全 文 ：第 19卷第 2期 烟台大学学报(自然科学与工程版) V o.l 19 No. 2
2006年 4月 Jou rna l of Yantai University (Na tural Science and Eng inee ring Edition)　 Apr. 2006　
　　文章编号:1004 8820(2006)02 0125 05
无菌条件下的小球藻培养条件优化①
王逸云1 ,王长海 1, 2
(1.大连理工大学 环境与生命学院生物工程系 ,辽宁 大连 116024;2. 烟台大学 海洋学院 , 山东 烟
台 264005)
摘要:在无菌培养条件下 , 对影响纯化小球藻 (Ch lorella sp. )生长的 NaHCO3 , KNO3 ,
KH2PO4 , VB1 , VB12等主要营养因素进行了优化. 实验结果表明微量元素对纯化小球藻的
生长有极显著的影响 , 维生素对纯化小球藻的生长亦有一定的影响. 通过五因素四水平正
交实验 ,得到了以海水为基础的优化培养基配方:KNO
3
0. 5 g /L、NaHCO
3
0. 2 g /L、VB
12
1. 0
g /L、KH2PO4 0. 02 g /L、VB1 0. 3 mg /L, 并添加 f /2微量元素. 该优化配方有效地提高了纯化
小球藻的生长速度和生物量产量.
关键词:微藻;小球藻;无菌培养;正交实验
中图分类号:Q949. 2　　　　文献标识码:A
　　小球藻为绿藻门 (Chlorophy ta)小球藻属 (Chlorella)的一种单细胞绿藻 ,其生态分布广 ,
易于人工培养 ,营养丰富 , 应用价值高 ,可用于保健食品 、饲料添加剂 、水产饵料和提取生物
活性物质等多个领域 [ 1 - 7] , 有着巨大的应用和开发潜力 ,而大量培养小球藻则是开展各项
应用研究的前提条件.关于培养条件对小球藻生长的研究已有较多报道[ 5 - 7] .这些研究结果
表明 ,培养条件和营养盐的浓度及比例对小球藻的生长速率有显著影响.因此 , f /2液体培
养基虽然适用于大部分海洋微藻的保种与培养 ,但具体到小球藻来说 ,还需要进一步优化.
　　本实验所用藻种 ———海水小球藻 (Ch lorella sp. MACC /C95)高不饱和脂肪酸 (HUFA)
含量较高:在 25℃, f /2培养基中培养时 EPA含量达总脂含量的 20. 8%, DHA含量达总脂
含量的 0. 2%.我们实验室拟通过基因操作使其成为具高附加值的优良水产饵料 ,在已获得
纯化的无菌藻种 ,并对其培养条件进行了研究的基础上 ,本文进一步对影响小球藻生长的 5
种主要营养因素进行了研究.
1　材料和方法
1. 1　藻种及培养基
　　小球藻 (Chlorella sp. MACC /C95)购自中国海洋大学微藻室 ,并经本实验室分离纯化除
菌.海水基础培养液 SBM:NH4NO 3 50mg /L, FeC6H5O 7 0. 1mg /L, K2HPO4 5mg /L,灭菌海水
① 收稿日期:2005 03 14
基金项目:国家 “十五 ”重点科技攻关项目(2001BA707B03).
作者简介:王逸云 (1974 ),女 ,甘肃张掖人 ,博士 ,研究方向:海藻基因工程;王长海(chw ang2001@ sina. com),教授 , 博
士生导师,通讯联系人.
DOI牶牨牥牣牨牫牴牭牨牤j牣cnki牣牫牱牠牨牪牨牫牤n牣牪牥牥牰牣牥牪牣牥牥牴
烟台大学学报(自然科学与工程版) 第 19卷　
配制;f /2液体培养基配方见文献 [ 8] .所有培养基均高压灭菌备用.
1. 2　培养方法
　　取培养 6 d左右的新鲜藻液 ,经 3500 r /m in离心 15m in后弃去上清 ,用培养液洗一次 ,
在无菌条件下以培养液悬浮后取适量藻液接种.用 300mL三角瓶内装 100 mL培养液 ,瓶口
以 8层纱布封口后置震荡光照培养箱中培养 , (温度 (25±0. 5)℃,光照强度 1. 2mW /cm2 ,
转速 100 r /m in,采用日光灯连续照射).
1. 3　生物量的测定
　　藻体干重的测量:培养液经可称重滤纸过滤后 , 105℃烘干至衡重后以精密分析天平称
干重.以血球计数板法测量小球藻的细胞个数 ,同时计算藻体生长速率 ,计算公式如下[ 9] :
K =2. 303( lgN - lgN 0) /t,
T =0. 693 K/ .
