全 文 ：食用菌学报 2009.16(1):31～ 36
收稿日期:2008-10-20原稿;2009-01-10 修改稿
基金项目:国家“ 863”计划项目(编号:2007AA021506), 上海市科技兴农重点攻关项目[ 编号:沪农科攻字(2006)第
3-1 号] , 上海市农业科学院发展基金[编号:农科发 2007(08)]的部分研究内容
作者简介:付绍春(1971-), 男 , 2008 年毕业于湖南农业大学 ,硕士 ,副研究员 ,主要从事菌根食用菌研究工作 , 发表
主笔论文 10 多篇。
＊本文通讯作者
文章编号:1005-9873(2009)01-0031-06
美味牛肝菌与马尾松幼苗无菌条件下的外生菌根合成
付绍春 , 谭　琦＊ , 陈明杰 , 尚晓冬 , 蔡令仪 , 张美彦
(农业部应用真菌资源与利用重点开放实验室 , 上海市食用菌工程技术研究中心 ,
上海市农业遗传育种重点开放实验室 , 上海市农业科学院食用菌研究所 , 上海 201106)
摘　要:在改进菌根合成技术的基础上 , 成功获得了美味牛肝菌(Boletus edulis)与马尾松(Pinus
massoniana)幼苗的外生菌根 ,描述了人工条件下合成的外生菌根形态。针对菌根合成基质 、宿主苗龄和接种
方式进行了正交实验 ,通过对苗成活率 、培养 6 个月的树苗地径和苗高 、茎根比 、菌根根尖数 、菌根感染率 6 个
指标的综合分析 ,结果在菌根合成中 ,采用模拟自然土壤结构的二层基质体系的菌根合成效果明显优于目前
广泛使用的单层泥炭蛭石基质 , 且向基质中添加海泡石矿粉更有利于外生菌根菌的形成和发育。
关键词:菌根合成基质;海泡石矿粉;松树苗龄;接种方式;菌根感染率
　　世界上有记录的食用菌大约有 2500 种 ,其
中最昂贵也最受欢迎的大多属于菌根菌[ 1] 。自
从 1978 年法国首次取得黑孢块菌(Tuber
melanosporum)栽培成功以来[ 2] ,目前仍只有少
数菌根菌栽培成功[ 3 ～ 7] 。在菌根食用菌栽培过程
中 ,菌根合成和培养菌根苗的成功是栽培的基
础[ 8] 。自从 MELIN 1922 年应用沙和棉花塞保
持长颈瓶内的无菌状态 、发明首个外生菌根合成
装置到今天 ,外生菌根合成技术的研究取得了长
足进步[ 9 ～ 11] 。本研究的目的是在已有菌根合成
技术的基础上 ,对原有菌根合成基质和方法进行
改进 ,以图更有效地获得美味牛肝菌(Boletus
edulis)与马尾松(Pinus massoniana)幼苗的外生
菌根 ,并为外生菌根合成的技术体系提供参照。
1　材料与方法
1.1 供试菌株
　　美味牛肝菌(Boletus edulis)(菌株号 YNB-
200)子实体于 2006年8月 20日采自云南保山施
甸县小官寺云南松林中 ,由李泰辉研究员鉴定;
组织分离菌丝采用 ITS 序列分析方法鉴定与子
实体一致 ,分离获得菌种保藏在中国农业微生物
中心上海食用菌分中心 ,保藏号 SIEF4001 , Ohta
培养基的菌丝形态如图 1(见封三)。
1.2 供试植物种子
　　马尾松(P inus massoniana)种子 , 笔者于
2006年购于湖南省城步县马尾松优良种子园 ,保
存于(4±1)℃的冰箱中 。
1.3 培养基
1.3.1 琼脂及液体培养基
　　①改良 MMN [ 12] ;②Ohta 琼脂培养基[ 3] ;
③1.2%琼脂培养基[ 13] ;
液体培养基:①号培养基不加琼脂。上述培
养基于 121 ℃灭菌 30 min。
1.3.2 菌根合成基质
　　泥炭(东北产 ,购于园林公司)、珍珠岩(河南
产 ,购于园林公司)、蛭石(河北产 , 购于园林公
司)、红壤土(采于湖南省林业科学院后山林中 B
层土壤)、石英砂砾(部分采于海南三亚海滩 ,部
分市购混合后使用)、海泡石矿粉(购于湖南湘潭
