全 文 ：新疆雪莲总黄酮对 DNA甲基化酶抑癌作用的影响
吕 芳1，李雪峰2，张晓梅1，王大新1，李江伟2*
(1．江苏省苏北人民医院妇产科生殖医学中心，扬州大学，江苏 扬州 225001;
2．新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程实验室，新疆 乌鲁木齐 830046)
摘要:目的 探讨新疆雪莲总黄酮对 DNA甲基化酶活性及癌细胞 DNA甲基化状态的影响。方法 采用 DNA甲基化酶活
性分析实验检测雪莲总黄酮对 DNA甲基化酶活性的影响，甲基化特异性 PCＲ( MSP) 检测雪莲总黄酮处理 2d 后食管癌
KYSE510 细胞抑癌基因 P16 启动子 CpG岛甲基化状态;同时流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 雪莲总黄酮抑制 DNA 甲
基化酶 M． Alu I 活性，MSP 实验结果显示雪莲总黄酮处理 2 d 后，癌细胞未甲基化状态 P16 基因的表达水平升高，
KYSE510 细胞 P16 基因 mＲNA恢复表达。流式分析结果显示，雪莲总黄酮处理 KYSE510 癌细胞 2 d后，处理组细胞凋亡
率与对照组比较显著增加( P﹤ 0． 05) 。结论 雪莲总黄酮可以通过影响 DNA 甲基化酶活性，激活表观沉默的抑癌基因
表达，抑制癌细胞增殖。
关键词:新疆雪莲总黄酮; 表观遗传; P16 基因; DNA甲基化
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 09． 021
中图分类号:Ｒ962 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2014) 09-2098-03
研究表明许多植物活性成分都具有抗肿瘤作用，茶多酚、黄
酮类化合物及其他植物活性成分可通过调节表观遗传修饰发挥
抗肿瘤作用［1］。新疆雪莲是我国传统中草药，含多羟基黄酮类
化合物，具有明显的抗炎、镇痛作用，主要用于急慢性关节炎，类
风湿性关节炎，及骨关节炎等的治疗。近年研究表明雪莲黄酮具
有抑制癌细胞增殖的作用［2］，但是对其抑癌机制还未明了。DNA
高甲基化状态是关键的表观遗传修饰机制，导致很多细胞周期调
控基因如受体因子，DNA 修复基因以及凋亡基因等的表观沉
默［3 ～ 6］。P16 基因是细胞周期相关蛋白，对细胞生长周期起负调
控作用是抑癌基因［7］。研究发现 KYSE510 细胞 P16 基因启动子
区 CpG岛处于高甲基化状态，使 P16 基因表观沉默，而这种因表
观沉默不表达的基因在使用去甲基化药物作用后可重新表
达［8］。本文从 λDNA甲基化修饰后酶切和 P16 基因甲基化表观
遗传修饰改变以及癌细胞凋亡变化，研究新疆雪莲总黄酮抑制癌
细胞的机理，为新疆雪莲总黄酮治疗癌症提供研究基础。
1 材料与方法
1． 1 材料 雪莲总黄酮注射液购自新疆制药厂;5 － Aza － CdＲ
(DAC)，金合欢素购自美国 sigma 公司;顺铂购自云南个旧生物
药业有限公司;骆驼蓬碱由新疆华氏丹药业惠赠;M． AluⅠ，Alu
Ⅰ，λDNA 购自 NEW ENGLAND BioLabs 公司;DNA 甲基化修饰
试 剂 盒 购 自 ZYMO ＲESEAＲCH 公 司 (Catalog Nos．
D5005＆D5006);细胞 /组织基因组 DNA 提取试剂盒购自北京百
泰克(Catalog DP1901);DNA 分子量标准物购自天根公司，其他
试剂均为国产分析纯。DMEM 干粉购自 GIBCO 公司产品;胎牛
血清购自山东银香伟业生物工程公司;KYSE510 细胞系由日本
京都大学 Shimada 教授惠赠，10% FBS 的 ＲPMI1640，37° C，5%
CO2 培养箱培养。
1． 2 DNA 甲基化酶活性分析实验［9，10］ 检测 5 － Aza － CdＲ，顺
铂，金合欢素，雪莲总黄酮及骆驼蓬碱 5 种药物对 M． AluⅠ甲基
化酶活性的影响，无药物处理为对照组。甲基化酶保护反应体系
10μl (1μl λDNA;1μl 药物;1μl SAM;1μl M． AluⅠ;1μl 缓冲溶
液;5μl H2O)，放置 37℃水浴锅，2h 后，再进行 AluⅠ酶切反应，
反应体系 20μl(5μl 上述甲基化酶切保护反应体系;2μl 缓冲溶
液，1μl AluⅠ，12μl H2O)，37℃ 2h，0． 7%凝胶电泳。
1． 3 亚硫酸盐修饰和甲基化特异性 PCＲ(MSP)采用雪莲总黄
酮 50μg /ml处理 KYSE510 细胞 2d，常规收集培养瓶中的细胞，按
照试剂盒步骤提取 DNA。提取基因组经 1． 5%凝胶电泳检测其