其中:K为比生长常数;N 0为起始细胞密度;N为经过 t时间的细胞密度;T为平均世代(d);
t为生长时间 (d).
2　结果与讨论
2. 1　正交实验
图 1　维生素和微量元素对小球藻生长的影响
F ig. 1　E ffec t o f m icroe lem ents and v itam ins
on g row th o fCh lorella sp.
　　以往研究中对小球藻的培养基优化多针对
C , N , P 3种对小球藻的生长影响较大的大量元
素[ 5 - 6] ,而本实验中发现在培养纯化小球藻时 ,
维生素和微量元素的影响也不可忽略.如图 1所
示 ,微量元素对小球藻的生长影响极为显著 ,在
f /2配方中去掉微量元素 ( f /2 -W)后小球藻的
终密度降低了近一半 ,维生素对小球藻的生长也
有影响 ,在 f /2配方中去掉维生素( f /2 -V)后小
球藻的终密度亦有所降低.
　　不同海域 、不同历史时期的海水中痕量元素
的浓度不同 [ 10 - 11] ,且随重金属污染的加剧 ,海水
中痕量元素的浓度变化很大 ,若优化微量元素须
考虑海水的背景值等问题 ,较为复杂 ,所以本实验仍采用 f /2配方中微量元素的添加量 ,仅
对 C , N , P 3种大量元素和维生素进行优化.在光强等其他条件固定的条件下 ,以灭菌海水
为基础 ,针对 NaHCO3 , KNO3 , VB1 , KH2 PO4 , VB12设计了五因素四水平正交试验. 水平安排及
实验结果分别见表 1,表 2.由表 2可知 , 5种营养因素对小球藻生长的影响按极差 R的大小
排列为:KNO3 >N aHCO 3 >VB12 >KH2 PO 4 >VB1 ,其中 KNO3对小球藻生长的影响较显著 ,
NaHCO3 , VB12 , KH2 PO 4的影响不太显著. VB1对小球藻的生长影响较小.根据对表 2中各因
素和水平的优化比较 ,得出下列优化培养基配方为:KNO3 0. 5 g /L、N aHCO 3 0. 2 g /L、VB12 1.
0 g /L、KH2 PO 4 0. 02 g /L、VB1 0. 3mg /L. 并添加 f /2微量元素.
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　第 2期　　　　　　　王逸云 ,等:无菌条件下的小球藻培养条件优化
表 1　正交试验因素水平表
Tab. 1　Factors and leve ls o f orthogona l tests
水平 因素
NaHCO3 /g L- 1 KNO3 /g L- 1 KH2PO4 /g L - 1 VB1 /mg L - 1 VB12 /μg L - 1
1 0. 025 0. 25 0. 01 0. 30 0. 50
2 0. 050 0. 50 0. 02 0. 60 1. 00
3 0. 100 1. 00 0. 04 1. 20 2. 00
4 0. 200 2. 00 0. 08 2. 40 4. 00
表 2　5种营养因素正交试验的结果和直观分析表
Tab. 2　Resu lts and analysis o f orthogona l tests
实验组 NaHCO3 /
g L- 1
KNO 3 /
g L - 1
KH2PO4 /
g L - 1
VB1 /
m g L- 1
VB12 /
μg L- 1
培养密度 /
×106 m L -1
1 1 1 1 1 1 49. 41
2 1 2 2 2 2 52. 56
3 1 3 3 3 3 47. 55
4 1 4 4 4 4 44. 17
5 2 1 2 3 4 49. 27
6 2 2 1 4 3 51. 37
7 2 3 4 1 2 46. 74
8 2 4 3 2 1 42. 93
9 3 1 3 4 2 50. 41
10 3 2 4 3 1 49. 51
11 3 3 1 2 4 47. 08
12 3 4 2 1 3 46. 65
13 4 1 4 2 3 51. 51
14 4 2 3 1 4 51. 27
15 4 3 2 4 1 48. 98
16 4 4 1 3 2 48. 27
K1 48. 42 50. 15 49. 03 49. 16 47. 71
K2 47. 58 51. 18 49. 37 48. 52 49. 50
K3 48. 41 47. 59 48. 04 48. 65 49. 27
K4 50. 01 45. 51 47. 98 48. 73 47. 95
极差 R 3. 43 4. 64 1. 39 0. 64 1. 79
2. 2　优化配方的验证
　　为进一步验证优化配方 (O I),与海水基础培养基 (SBM), f /2培养基进行对照实验 ,共
培养 12 d,结果如表 3、图 2所示.由图 2的生长曲线和表 3中的数据可见 ,正交实验得到的
优化配方具有明显的生长优势 ,各项指标均高于对照组 ,其中细胞培养终了密度分别是海水
基础培养基和 f /2培养基的 2. 01和 1. 67倍 ,生物量则分别是海水基础培养基和 f /2培养基
的 2. 57和 1. 77倍 ,反映细胞生长速度的比生长常数分别是海水基础培养基和 f /2培养基
的 1. 35和 1. 21倍.
