生的 CO2 与对照不同 , 并且随着添加量的增加 ,
CO 2失重增加.当添加量达到 0.5%以上时 , 失重增加量趋
于平缓 , 表明适量的小球藻活性提取物有利于提高酵母对糖
类物质的利用和产酒精能力.
1574 应　用　生　态　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　16卷
图 4　细胞活性物质对啤酒酵母发酵过程中产生泡沫的影响
Fig.4 Effect of active substance f rom C.vu lgaris on foamy height in
the fermentation process of S .cerevisiae.
图 5　泡沫高度与细胞活性物质添加量的关系
Fig.5 Relat ionship betw een foamy heigh t and active substance dosage.
图 6　啤酒酵母发酵过程中 CO2 失重与细胞活性物质添加量的关系
Fig.6 Relationship betw een the loss of CO 2 and act ive substance dosage
in the fermentation process of S.cerevisiae.
3.5　细胞活性物质对啤酒酵母菌死亡率的影响
从表 3 可以看出,加入 0.25%和 0.5%的细胞活性物质冻
干品 ,酵母菌30 d 后的死亡率分别比对照减少34%和 50%, 60
d 后分别比对照减少 20%和34%, 90 d 后分别比对照减少 13%
和27%,表明小球藻活性提取物能延长该酵母的保存期.
表 3　细胞活性物质对啤酒酵母菌死亡率的影响
Table 3 Effect of active substance from cells on the moral ity rate of
S.cerevisiae
处理
Treatments
酵母菌死亡率
Moralit y rate of S.cerevisiae(%)
30 d 60 d 90 d
CK 21 30 45
0.25% 14 24 39
0.5% 10 21 33
4　讨　　论
目前 , 小球藻的破壁提取主要采用机械匀浆法 、机械研
磨法 、超声波法 、酶解法以及酸碱浸提法等.酶解法效果较
好 ,但成本较高 ,难以在生产上推广应用.机械匀浆法 、机械
研磨法 、超声波法等由于小球藻的细胞壁为坚固的纤维素 ,
且体积微小 , 破壁率低 , 不能充分利用.酸碱浸提法产率较
高 ,但活性物质易被破坏.通过对小球藻几种破壁方法的比
较发现 ,细胞冻融法破壁率较高 , 且能最大程度地保持小球
藻活性成分的活性 , 活性物质损伤少 ,提取工艺简单.冻融法
破壁率高的主要原因可能是反复冻融小球藻使其细胞壁结
为冰晶 , 而后又解冻 ,连续处理多次使小球藻细胞壁被拉伤 ,
通透性增加 , 细胞较易破裂[ 15 , 25] .
小球藻细胞活性物质含有氨基酸 、多糖 、蛋白质 、维生素
等功能成分 , 具有活化细胞 , 促进细胞生长和分裂作
用[ 1 , 8 , 9 , 25 , 31] .对小球藻细胞活性物质对啤酒酵母生理效应
的研究表明 , 小球藻细胞活性物质可显著增加啤酒酵母发酵
过程中的酵母菌数 , 促进啤酒酵母的生长和繁殖 ,加速酵母
发酵进程 , 增加酵母发酵的泡沫高度 、产气量 , 缩短酵母菌发
酵的延滞期 , 快速启动发酵 ,提前到达产气高峰.同时 , 小球
藻提取物能提高酵母发酵过程抗杂菌能力 , 且细胞活性物质
可以使酵母菌的降糖更彻底 、糖的利用率更高.此外 ,添加小
球藻细胞活性物质还可延缓酵母菌的死亡时间 , 在酵母工
业 、酿酒工业生产上具有良好的应用前景.今后还需进一步
对小球藻活性成分进行分离鉴定 , 并深入探讨其活性成分对
酵母菌的生理效应及其作用机理.
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作者简介　胡开辉 , 男 , 1962 年生 ,副教授.主要从事微生物
生态和食用真菌的教学与科研工作 , 发表论文 8 篇.E-mail:
hukh62@sohu.com
1576 应　用　生　态　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　16卷