全 文 ：第 26卷第 6期
2007年 6月
水 产 科 学
F ISHERIES　SC IENCE V o.l 26 No. 6Jun. 2007
碳酸氢铵等不同氮源对小球藻生长的影响
叶林超 , 叶均安 , 徐国忠 , 刘建新
(浙江大学 动物科学学院 , 浙江　杭州　310029 )
摘　要:研究了 NH4HCO3 、(NH4)2SO4 、N aNO3 、NH2CONH2 、NH4C l和 NH4H2PO4 6种氮源对小球藻生
长的影响。每组的氮质量浓度均为 50 mg /L,均添加磷质量浓度为 3 m g /L的 NaH
2
PO
4
作为磷源 , 培养
9 d。试验结果表明 ,各处理组在第 3 ～ 5 d时小球藻的生长指标达到最大值 , 添加 NH4HCO3组对小球
藻生长的促进作用最明显 , 细胞密度 、吸光度 、干重和叶绿素含量等指标都显著高于其他处理组(P <
0. 05),其次为 N aNO3和 NH2CONH2 ,而(NH4)2 SO4、NH4C l和 NH4H2PO4效果不明显。
关键词:小球藻;NH
4
HCO
3
;生长
中图分类号:Q949. 217 文献标识码:A 文章编号:1003-1111(2007)06-0319-04
　　收稿日期:2006 - 10 - 25;　修回时间:2006 - 11 - 27.　　基金项目:浙江省科技计划项目(2005C22044).　　作者简介:叶林超(1982 - ),男 ,硕士研究生;E -m ai l:yelinchao1982@163. com.通讯作者:叶均安(1962 - ),男 ,副教授 ,研究方向:水产资源;E -m ail:yja@ z ju. edu. cn.
　　小球藻 (Ch lorella vulgaris)分布广 ,易培养 ,生
长快 ,富含蛋白质(占干重的 50% ～ 67%)、不饱和
脂肪酸 、类胡萝卜素 、虾青素 、多种维生素以及人体
所需的 20种氨基酸等营养物质 ,营养价值极高 ,被
FAO列为 21世纪人类的健康食品 。它含有小球藻
促生长因子 ,具有激发人体防御和免疫组织中的巨
噬细胞 、T细胞 、B细胞的功能[ 1] ,具有抗肿瘤活性 ,
增强免疫力 ,抗病原菌和病毒感染力 [ 2] 。在环境科
学领域 ,小球藻具有降解邻苯二甲酸酯类 [ 3]和吸附
重金属铜的能力 [ 4] 。目前小球藻年产量为 2000 t,
国际市场需求为 8000 ～ 10000 t,因此小球藻的开发
与应用前景广阔 [ 5] 。
目前 ,氮源对小球藻生长影响的试验很多 ,但
主要集中在 NaNO3 , NH 2CONH2等氮源上 [ 6-7] ,而对
于 NH4HCO3及其他铵态氮的研究较少 。由于
NH2CONH 2价格较高 ,所以 NH4HCO3等铵态氮肥的
研究具有较大的应用价值 。笔者研究了 NH 4HCO 3
及其他氮源对小球藻生长的影响 ,为 NH4HCO 3在
小球藻的大规模生产应用中提供理论依据 。
1　材料与方法
1. 1　藻种
小球藻 购 自 宁 波大 学 藻 种 室 , 编 号 为
nmb luh015-2。
1. 2　试验设计
共设 6个处理组 ,分别添加氮质量浓度为 50
mg /L的 NH4HCO3 、(NH4)2 SO4 、N aNO3 、NH2CONH2、
NH4C l和 NH4H2PO4。每个处理组均以 N aH2 PO 4作为
磷源 ,添加质量浓度均为 3mg /L,进行小球藻培养试
验。其中氮 、磷的添加量参考国内外的相关报
道[ 8-10] 。
1. 3　小球藻培养
购买市场上的 “海水晶 ”配制人工海水 ,相对密
度为 1. 022±0. 001。使用 F /2培养液 [ 11] (其中氮
源 、磷源按本试验设计添加),按 1∶4把扩培到一定
浓度并弃去原来培养液的藻种接种到经消毒处理
的 250m l锥形瓶中 ,在智能光照培养箱内培养 9 d。
温度(25 ±1)℃。光照度 (5000 ±100) lx , L∶D为
14 h∶10 h, pH 7. 2 ±0. 1,静态培养 ,每天定时摇 3
次 。
1. 4　测定指标和方法
1. 4. 1　生物量的测定
光密度值 (OD):扫描小球藻的最大吸收波长
为 570 nm ,每天定时取少量藻液测定其光密度值 。
细胞密度:每天定时取 0. 2 m l藻液 ,加蒸馏水
4 m l稀释摇匀 ,用血球计数板在显微镜 (400×)下