乌石镇海泡石厂 , 200目),分别晒干 ,用 2 mm 筛
孔的土样筛过筛备用。
基础基质 1:泥炭 60%、珍珠岩 20%、蛭石
20%混匀 ,加入液体培养基(其中仅碳源稀释十
倍),使基质含水量达 60%。
基础基质 2:泥炭 60%、珍珠岩 20%、蛭石
食　用　菌　学　报 第 16 卷
20%,另加入 0.5%的海泡石矿粉混匀 ,加入蒸馏
水使基质含水量达 60%。
基础基质 3:红壤土 50%、石英砂砾 40%、泥
炭 10%混匀 , 加入适量蒸馏水 ,使基质含水量
达 40%。
根据试验设计 ,采用大试管(30 mm×200 mm)
准备菌根合成基质 。试管中先装入 42 mL 基础
基质 3 、再装入 14 mL 基础基质 1(第一种基质)
或基础基质 2(第二种基质),组成两种双层基质;
另外准备单层基质 ,相同大小试管中装入 56 mL
基础基质 1(第三种基质)。所有试管采用 2层透
气塑料膜(北京市振泰园艺设施公司 , 12 mm ×
12 mm)外加 2层报纸封口;125 ℃130 min 灭菌
2次 ,中间间隔 24 h ,灭菌后冷却备用。
1.4 马尾松无菌苗的准备
　　根据[ 13 , 14] 的方法进行改进 ,选取饱满 、
无虫害的马尾松种子 ,在 30 ℃温水中浸泡 16 ～
24 h后于 20 ℃的 70%酒精中浸泡20 s ,在 30%过
氧化氢中振荡浸泡 30 min ,用无菌蒸馏水振荡冲洗
3 ～ 4次 ,并在超净台上紫外光照射10 min ,均匀放
入已灭菌的装有③号琼脂基的罐头瓶　　
内 ,并置于光照培养箱中 , 在白天 16 h 、光照
6 500 Lux ,晚上8 h 、黑暗 ,温度(24±2)℃,湿度为
(70±5)%条件下培养 3 ～ 15 d ,按种子发芽和芽长
情况分组进行菌根合成实验 ,种苗培育如图 2(见
封三)。
1.5 菌丝体准备
　　根据[ 14]的方法进行改进 ,将 5个长满活化菌
丝的平皿中培养物切成 5 mm3 大小的小片接入
含有100 mL 液体培养基的 250 mL 三角瓶中 ,在
(24±2)℃,150 r/min 条件下培养 15 d。离心收
集菌丝 , 悬浮在 150 mL 新鲜液体培养基中 ,
12 500 r/min ,10 s匀浆 2次 ,重新悬浮在 600 mL
的液体培养基中 ,并分装在 4个 500 mL 的三角瓶
中 ,每瓶 150 mL ,120 r/min条件下继续培养 7 d。
用孔径为 24 μm×30 μm的尼龙网收集获得菌丝 ,
300 mL灭菌蒸馏水冲洗 ,悬浮在 150 mL水中制
成菌丝悬液 ,用于菌根合成实验。
1.6 菌根合成实验
　　以菌根合成基质 、宿主植物苗龄和接种方式为
试验因素按 L9(34)[ 15] 进行正交实验 ,因素水平设
置见表 1 ,每个处理重复 20次。
表 1　菌根合成正交试验因素水平表
Table 1　Factors and levels in the orthogonal test for mycorrhizal synthesis
水平
Levels
因素 Factors
A
菌根合成基质
Substr ate
B
宿主植物苗龄
Age of host plant
C
接种方式
Inoculation procedure
1
第一种基质
Type 1
刚露白 ,芽长<0.5 cm
Shoot <0.5 cm
先接菌丝 , 5～ 7 d后接种苗
Substr ate in growth tube inoculated with fungal mycelium
followed by tr ansfer of pine seedlings 5 ～ 7 d later
2
第二种基质
Type 2
0.5 cm<芽长<2.0 cm
Shoot >0.5 cm<2.0 cm
种苗 、菌丝同时接种
