全 文 ：第 30 卷 第 6 期 海 洋 环 境 科 学 Vol ． 3 0 ，No ． 6
2 0 1 1 年 1 2 月 MARINE ENVIRONMENTAL SCIENCE December 2 0 1 1
固定化小球藻的制备及对 N、P吸收的影响
袁 冰1，孙利芹1，侯士昌2，葛婷婷2，王敬红2，王长海1
(1．烟台大学 海洋学院，山东 烟台 264005;2．烟台大学 文经学院，山东 烟台 264005)
摘 要:采用固定化细胞包埋技术制备固定化小球藻。考察了包埋材料、接种游离藻与固定化试剂的配比(v /v)、固定化小
球的直径、机械强度等因素对固定化小球藻去除人工模拟废水中 N、P的能力的影响;并采用正交试验优化固定化条件。结
果表明最佳固定化条件为接种游离藻与固定化试剂的配比为 1∶ 3，固定化小球直径 1． 0 mm，海藻酸钠含量为 3%，聚乙烯醇
含量为 6%。此时，优化条件下固定化小球藻对废水中 N 的去除率为 93． 41%，比游离藻高出 11． 17%;对 P 的去除率为
95． 98%，比游离藻高出 14． 68%。
关键词:小球藻;固定化;去除
中图分类号:Q331 文献标识码:A 文章编号:1007-6336(2011)06-0804-05
Preparation of immobilized Chlorella and impact on N and P uptake
YUAN Bing1，SUN Li-qin1，HOU Shi-chang2，GE Ting-ting2，WANG Jing-hong2，WANG Chang-hai1
(1． Ocean School of Yantai University，Yantai 264005，China;2． Wenjing College of Yantai University，Yantai 264005，China)
Abstract:The cell embedding technique was used to immobilize Chlorella pyrenoidosa Chick． The factors of embedding material，in-
oculation amount of free algae，diameter of ball and the mechanical strength of immobilized C． pyrenoidosa Chick was studied in order
to investigate the impact of removing nitrogen and phosphorus from the artificial wastewater by immobilized C． pyrenoidosa Chick． The
immobilized conditions were optimized by the orthogonal experiment． The results showed that the best conditions for immobilization
were free algae inoculation and fixed ratio 1∶ 3 of reagents，the immobilized diameter 1． 0 mm，the content of 3% sodium alginate，
polyvinyl alcohol content of 6% ． With the optimum conditions，nitrogen removal from wastewater was 93． 41%，which was 11． 17%
higher than free algae;phosphorus removal rate was 95． 98% and 14． 68% higher than free algae．
Key words:Chlorella pyrenoidosa Chick;immobilized;removal
生物细胞固定化技术是指利用物理和化学手段将游
离细胞定位于限定的空间区域并使其保持活性和可以反
复使用的一种基础技术［1］。其中微藻的固定化技术在环
境领域主要应用于生物监测和废水处理，其主要特点是
藻细胞密度高、反应速度快、运行稳定可靠等［2，3］。固定
化微藻细胞净化污水的研究始于上世纪 80 年代，目前国
内外已经有较多这方面的研究，如仵小南等［4］对固定化
后微藻的生活状况进行了研究，Chevalier 等［5］对固定化
微藻处理市政污水进行了研究，Tam 等［6］对普通小球藻
在悬浮态和固定态下对模拟生活污水的净化效果进行了
初步的研究。随着我国海水养殖业的迅猛发展，沿海育
苗场及养殖场废水排放量与日俱增，近海水域环境严重