完整性，紫外分光光度计定量检测，A260 /280 值均在 1． 7 ～ 1． 9
之间。DNA甲基化修饰使用试剂盒说明进行亚硫酸盐修饰。
MSP检测采用巢式 2 步法 PCＲ，第 1 步用亚硫酸盐修饰的 DNA
扩增 P16 基因长度为 208bp 的富含 CPG 岛启动子区，此时的引
物能扩增被亚硫酸盐修饰的模板但是不能区分甲基化和未甲基
化等位碱基。稀释第 1 步 PCＲ反应产物，进行第 2 步 PCＲ检测，
第 2 步引物能够特异识别甲基化和未甲基化的模板。引物设计
参考文献［11］引物序列，退火温度，产物大小。见表 1。
收稿日期:2013-01-09; 修订日期:2014-09-06
基金项目:科技部省部共建新疆生物资源基因工程重点实验室开放基金资助( No． XJDX0201 － 2011 － 04) ;
作者简介:吕 芳( 1983-) ，女( 汉族) ，新疆伊犁人，苏北人民医院助理研究员，博士学位，主要从事生殖内分泌研究工作．
* 通讯作者简介:李江伟( 1967-) ，男( 汉族) ，新疆乌鲁木齐人，新疆大学生命科学与技术学院教授，博士学位，主要从事肿瘤免疫研究工作．
表 1 MSP和 ＲT － PCＲ引物序列，退火温度和产物大小
Gene
Forward
primer(5＇－ 3＇)
Ｒeverse
primer (5＇－ 3＇)
Annealing
temperature /℃
Product
size /bp
P16 N:巢式引物 GGAGAGGGGGAGAGTAGGT CTACAAACCCTCTACCCACCT 60 C 208
U:非甲基化引物 TGGGGAGTAGTATGGAGTTGGTGGT CAACCCCAAACCACAACCATAA 62 C 81
M:甲基化引物 CGGGGAGTAGTATGGAGTCGGCGGC GACCCCGAACCGCGACCGTAA 62 C 81
mＲNA CGGAAGGTCCCTCAGACATC TCATGAAGTCGACAGCTTCCG 52 C 385
G3DPH TTGCAACTGTTTTAGGACTTT AGCATTGGGAAATGTTCAAGG 52 C 568
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时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 9 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 9
1． 4 半定量分析 P16 mＲNA 变化 雪莲总黄酮处理 KYSE510
后，反转录检测 P16 基因表达情况。雪莲总黄酮 50μg /ml 处理
KYSE510 细胞 2d，常规收集培养瓶中的细胞，TＲIZOL 法提取细
胞 ＲNA。采用 25μl 反应体系，按照 Invitrogen ＲT － PCＲ 试剂盒
操作指南进行。以第 1 链 cDNA 为模板分别检测 P16 和 G3DPH
变化，PCＲ反应体系为:95 ℃预热 3min;95 ℃变性 40s，52 ℃退火
30s，72 ℃延伸 40s，扩增 30 个循环;72 ℃延伸 10min，1%琼脂糖
凝胶电泳检测扩增条带。
1． 5 流式分析细胞凋亡 收集雪莲总黄酮处理 2d后的 KYSE510
细胞，离心后弃上清，PBS洗 3 次，用 300μl PBS将细胞悬浮，加入
700μl预冷无水乙醇，3 000 r /min，离心 5min，弃上清，加入 800μl
PI，轻轻吹散混匀后，流式细胞仪检测。
1． 6 统计学方法 数据采用 office excel统计学处理，进行组间方
差齐性检验。
2 结果
2． 1 雪莲总黄酮抑制 DNA甲基化酶 M． Alu I 活性 雪莲总黄酮
处理组与对照组比较 λDNA被 AluⅠ酶切为很多条带，表明雪莲
总黄酮影响了 M． AluⅠ活性，使 λDNA 不能被 M． AluⅠ修饰，从
而被酶切。50μg /ml 与 100μg /ml 雪莲总黄酮比较，λDNA 均被
AluⅠ酶切条带为弥散的条带，二者无明显差异，因此后续实验采
用 50μg /ml雪莲总黄酮作用浓度。顺铂处理组 λDNA 呈现弥散
条带，表明顺铂能够完全阻止 M． AluⅠ对 λDNA 甲基化修饰作
用，酶切后完全降解了 λDNA。同时 DAC，金合欢素，骆驼蓬碱处
理组，λDNA未被酶切，说明这些药物对甲基化酶 M． AluⅠ活性
无影响，不能抑制 DNA 甲基化酶对 λDNA 的甲基化修饰作用。
见图 1。
1 － λDNA;2 － 50μmol /L DAC;3 － 75mmol /L 顺铂;