Pine seedlings transferred to growth tubes followed
immediately by inoculation with fungal mycelium
3
第三种基质
Type 3
芽长>2.0 cm ,未生侧根
Shoot >2.0 cm , no side root
先接种苗 , 5 ～ 7 d 后接菌丝
Pine seedlings tr ansfe rr ed t o growth tubes followed by
inoculation with fungal mycelium 5 ～ 7 d later
　　将无菌培养的马尾松幼苗和 10 mL 菌丝悬
液分别按照正交实验组合接入试管的菌根合成
培育基质中 ,将接好菌丝或幼苗的试管装有基质
的部分用锡箔纸或废报纸包裹 ,放入装有水的浅
盆中 ,放在培养架上培养(见封三图 3),白天 18 h 、
温度为(25±2)℃、约 12 500 Lux光照 ,晚上暗光
6 h 、温度为(23±2)℃,湿度 65%～ 85%的生长
室中培养 。菌根苗的合成过程中根据需要添加
蒸馏水或碳源稀释十倍的液体培养基(针对第一
种基质的处理)。
1.7 合成外生菌根效果的检查
1.7.1 合成菌根形态及解剖结构观测
　　菌根清洗方法参考[ 16 , 17] , 取接种培养 6
个月的正常苗 ,向试管中注入纯净水淹没基质 ,
放入 10 ℃以下的冰箱中 12 h 以上 ,使水能充分
的浸润试管底部 ,然后将菌苗从试管慢慢取出 ,
32
第 1 期 付绍春 , 等:美味牛肝菌与马尾松幼苗无菌条件下的外生菌根合成
完整地放入0.8 mm网孔的土壤筛中 ,放在自来水
龙头下用轻柔的水流冲洗 ,仔细地将土壤筛中散落
的根碎片及根尖与完整的根系一起放入小滤网中 ,
置入盛有纯净水的烧杯中 ,在超声波清洗器中轻柔
的漂洗 ,在烧杯中加 2滴吐温-20或肥皂水 ,洗去粘
附在根系上的其它颗粒。用细镊子在套色拼隔版
显微镜下收集根系统 ,小块的菌根根尖用手选 ,在
体视显微镜下检查菌根结构 ,参照[ 16 ,18 ,19]的方
法对菌根形态特征进行描述归类。菌套和外部元
素(菌丝 、菌索等)的解剖结构均在显微镜下检查 、
测量 、统计 。观测的切片材料主要采用徒手切片法
和石蜡切片法取得。
1.7.2 合成菌根苗的检查指标
　　参照[ 5 ,11]的方法 ,对苗成活率 、地径(精确
到 1 mm)、苗高(精确到 1 mm)、菌根根尖数 、茎
根比 、菌根感染率进行统计 。由于以上指标含有
损伤检测 ,每个处理随机抽取 5支试管 ,统计其
平均值。
1.8 统计分析
　　用统计分析软件 SPSS10.0进行方差分析。
2　结果与分析
2.1 不同处理对菌根苗合成的影响
　　以接种 6个月松苗成活率 、地径 、苗高 、茎根
比 、菌根根尖数和菌根感染率为考察指标的实验
结果见表 2 。
2.2 试验处理方式的综合评价
　　综合表 2 的结果对各因素的不同水平进行
分析 ,结果见表 3。
2.2.1 菌根合成基质
　　由表 2可知 ,菌根合成基质对 6个指标中的
菌根根尖数 、茎/根比 、菌根感染率 3个指标的影
响达到显著水平;由表 3可知 ,这3项指标中又以
A2为最优。其中 , A1和 A2的茎根比符合优质
苗木的标准(1.7 ～ 2.2);苗成活率也以 A2 为最
优。A3基质是现在国内外广泛使用的基质[ 2 0] ,
本试验中 A3基质确实对植物地上部分的生长有
明显促进作用 , 但可导致植株茎根比明显偏大
(>6),对外生菌根菌的生长不利 ,在以生产菌根
食用菌子实体为目的的菌根苗培育时不是最好
表 2　菌根合成正交实验结果
Tabel 2　Results of orthogonal testing [ L9(34)] of mycorrhizal synthesis
试验
编号
Tr eatment
No.