计数。
干重:隔天定时取藻液 2 m l经离心后 ,藻沉淀
转移至已称重的铝盒内 ,置烘箱内于 105℃烘干至
恒重 ,转到干燥器 30 m in,然后称重 ,计算与铝盒重
量的差值 。
1. 4. 2　比生长速率 (k)
k =( lnN t - lnN 0) /T
N t和 N 0分别为经过 T d后细胞密度和初始细胞密度。
1. 4. 3　单位体积叶绿素
每天定时取 2 m l藻液于离心管中 , 4000 r /m in
DOI牶牨牥牣牨牰牫牱牳牤j牣cnki牣牨牥牥牫牠牨牨牨牨牣牪牥牥牱牣牥牰牣牥牥牫
离心 5m in,弃去上清液 ,加入 3 m l 80%丙酮 ,用超
声波细胞破碎仪完全破碎藻细胞 , 分别在 645 nm
和 663 nm处测吸收波长。计算公式为:叶绿素浓
度 (mg /OD) =(20. 2 ×OD645 +8. 02×OD663)×稀
释倍数 [ 12] 。
1. 5　数据分析
采用 SAS软件和 Excel方差分析 。
2　结果与分析
2. 1　不同氮源对小球藻生物量的影响
不同氮源对小球藻生物量的影响见表 1、表 2。
由表 1和表 2可见 ,以 NH4HCO3作氮源时小球藻生
长的效果最佳 ,光密度值和细胞密度 2个指标都显
著高于其他氮源 (P <0. 05),表明NH4HCO3对小球
藻增殖效果最好 。其次为 N aNO 3和NH2CONH 2组 ,
第 4 d前两者差异不显著 (P >0. 05), 之后添加
N aNO 3组 3种指标均显著高于 NH 2 CONH 2 (P <
0. 05),说明 N aNO 3维持小球藻持续生长的效果好
于 NH2CONH 2。 (NH4)2 SO4 、NH4C l和 NH4H2 PO4的
效果较不明显 ,其中(NH 4)2SO 4和 NH4 C l之间差异
不显著 (P >0. 05),两者总体上比 NH4H2 PO 4效果
好 。此外 ,通过计算光密度值与对应细胞密度的相
关性 , 其回归方程为 y =0. 007x - 0. 03, R2 =
0. 9556(x为细胞密度 , y为光密度值 ), 2种指标间
相关性比较好 。
表 1　不同氮源对小球藻光密度值(OD)的影响
氮源 不同天数 OD值
0 d 2 d 4 d 6 d 8 d
NH4HCO3 0. 107 0. 323
a 0. 463a 0. 608a 0. 735a
(NH 4)2 SO 4 0. 107 0. 146c 0. 143d 0. 145d 0. 153d
N aNO 3 0. 107 0. 177
b 0. 223b 0. 314b 0. 448b
NH 2CONH2 0. 107 0. 177
b 0. 200c 0. 254c 0. 314c
NH4C l 0. 107 0. 146
c 0. 145d 0. 146d 0. 157d
NH4H 2PO4 0. 107 0. 129
d 0. 125e 0. 126e 0. 131e
　注:同列间标不同字母间表示差异显著(P <0. 05),下同。
表 2　不同氮源对小球藻细胞密度的影响
氮源 不同天数小球藻细胞密度 /×10
5
0 d 2 d 4 d 6 d 8 d
NH4HCO3 33. 0 90. 0
a 123. 3a 162. 7a 222. 0a
(NH 4)2 SO 4 33. 0 59. 3bc 51. 3d 54. 7d 51. 3d
N aNO 3 33. 0 58. 7
bc 73. 3c 99. 3b 129. 3b
NH 2CONH2 33. 0 64. 0
b 82. 0b 88. 0c 111. 3c
NH4C l 33. 0 54. 0
c 57. 3d 48. 0de 46. 0de
NH4H 2 PO 4 33. 0 43. 3
d 44. 0e 40. 0e 41. 4e
表 3　氮源对小球藻干重的影响
氮源 不同天数小球藻干重 /m g m l
- 1
1 d 3 d 5 d 7 d 9 d
NH4HCO 3 1. 45±0. 20ab 1. 87±0. 06a 3. 33±0. 15a 4. 02±0. 15a 4. 05±0. 15a(NH4)2 SO 4 1. 42±0. 12ab 1. 68±0. 15b 2. 03±0. 06d 2. 30±0. 26cd 2. 43±0. 06d