恶化，而养殖废水中含有的大量 N、P，是近海海域富营养
化的主要元凶。由于微藻细胞能够吸收养殖废水中富含
的 N、P用于细胞生长，达到净化水质的目的，同时能为水
产养殖业提供活鲜饵料，因此利用微藻固定化技术对高
氮磷养殖废水的处理逐步进入人们的视野。
小球藻(Chlorella pyrenoidosa Chick) ，为绿藻门，属普
生性单细胞绿藻，有略显著的腐生生活倾向，它们能在富
含有机质的污水中生活得很好，并摄取除 CO2以外的醋酸
或葡萄糖类低分子有机物质［7］。近年来，国内学者开展
了固定化小球藻对污水中金属离子的吸附研究，取得较
好成果［8］，但是对微藻的固定化条件研究相对较少。本
研究通过优化小球藻固定化方法并和 N、P的吸收特性关
收稿日期:2010-07-27，修订日期:2010-09-08
基金项目:江苏省海洋生物学重点实验室开放基金课题(JSMK2008-004)
作者简介:袁 冰(1985-) ，男，山东滨州人，硕士研究生，主要从事海洋生化工程方面的研究，E-mail:huliliela@ 163． com
通讯作者:孙利芹(1973-) ，女，博士，副教授，E-mail:sliqin2005@ 163． com
第 6 期 袁 冰，等:固定化小球藻的制备及对 N、P吸收的影响 805
联，期望为固定化微藻在净化养殖废水的应用研究方面
提供帮助。
1 材料和方法
1． 1 实验藻种
小球藻(Chlorella pyrenoidosa Chick)原种由中国海洋
大学微藻种质库提供，实验用藻种是由烟台大学海洋生
化工程研究所纯化并保存。
1． 2 人工污水配方
为防止实际污水中的某些物质干扰测定结果，实验
采用模拟的人工废水。人工废水是参照烟台地区实际养
殖废水中的 N、P含量，在无 N、P 的 Dauta 培养基［9］的基
础上，另加 10 mg /L NaNO3、10 mg /L NaNO2、10 mg /L
NH4Cl和 10 mg /L Na2HPO4配制成的。其中 Dauta培养基
是在 1 L 重蒸水中溶入 1． 0 mg FeSO4·7H2 O、1． 1 mg
Na2EDTA·2H2O、5． 0 mg Na2 CO3、0． 001 mg H3BO3、25． 0
mg MgSO4·7H2O、0． 02 mg ZnSO4·7H2O、25． 0 mg CaCl2
·2H2O、0． 04 mg Na2 MoO4·2H2 O、500 mg NaHCO3配制
而成。
1． 3 实验方法
1． 3． 1 固定化小球的制备
将聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠(SA)分别与水混合并
在 100℃水浴中溶解制成 PVA 和海藻酸钠的胶体溶液。
将处于对数生长期的小球藻培养液离心浓缩弃去上清
液，然后用不含 N、P 的 Dauta 培养基悬浮至浓度为(6． 5
± 0． 3)× 107 /mL的藻液，按一定比例与胶体溶液混合均
匀，然后用注射器将其注入到 3%的 CaCl2溶液中，静置
0． 5 h得到胶体小球。小球固定好后，取出胶体小球用重
蒸水洗涤三次即得到包有微藻的胶体小球。
1． 3． 2 细胞生物量的测定
固定化小球的溶解:从培养液中取出一定数量的胶
体小球置于小试管中，向小试管中滴加一定量的 3%的柠
檬酸钠溶液，静置，使小球溶解释放其中包埋的藻细胞。
细胞计数:从培养液中取出藻液 1 mL(游离藻直接取
样测定，固定化藻取出一定数量的小球解固定化后测
定) ，显微镜下以血球计数板计数，每个样品计数四次取
平均值。
1． 3． 3 固定化小球机械强度的测定
将固定化小球接入废水中培养，不通气的情况下，在
不同时间内数出破碎小球的个数，其中破碎的球数与总
球数之比即得破碎率。
固定化小球破碎率(%)= 已破碎球数
总固定化球数
× 100%
1． 3． 4 P的测定
P 的测定采用磷钼蓝分光光度法，具体方法参见文
献［10］。
标准曲线方程为:y = 0． 1027x + 0． 0009，R2 = 0． 9506。
1． 3． 5 硝态氮的测定
硝态氮的测定采用 A220-A275 紫外分光光度法，具
体方法参见文献［10］。
标准曲线方程为:y = 0． 3953x + 0． 0031，R2 = 0． 9914。
1． 3． 6 亚硝态的测定
亚硝态氮的测定采用盐酸奈乙二胺分光光度法，具
体方法参见文献［10］。
标准曲线方程为:y = 3． 958x + 0． 0013，R2 = 0． 9862。
1． 3． 7 氨态氮的测定
氨态氮的测定采用水杨酸分光光度法，具体方法参
见文献［10］。
标准曲线方程为:y = 0． 8614x + 0． 0128，R2 = 0． 9981。
1． 4 最佳固定化条件的确定