试验因素
Test factors
A B C
指标
Ind ices
苗成活率(%)
Plan t survival
rat io
地径(mm)
Roots tock
diameter
苗高(mm)
Shoot
h eigh t
菌根根尖数
Number of
mycorrhizae
茎根比
Ratio of shoo t/
root biomass
菌根感染率(%)
Rat io of infected/
non-infected root tips
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1 1 1 50 18.7 76.7 241 2.4 70.0
1 2 2 80 20.0 70.0 85 2.5 56.7
1 3 3 81 19.6 120.3 206 1.9 71.0
2 1 2 87 13.3 75.6 144 1.7 66.0
2 2 3 87 13.7 58.3 214 1.8 66.8
2 3 1 100 19.7 80.0 458 1.7 91.7
3 1 3 63 14.0 104.6 26 5.8 31.7
3 2 1 86 15.6 90.0 70 8.3 30.0
3 3 2 87 20.0 107.0 54 7.9 21.7
各项因素的影响排序
Factor ranking
B>A>C B>A>C B>A>C A>C>B A>C>B A>C>B
各项因素差异显著值
Signi ficance value
A 0.182
B 0.148
C 0.596
交叉项＊＊
Cross re action＊＊
A 0.167
B 0.132
C 0.351
交叉项＊＊
Cross rea ction＊＊
A 0.208
B 0.204
C 0.571
交叉项＊＊
Cross reac tion＊＊
A 0.048＊
B 0.134
C 0.084＊
交叉项＊＊
Cross reac tion
＊＊
A 0.015＊
B 0.421
C 0.342
交叉项＊＊
Cross react ion
＊＊
A 0.021＊
B 0.331
C 0.175
交叉项＊＊
Cross rea ction
＊＊
各项因素的最佳组合
Best th eor etical combinat ion
A2B3C2 A1B3C1 A3B3C3 A2B3C1 A3B2C1 A2B3C1
　　＊差异显著水平 P<0.05;＊＊差异显著水平 P<0.01
＊Significance P<0.05;＊＊Sign ificance P<0.01
33
食　用　菌　学　报 第 16 卷
表 3　不同因素水平的综合评价
Table 3　Integration analysis of data from all treatments using different levels of each factor
处理
Factor level
指标 I ndex
入选最佳
组合次数
Best
combina tion
苗成活率
(%)
Plant survival
r atio
地径
(mm)
Rootstock
diame ter
苗高
(mm)
Shoot
height
菌根根尖数
Number of
mycor rhiza
茎根比
Ra tio of
sh oot/ r oot
biomass
菌根感染率(%)
Ratio of
inf ected/ non-
inf ected root tips
A1 1 70 19.0 89.0 177.4 2.3 66
A2 3 90 15.6 71.3 271.9 1.7 70
A3 2 80 16.5 100.5 50.3 7.3 30
B1 0 70 15.3 85.6 137.2 3.3 60
B2 1 80 16.4 72.8 123.1 4.2 50
B3 5 90 19.8 102.4 239.3 3.8 60
C1 4 80 18.0 82.2 256.4 4.1 60
C2 1 80 17.8 84.2 94.4 4.0 50
C3 1 80 15.8 94.4 148.8 3.2 60
的选择。实验结果表明 ,二层基质较一层基质更
利于美味牛肝菌和松树苗的菌根合成 ,在二层基
质中使用海泡石矿粉效果更好。
2.2.2 植物苗龄
　　由表 2可知 ,植物苗龄对 6个指标的影响均