N aNO 3 1. 43±0. 21ab 1. 62±0. 25bc 2. 65±0. 30b 3. 07±0. 25b 3. 22±0. 35b
NH2CONH2 1. 43±0. 15ab 1. 58±0. 21bc 2. 43±0. 12c 2. 43 0. 21c 2. 73 0. 06c
NH4C l 1. 52±0. 21a 1. 67±0. 15b 2. 03±0. 15d 2. 167±0. 15d 2. 28±0. 25de
NH4H 2PO 4 1. 33±0. 15b 1. 48±0. 15c 2. 01±0. 12d 2. 15±0. 10d 2. 27±0. 06e
　　由表 3可见 ,添加 NH4HCO3后小球藻干重明显
高于其他处理组 (P <0. 05)。 NaNO3添加组在第 4
d后也显著高于 NH2 CONH2组 (P <0. 05),其他 3
种铵盐添加组的变化规律基本同光密度值和细胞
密度。第 4 ～ 5 d小球藻干重增加最快 ,到第 7 ～ 8 d
出现峰值 ,之后的增加量没有细胞密度和光密度值
的增加量大 ,可能与之后的叶绿素含量下降 ,光合
作用产物减少有关 。培养后收获的藻细胞密度增
加值与干重的增加值其相关回归方程为 y =32185x
- 19. 221, R2 =0. 9694(x为干重 , y为细胞密度 )。
2. 2　不同氮源对小球藻比生长速率的影响
不同氮源对小球藻比生长速率的影响见图 1。
由图 1可见 ,添加 NH4HCO3组小球藻的生长速率一
直显著大于其他各组 (P <0. 05), 其次为添加
N aNO 3组和 NH 2CONH 2组 ,开始时添加 NH2CONH2
组小球藻生长快于 N aNO 3组 ,第 5 d后添加 N aNO 3
组则快于 NH2 CONH 2组。添加 (NH4)2 SO4 、NH4 C l
和 NH4H 2PO4后 ,小球藻生长速率相对较小 ,其中以
NH4H 2PO4最差 。NH4HCO3添加组在第 3 d小球藻
生长速率达到最大值 0. 344,比 N aNO 3组最大值高
49. 6%,比 NH2CONH2组最大值高 25. 5%。
图 1　不同氮源对小球藻比生长速率的影响
320 水　产　科　学 第 26卷
2. 3　不同氮源对小球藻单位体积叶绿素含量的影响
不同氮源对小球藻单位体积叶绿素含量的影
响见图 2。由图 2可见 ,添加 NH4HCO 3组的叶绿素
含量显著高于其他各组 (P <0. 05), 最大值达
18. 906mg /OD。N aNO 3组叶绿素含量也从第 4 d开
始逐渐大于 MH2CONH2组 。各添加组从第 7 d后
开始下降 ,可能与培养液中氮元素消耗有关[ 13] 。
第 8 d叶绿素的净增加量与细胞密度的增加值的相
关回归方程为 y =4. 9844x +1. 8922, R2 =0. 9872
(x为叶绿素 , y为细胞密度 )。叶绿素的净增加量
与生长速率的相关回归方程为 y =0. 0134x +
0. 0645, R2 =0. 9354(x为叶绿素 , y为生长速率)。
图 2　不同氮源对小球藻单位体积叶绿素含量的影响
3　讨论
3. 1　铵态氮对单细胞藻生长的影响
一般认为微藻最易利用铵态氮 。它处于还原
状态 ,可以直接参与代谢作用 ,所以铵盐作为单细
胞藻的氮源比硝酸盐更易被吸收。陈贞奋报道 ,牟
氏角毛藻在铵盐中培养比在硝酸盐中培养繁殖得
快 [ 14] 。张青田等比较了不同氮源对金藻生长的影
响 ,发现铵氮的增殖效应好于 NH2 CONH2 [ 15] 。吴
长斌等报道铵氮对雨生红球藻的增殖效应极显著
高于 NaNO3(P <0. 01)[ 16] 。陈贞奋同时指出藻类
对不同的铵盐中铵态氮的吸收量也不同 ,比如牟氏
角毛藻对 (NH4)2 SO 4中铵态氮的吸收量要优于其
他一些氮源 [ 14] 。本试验结果显示 , (NH4)2 SO4对小
球藻的生长效果好于 NH 4C l和 NH 4H2 PO 4。但是许
多研究表明 ,随着 NH+4 被利用 ,培养基 pH逐渐下
降 ,会抑制微藻的生长 ,因而高浓度的铵盐反而对
微藻的生长不利 。试验中添加 (NH 4)2 SO4 、NH 4C l
和 NH4H2PO 4后对小球藻的生长效果远没有 N aNO 3
和 NH2CONH2明显可能是这个原因。至于试验中
NH4HCO 3作为小球藻氮源能显著促进其生长 ,并且