1． 4． 1 微藻固定化方法的单因素实验
研究经验［11］表明，接种游离藻与固定化试剂的配比
及固定化小球的大小是影响固定化小球藻脱 N除 P的显
著因素。此外，海藻酸钠和聚乙烯醇的浓度和配比影响
固定化小球的强度和固定化小球的传质效果，间接影响
固定化微藻的脱 N 除 P 效果，因此也将作为固定化小球
条件优化的重要指标。
通过前期实验的摸索，初步确定游离小球藻的量和
固定化试剂的配比(体积比)为 1∶ 2，1∶ 3，1∶ 4，1∶ 5，1∶ 6;制
备固定化微藻小球大小为 0． 5，1，3，5 和 6 mm。
1． 4． 2 正交实验优化固定化条件
在单因素实验结果的基础上，采用 L9(3
4)正交实验
设计表，进一步确定接种游离藻和固定化试剂的配比、固
定化小球大小、SA 含量和 PVA 含量四个因素，考察各因
素对人工废水处理条件的影响，并优化固定化条件。各
因素的水平如表 1 所示。
表 1 正交试验因素水平
Tab． 1 Lever of factors in this orthogonal experiment
水平
因素
接种游离藻和试剂配比 v /v(A) 球径(B)/mm SA含量(C)/(%) PVA含量(D)/(%)
1 1∶ 3 1 1 6
2 1∶ 4 3 2 7
3 1∶ 5 5 3 8
2 结果与分析
2． 1 单因素脱 N除 P的效果
2． 1． 1 球径对固定化小球藻去除 N、P的影响
由图 1 不同球径的固定化小球藻对 P 的去除效果可
知，3 mm球的去除率最快，在培养的第 4 d 达到最高为
95． 92%，比 6 mm 高 26． 33%，比 0． 5 mm 球的去除率高
806 海 洋 环 境 科 学 第 30 卷
30%。而 1 mm球和 5 mm球的最终去除率(培养 13 d)都
达到最高为 100%，最终 P 的去除率为 5 mm = 1 mm ＞ 3
mm ＞6 mm ＞0． 5 mm。
由图 2 中不同球径的固定化小球藻对 N的去除效果
可知，5 mm球的去除率最快，在培养的第 6 d 达到最高
为 83． 47%，比 0． 5 mm高 24． 43%。最终 N的去除率为 5
mm ＞1 mm ＞3 mm ＞0． 5 mm ＞ 6 mm。
由图 2 中不同球径的固定化小球藻对 N的去除效果
可知，5 mm球的去除率最快，在培养的第 6 d 达到最高
为 83． 47%，比 0． 5 mm高 24． 43%。最终 N的去除率为 5
mm ＞1 mm ＞3 mm ＞0． 5 mm ＞ 6 mm。
由图 1 和图 2 数据分析可知:固定化小球的球径对固
定化小球的强度影响较大，6 mm 球的破碎率较高，影响
了它的最终脱 N除 P效率，而 0． 5 mm的小球比较容易固
定，就造成了固定化后的小球过于坚硬，影响 N、P在小球
中的传递，所以其最终的脱 N除 P效率也不是很好。
2． 1． 2 接种游离藻与固定化试剂的配比对固定化小球
藻脱除 N、P的影响
接种游离藻与固定化试剂的配比对 P 的去除效果见
图 3。固定化小球藻在培养后的第 3 d开始大量吸收利用
P。且接种配比为 1∶ 5 的固定微藻的去除率最快，在第 6
d达到最高为 93． 88%，比配比 1∶ 6 的高 34． 02%。配比 1
∶ 2 的固定微藻量对 P 的去除相比较差，最高去除率为
82． 90%。
由图 4 可知，在接种后第 4 d固定化小球藻开始大量
吸收利用 N。且游离藻接种量与试剂配比为 1∶ 5 的固定
微藻对 N的吸收最快，在第 6 d达到最高，为 96． 05%，比
1∶ 2 的高 26． 05%。而配比为 1∶ 4 的固定化藻细胞的最终
去除率最高为 90． 03%。
配比为 1∶ 2 的固定藻细胞对 N 的吸收最差，最高去
除率仅为 66． 1%，分析认为是由于固定化小球中被固定
的游离藻含量过高，小球容易破碎，而最终影响了 P 的去
除;配比为 1∶ 6 的固定化小球藻则因为固定化试剂的含
量较高，固定化小球过于紧实，影响了固定化微藻的传质
效果，故其对 P和 N的最终去除率也不是最优水平。
2． 2 最佳固定化条件的确定
选用 L9(3
4)正交实验表，以 N、P 综合去除效果为考
察指标，优化接种游离藻与固定化试剂的配比、球径、海
藻酸钠含量和聚乙烯醇含量四个因素，实验结果如表 2
所示。
2． 2． 1 直观分析与讨论
由于小球藻对各种形态的 N 的利用率不同，且有顺
序，在利用的过程中亚硝态 N的形态会发生变化，所以最
终的去除率用单个指标是不能准确表示的，因此，在正交
分析时选择将 N 的三种形态的去除率进行加和，得到 N
的去除率。直观分析的实验结果如表 3。
第 6 期 袁 冰，等:固定化小球藻的制备及对 N、P吸收的影响 807
表 2 正交实验方案及结果
Tab． 2 Experimental program and results