4 － 100μg /ml金合欢素;5 － 50μg /ml雪莲总黄酮;
6 － 100μg /ml骆驼蓬碱;
7 － 100μg /ml雪莲总黄酮;
8 － 1μl AluⅠ酶切无药物作用的 λDNA
图 1 DNA甲基化酶活性分析
2． 2 雪莲总黄酮可以使 KYSE510 细胞中甲基化沉默的抑癌基
因 P16 恢复表达 我们采用 MSP 和 ＲT － PCＲ 方法检测 50μg /ml
雪莲总黄酮处理 KYSE510 细胞 2 d 后 P16 基因表达情况，发现
P16 未甲基化的状态表达明显增多，mＲNA 能够重新表达。同时
KYSE510 细胞形成集落能力受到抑制，形成集落明显减小。见图
2。
2． 3 雪莲总黄酮使细胞凋亡增多 雪莲总黄酮作用 KYSE510 癌
细胞之后，凋亡率增加。流式结果表明，50μg /ml 雪莲总黄酮处
理 KYSE510 细胞 2 d后细胞凋亡率为(6． 4 ± 0． 8)%显著高于对
照组(3． 3 ± 1． 6)%，(P ＜ 0． 05) ，50μmol /L DAC 处理之后细胞
凋亡率(9． 8 ± 0． 7)%极显著高于对照组(3． 3 ± 1． 6)% (P ＜
0． 01)。DAC 处理组凋亡率显著高于雪莲总黄酮处理组(P ＜
0． 05)。
A －无处理对照组;B － 50μg /ml雪莲总黄酮;C － 50μmol /L DAC
图 2 雪莲总黄酮处理 KYSE510 细胞 2 d后 P16 基因的表达及细胞形态
A －无处理对照组;B － 50μg /mL雪莲总黄酮;C － 50μmol /L DAC
图 3 雪莲总黄酮处理 KYSE510 细胞 2 d后凋亡变化
3 讨论
随着年龄的增加人类基因甲基化 CpG 岛会逐渐增多，导致
很多基因的表达沉寂，尤其是一些抑癌基因的表达，这可能导致
除癌症以外的多种慢性疾病［1］。植物药理活性成分的应用能够
减慢甲基化对基因的沉寂速度，因此对多种慢性疾病治疗有益。
研究发现杨梅叶总黄酮类化合物能够显著的抗小鼠抑郁［11］，绿
茶的儿茶酚［12］、大豆异黄酮［13］、槲皮素［14］、南美棯黄酮［15］、苹果
多酚［16］、lunasin多肽［17］能通过表观遗传调节发挥抗癌作用。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 9 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 9 期
一般抗癌药物、激素制剂、放疗等的作用机制之一，都是通过
诱导各自敏感的肿瘤细胞发生凋亡来达到治疗目的，而植物活性
药理成分能够通过调节表观遗传作用治疗癌症的机制优先在肿
瘤细胞中抑制细胞增殖和诱发细胞程序性死亡，进而调节细胞周
期进程与细胞凋亡来调节基因表达［18］。我们研究新疆多种中草
药活性药理成分金合欢素，雪莲总黄酮，骆驼蓬碱对 DNA甲基化
酶活性的影响，发现雪莲总黄酮对 DNA 甲基化酶 M． AluⅠ有明
显抑制作用。雪莲总黄酮与顺铂等化疗药物比较，既能够使
λDNA不被 M． AluⅠ甲基化修饰，也不像化疗药物作用剧烈，雪
莲总黄酮处理后细胞形态变化缓慢，不会出现大批死亡现象。同
时 MSP检测结果显示雪莲总黄酮能够使 KYSE510 细胞未甲基化
P16表达增加，P16 mＲNA恢复表达。细胞形态学和流式细胞检
测结果显示癌细胞增殖速率减慢，细胞凋亡增加，说明雪莲总黄
酮抑制癌细胞增殖。
此外，本文采用 M． AluⅠ甲基化酶与限制性 AluⅠ内切酶分
析药物对 DNA甲基化酶活性的影响能够初步用于筛选能够抑制
DNA甲基化酶活性的药物。该方法具有操作简便快捷，特异性
强的优点，与传统甲基化酶活性分析方法相比，避免了放射性标
记底物、聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射性自显影等复杂的操作，为
筛选针对基因甲基化异常引起的恶性肿瘤的治疗药物提供新的
参考方法［7］。
本研究提示雪莲总黄酮将有可能作为影响表观遗传修饰药
物用来治疗癌症，同时为其他中药有效成分抗癌研究提供参考依
据。本研究所用的雪莲总黄酮为混合物，哪种单体黄酮发挥主要
的抑制甲基化酶作用，目前还不了解，需要进一步研究。此外，雪
莲总黄酮能使因高甲基化状态表达沉默的基因重新表达，对表观
遗传修饰的组蛋白乙酰化修饰是否也有影响需进一步探
讨［19，20］。
致谢:本研究部分实验是在中国协和医科大学肿瘤
研究所杨治华教授实验室完成，在实验中得到了该所杨
治华教授、冉宇靓教授等老师和同学的帮助，特此感谢!
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