效果明显优于其他氮源 ,原因可能是 NH4HCO 3能
同时补充氮和碳源 。一般认为 ,单细胞藻直接从水
中吸收游离态 CO2 ,碳源一般不会成为单细胞藻生
长繁殖的限制因子 。但是 ,随着单细胞藻对游离
CO 2的吸收利用 ,藻液的 pH不断上升。过高的 pH
不但使藻难以适应 , 而且游离态 CO 2的浓度会下
降 ,一定程度制约了藻的生长繁殖 ,添加 NH4HCO 3
后能够保持小球藻生长过程中较低的 pH环境 ,促
进其快速生长 。试验中添加 NH4HCO3组小球藻的
生长速率显著大于其他各组 (P <0. 05),陈德辉等
认为获得比生长速率最大值的条件就是藻生长的
最适条件[ 17] ,所以添加氮质量浓度 50mg /L的 NH 4
HCO3时小球藻生长最好 。
3. 2　硝态氮和尿素氮对单细胞藻生长的影响
李庆彪等报道 ,单细胞藻利用硝态氮必须首先
被还原 ,因为氮在单细胞藻的代谢中 ,必须以 NH 3
的形式与藻细胞内碳水化合物的衍生物酮酸作用 ,
生成氨基酸 [ 18] 。虽然试验表明 , N aNO 3作为氮源比
NH4C l, NH4H2 PO 4等效果好 ,此结果与潘庭双等报
道相符 [ 19] ,本试验还表明 NaNO 3相对于NH2CONH 2
更有利于小球藻的持续生长 ,但利用硝酸盐这一过
程需要消耗能量 ,实际生产中不经济 。 NH 2CONH 2
是有机物 ,不能直接被单细胞藻利用 ,必须先被分
解成 NH4HCO 3 ,以 NH3的形式被利用。这个过程需
要在尿素酶的作用下才能完成 ,因此只有含尿素酶
的藻才能同化尿素 。试验结果说明 ,小球藻可以较
好地利用 NH2CONH2作为氮源 ,原因可能是该藻细
胞中存在尿素酶 ,将 NH2CONH 2分解后产生 NH3和
CO 2 ,不改变培养液的酸碱平衡 ,为单细胞藻生长创
造良好的生态环境 ,因而可以获得较高生物量和生
长速率 。潘庭双等比较了 NH2CONH2、NaNO3、
NH4C l对微绿球藻生长的影响 ,发现用 NH2 CONH2 、
N aNO 3作氮源效果较好 , NH4C l较差。马志珍曾报
道 ,三角褐指藻的氮源以 NH2 CONH2最好 ,其次为
NH4NO 3和 NH 4C l,而 NaNO3较差[ 20] 。目前国内外
学者有关氮源对微藻增殖效应的研究结果分歧很
大 。不同氮源 、不同浓度对不同种类的单细胞藻的
影响差异很大 。
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Effects of N itrogen Sources on Growth ofA lga Ch lore lla vulgaris
YE Lin-chao, YE Jun-an , XU Guo-zhong, LIU Jian-x in
(Co llege o fAnim al Science, Zhejiang Unive rsity, H angzhou 310029, China)
Abstract:The effects of six kinds of nitrogen sources including NH4HCO3 , (NH4)2 SO 4 , NaNO3 , NH 2CONH2 ,
NH4C l andNH4H 2PO4 on g row th o f algaChlorella vu lgaris were studied at a rate o f 50mg /L whenN aH2 PO4 was
used as P source at a rate o f 3 mg /L. The best grow th w as obse rved in the chlorella exposed to NH4HCO3(P <
0. 05), compared w ith o ther N sources, fo llow ed by NaNO 3 and NH 2 CONH2 , but no significan t effect w as ob-
served in the chlo re lla exposed to (NH 4)2SO 4 , NH4C l andNH4H 2PO4.
Key words:Ch lorella vu lgaris;NH 4HCO3;g row th
(责任编辑:晓　荷)
322 水　产　科　学 第 26卷