试验号
因素
A B C D
评价指标
N去除率 /(%) P去除率 /(%) 破碎率 /(%)
1 1 1 1 1 96． 42 100 87
2 1 2 2 2 93． 43 99． 82 67
3 1 3 3 3 93． 20 99． 54 0
4 2 1 2 3 93． 21 87． 04 10
5 2 2 3 1 91． 13 76． 51 1
6 2 3 1 2 90． 17 87． 96 73
7 3 1 3 2 87． 69 80． 69 5
8 3 2 1 3 85． 03 83． 04 90
9 3 3 2 1 86． 32 79． 69 0
表 3 直观分析
Tab． 3 Direct analysis
评价指标 因素
各水平均值
水平 1 水平 2 水平 3
极差 R 优水平
N去除率 / A 94． 350 91． 503 85． 447 8． 903 1
(%) B 92． 440 89． 863 88． 997 3． 443 1
C 90． 540 90． 087 90． 673 0． 586 3
D 90． 390 90． 430 90． 480 0． 090 3
固定化球 A 29． 233 28． 000 31． 667 3． 667 2
破碎率 /(%) B 34． 000 30． 557 24． 333 9． 667 3
C 83． 333 3． 557 2． 000 81． 333 3
D 29． 333 26． 223 33． 333 7． 110 2
P去除率 / A 99． 787 83． 837 81． 140 18． 647 1
(%) B 89． 243 86． 457 89． 063 2． 786 1
C 90． 333 88． 850 85． 580 4． 753 1
D 85． 400 89． 490 89． 873 4． 473 3
通过极差分析可知，对于 N 来说固定化的四个因素
的影响大小分别是:接种游离藻与固定化试剂的配比 ＞
球径 ＞海藻酸钠含量 ＞聚乙烯醇含量。从均值可以看出
对 N来说优水平为:A1B1C3D3，即接种游离藻与固定化
试剂的配比为 1∶ 3，固定化球直径为 1 mm，海藻酸钠含量
为 3%，聚乙烯醇含量为 8%。
对于 P去除效果来说，四个因素的影响大小分别是:
接种游离藻与固定化试剂的配比 ＞海藻酸钠含量 ＞球径
＞聚乙烯醇含量。从均值可以看出对 P 去除效果最佳的
固定化条件为:A1B3C2D3，即接种游离藻与固定化试剂
的配比为 1 ∶ 3，固定化球直径为 5 mm，海藻酸钠含量为
2%，聚乙烯醇含量为 8%。
对于固定化球的破碎来说固定化的四个因素的影响
大小分别是:海藻酸钠含量 ＞球径 ＞聚乙烯醇含量 ＞接
种游离藻与固定化试剂的配比。从均值可以看出对破碎
率来说优水平为:A2B3C3D2，即接种游离藻与固定化试
剂的配比为 1∶ 4，固定化球直径为 5 mm，海藻酸钠含量为
3%，聚乙烯醇含量为 7%。
2． 2． 2 最优组合的选择
综合表 3、表 4 可知，接种游离藻与固定化试剂的配
比对于破碎率来说影响很小，而对于 N 和 P 来说却是主
要影响因素，所以对接种游离藻与固定化试剂的配比应
该选择1水平;球径对于各评价指标来说都是第二影响
表 4 方差分析
Tab． 4 variance analysis
评价指标 因素 平方和 自由度 方差 F值
N去除率 / A 124． 056 2 62． 028 3． 449
(%) B 19． 247 2 9． 624 0． 535
C 0． 567 2 0． 284 0． 016
D 0． 012 2 0． 006 0． 000
P去除率 / A 609． 373 2 304． 687 3． 500
(%) B 14． 593 2 7． 297 0． 084
C 35． 487 2 17． 744 0． 204
D 36． 886 2 18． 443 0． 212
固定化球 A 20． 911 2 10． 455 0． 006
破碎率 / B 144． 031 2 72． 026 0． 044
(%) C 12981． 851 2 6490． 926 3． 927
D 76． 224 2 38． 112 0． 023
因素，但它对由方差分析它对 N的影响较大，故球型号应
选择 1 水平;海藻酸钠含量对破碎率来说是一个最重要
因素，而 2 水平和 3 水平的差别很小，故选择 3 水平;聚乙
烯醇含量对三个指标的影响相对其他三个因素都不显
著，故其水平可选择 1、2、3，但从节约资源来说我们应该
选择 1 水平。
综合上述分析确定最优组合为 A1B1C3D1，即接种游
离藻与固定化试剂的配比为 1∶ 3，固定化球直径为 1 mm，
海藻酸钠含量为 3%，聚乙烯醇含量为 6%。