未达到显著水平。根据表 3的统计 ,综合各项指
标 ,在菌根合成用苗上以 B3效果更好。
2.2.3 接种方式
　　由表 2可知 ,接种方式对 6个指标的影响仅
菌根根尖数达到显著水平 , 这项指标中又以 C1
最优 。根据表 3数据 ,综合各项指标在菌根合成
过程中 ,采用 C1效果较好。
2.3 美味牛肝菌与马尾松幼苗合成外生菌根的
形态结构
　　培养 6个月的松树苗形成的菌根的形态特
征:外生菌根单轴羽状 ,二次缺乏或较少 ,主轴
直径 1.1 ～ 1.3 mm ,黄白色 ,随着菌根苗的成
熟 ,颜色变得更深 ,根尖白色 ,膨胀 ,棒状 。未分
枝根的表面光滑 、有光泽 、清晰 ,菌套不透明 ,未
见皮层细胞 。外延菌丝缺少。菌丝套为密丝组
织 ,无锁状联合 。未发现有菌索和菌核(见封三
图 5 、6 )。
菌根横切面形态:菌丝套厚 20 ～ 26μm ,菌丝
套均为环状结构的密丝组织层 ,菌丝外层菌套的
所有密丝组织都带有少量 calyptr a cells残余 ,哈
蒂氏网存在于 1到 2层皮层细胞间 ,靠近内皮层
没有(见封三图 7 、8)。
菌根纵切面形态:菌套上可见不同的层 。外
部菌套密丝组织(见封三图 9)。
3　讨　论
3.1 菌根合成基质对菌根合成效果的影响
　　我们的实验证明在菌根合成的基质中添加
海泡石矿粉有利于外生菌根菌的形成和发育 。
ROSLING [ 20]的研究也表明在加入矿粉的基质中
菌根菌要比在泥炭中生长得好 ,外生菌根菌侵染
根尖初期与土壤层中的矿物元素有关 ,生长基质
中矿物成分对外生菌根菌菌丝的生长有刺激作
用。 JONGMANS 等发现外生菌根菌的菌丝一
端连接树木的根系 ,另一端与岩石的表面紧密相
接 ,树木便可直接吸收由菌丝从岩石中溶解吸收
并传输过来的 Ca2+和 Mg2+等矿物质[ 21] 。
BARNET T 曾通过对大量文献的分析与研
究 ,认为以泥炭和蛭石配合的基质能稳定生产高
质量的苗木[ 22] 。在林业生产及研究的过程中大
量采用了这一最佳组合用于菌根合成[ 23 ～ 25] 。本
实验首次模拟自然环境 ,将外生菌根合成基质分
成两层 ,上层为相当于腐殖层的泥炭和蛭石混合
基质 ,下层为加入石英砂砾的红壤土混合基质 ,
结果显示这样的基质更有利于菌根合成。分析
原因 ,上层基质可能有利于共生菌丝侵入宿主植
物的根皮层 ,下层基质有利于侧根的形成和外延
菌丝的生长。
3.2 菌根=促进植物生长?
　　菌根是菌与植物共生的结果 , 在这个过程
中 ,菌根通过菌丝从土壤中吸收水分和矿质元素
促进植物生长 ,而植物则提供给菌丝生长必须的
碳水化合物[ 17] 。当环境有利于一方的生长时 ,会
34
第 1 期 付绍春 , 等:美味牛肝菌与马尾松幼苗无菌条件下的外生菌根合成
表现出一种偏共生[ 1] 。
地径和苗高是林业生产上衡量苗木质量的
重要指标[ 26] ,本研究的目标是地下生物量最大 、
茎根比的比值越小越好 ,直接表现为菌根根尖数
多 、菌根感染率高 、根体积大 。试验结果表明菌
根发育好的菌根苗 ,其茎根比较小 ,这可能是因
为大量菌根生长的过程能产生重度的碳饥渴 ,促
使大量光合作用产物转移并供给菌根菌使用的
原因[ 27] ,这也说明 ,接种大量菌根菌并不一定能
促进植物的个体生长。
3.3 最佳组合
　　实验结果表明菌根合成基质是影响菌根合
成的主要因素 ,与土壤条件是菌根合成的主要因
素[ 26]的论断相一致。在菌根合成时 ,采用加入海
泡石矿粉的二层基质 ,并采用芽长 2 cm 以上苗
龄的宿主植物 ,先接菌丝体 , 5 ～ 7 d后再植入幼
苗的措施最佳。这个结果与之前报道的松口蘑
接种上用较大的幼苗是一致的[ 13 , 28 , 29] ,接种时先
接菌种 ,后植苗为最佳 ,这可能是因为我们用的
是液体菌种 ,含水量较高 ,菌丝有一个 5 ～ 7 d的
萌发恢复过程 ,这时接入幼苗 ,正好有利于菌丝
与幼苗的根接触。
致谢:在试验过程中 ,新西兰皇家作物与食品研究所
王云博士和瑞典乌普萨拉大学 DANE LL 博士惠赠他们
宝贵的资料。周朴华老师和谭著明老师在试验过程中给
予宝贵建议 ,在此一并表示感谢。
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[本文编辑] 　曹　晖
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