　　为进一步验证优化配方的效果 ,在 10 L广口瓶中进行了放大实验 ,实验共设 f /2培养
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烟台大学学报(自然科学与工程版) 第 19卷　
基 ,优化培养基 (O I),优化培养基流加(O IF)三组 ,共培养 12 d,结果见图 3、表 4.其中优化
流加为在优化培养基培养的第 4天流加 1倍的营养盐. 结果显示 ,放大培养中其效果更为显
著 ,优化配方流加后具有明显的生长优势 ,反映细胞生长速度的比生长常数是 f /2培养基的
1. 3倍.细胞培养终了密度是 f /2培养基的 1. 89倍 ,最终生物量是 f /2培养基的 2. 11倍. 细
胞在优化配方中具有指数生长期长 ,整个培养期中持续快速生长等优点 ,在对照组进入稳定
期后优化组仍有显著增长.
表 3　小球藻在不同培养基中的培养效果
Tab. 3　The cultivation result o fCh lorella sp. in differen tm ed ium
培养基 初始密度 /×106 m L -1
终末密度 /
×106 m L- 1
比生长常数 /
d- 1
平均世代 /
h
生物量 /
g L- 1
f /2 4. 8 47. 1 0. 19 87. 54 0. 74
SBM 4. 8 39. 0 0. 17 97. 84 0. 51
O I 4. 8 78. 5 0. 23 72. 31 1. 31
图 2　培养基对小球藻生长的影响
F ig. 2　E ffec ts of m ed ium on grow s
o fCh lorella sp.
图 3　放大培养时培养基对小球藻生长的影响
F ig. 3　Effects o fm edium on g row s of
Ch lorella sp. in 10L flask
表 4　小球藻在不同培养基中的培养效果
Tab. 4　Effect of m ed ium on grow th ofChlorella sp. in 10L w ide neck flask
培养基 初始密度 /×106 m L -1
终末密度 /
×106 m L- 1
比生长常数 /
d- 1
平均世代 /
h
生物量 /
g L- 1
f /2 4. 6 52. 6 0. 20 83. 16 0. 81
O I 4. 6 85. 0 0. 24 69. 30 1. 34
O IF 4. 6 99. 4 0. 26 63. 97 1. 71
3　结　论
　　(1)在培养纯化小球藻时 ,维生素和微量元素的影响不可忽略 ,微量元素对小球藻的生
长影响极为显著 ,维生素对小球藻的生长也有一定影响.
　　(2)通过五因素四水平正交实验 ,得到了以灭菌海水为基础 、N aHCO 3为碳源的海水优
化培养基配方(KNO 30. 5 g /L、NaHCO30. 2 g /L、VB121. 0μg /L、KH2 PO40. 02 g /L、VB10. 3mg /L,
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　第 2期　　　　　　　王逸云 ,等:无菌条件下的小球藻培养条件优化
并添加 f /2微量元素 ).该优化配方有效地提高了纯化小球藻的生长速度和生物量产量 ,为
该藻的进一步高密度大规模培养提供了依据.
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Culture Cond itionOptmi ization ofChlorella sp.
WANG Y i-yun1 ,WANG Chang-hai1, 2
(1. Department of B ioeng inee ring, Dalian University o f Techno logy, Da lian 116024, China;2. Schoo l o fOcean, Yan-
ta iUniversity, Yanta i 264005, Ch ina)
Abstrac t:The e ffec ts of nutrient factors o f the culture so lution, such as nitrogen, phosphorus, car-
bon, microe lements, vitam ins B1 and B12, on the g row th of axen icCh lorella sp. have been stud-
ied. M icroelemen ts have ve ry signify effect in cu lture ofCh lorella sp. , they w ere added as same
concen trations as that o f seaw a te r medium M - f /2. and concentrations o f othe r nutrient factors
we re optim ized by o rthogonal expe riment:KNO 30. 5 g /L, N aHCO 30. 2 g /L, VB121. 0μg /L, KH2PO 4
0. 02 g /L, VB10. 3mg /L. Cu ltured w ith this optima lmed ium , the cell g row th speed and biomass
productivity increased significan tly.
Key words:m icroalga l;Chlorella sp. ;axenic culture;orthogonal expe riment
(责任编辑　周雪莹)
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