808 海 洋 环 境 科 学 第 30 卷
2． 3 验证试验
根据前面正交实验的结果进行验证试验，验证优化
结果的优越性。即利用优化得到的条件:接种游离藻与
固定化试剂的配比 1∶ 3，固定化小球球径 1 mm，海藻酸钠
含量 3%，聚乙烯醇含量 6%，进行验证培养。
2． 3． 1 固定化前后藻细胞生长比较
由图 5 小球藻固定化前后的生长曲线可以看出，由
于受到固定化试剂的影响，固定化小球藻的生长受到抑
制，固定化小球藻的延迟期比游离态的小球藻的长，但藻
的活性在第 4 d后得到恢复，说明固定化小球藻没有使藻
丧失活性。相同条件下固定化后的小球藻到达对数生长
期的时间长于游离状态的藻细胞，其最高生物量密度为
7． 67 × 106 /mL，低于游离状态的 11 × 106 /mL。但是，固定
化小球藻的生长稳定期延长，细胞密度能够在 15 d 内仍
然维持相对稳定，而游离藻在第 10 d 即开始明显衰退。
以上实验结果说明，固定化小球藻能够长期维持一定的
脱 N除 P能力，更适合对于污水的处理。
图 5 游离藻与固定化小球藻的生长曲线
Fig． 5 Growth of free chlorella and immobility Chlorella
2． 3． 2 小球藻固定化前后的脱 N除 P效果
图 6 游离和固定小球藻对 N的去除效果
Fig． 6 Removal － ratio of nitrogen by free Chlorella and immo-
bility Chlorella
由图 6 可知，游离的小球藻的脱 N 能力在生长初期
比固定的小球藻略强，但到第 8 d后其去除效果低于固定
化得小球藻，游离的小球藻最终去除率为 84． 24%，而固
定的小球藻的去除率却为 93． 41%。图 7 显示游离的小
球藻的除 P效果略低于固定的小球藻，两者的最终对 P
的去除率分别为 93． 41%及 95． 98%
图 7 游离藻和固定化小球藻对 P的去除效果
Fig． 7 Removal － ratio of phosphorus by free Chlorella and im-
mobility Chlorella
3 结 论
(1)固定化小球藻生长的延迟期和稳定期都比游离
态的小球藻长。
(2)正交试验选择出了固定化小球藻对本试验废水
处理的最优固定化方案，最优组合为 A1B1C3D1，即接种
游离藻与固定化试剂的配比(v /v)为 1 ∶ 3，球直径为 1
mm，海藻酸钠含量为 3%，聚乙烯醇含量为 6%。
(3)验证试验表明，固定化藻对 N、P的处理能力优于
游离藻，采用我们优化的固定化培养方法进行固定化小
球藻的培养，固定化小球藻对废水中 N 的去除率为
93． 41%，对 P的去除率为 95． 98%。
参考文献:
［1］杨海波，张欣华，刘卫东．藻类固定化研究进展［J］．大连大学
学报，2002，23(6) :17-21，87．
［2］渠文霞，岳宣峰．细胞固定化技术及其研究进展［J］． 陕西农
业科学，2007，6(6) :121-123．
［3］黄 霞，俞蚯馨，王 蕾．固定化细胞技术在废水处理中的应用
［J］．环境科学，1992，14(1) :41-49．
［4］仵小南，谭桂英，周百成，等． 几种海洋微藻的固定化培养
［J］．海洋学报，1992，14(1) :129-133．
［5］CHEVALIER P J N． Efficeiency of immobilized hyperconcentrat-
ed algae for ammonium and orthophosphate removal from
wastewater［J］． Biotechonl Lett，1985，7:395-400．
［6］TAM N F Y，WONG Y S ． Effect of immobilized microalgal bead
concentrations on wastewater nutrient removal［J］． Environmen-
tal Pollution，2000，107(1) :145-151．
［7］胡开辉，汪世华．小球藻的研究开发进展［J］． 武汉工业学院
学报，2005，24(3) :27-29．
［8］徐雪芹，李小明，杨 麒，等．固定化微生物技术及其在重金属
废水处理中的应用［J］． 环境污染治理技术与设备，2006，7
(7) :99-105．
［9］陈 娟．固定化小球藻及其对氮磷利用的研究［D］．南昌:南昌
大学，2007．
［10］国家海洋局 908 专项办公室．海洋化学调查技术规程［M］．
北京:海洋出版社，2006． 27-35．
［11］江守坤，袁 冰，孙利芹，等． 3 种微藻固定化前后污水处理
能力的研究［J］． 海洋科学进展，2009，27(1) :93-98．