全 文 ：基金项目:教育部 2007年高等学校科技创新工程重大项目。
作者简介:黄美玲(1985-),女 ,湖南人,研究生 ,从事水生生物学研究。
通讯作者:黎祖福 ,研究员 ,从事水生生物学研究 , E-m ail:lsslz f@mail.sysu.edu.cn
doi:10.3969/ j.issn.1004-6755.2010.04.001
小球藻生物量的快速测定技术研究
黄美玲 ,何 庆 ,黄建荣 ,黎祖福
(中山大学生命科学学院 ,广东 广州 510275)
摘 要:选取 540 ～ 700 nm 中 11 个波长对不同密度的小球藻进行吸光值测定 ,同时对其进行精确计数和干重
测定 ,结果表明:(1)在 11 个波长下 , 小球藻吸光值与细胞密度存在理想的线性关系 , 线性系数 r>0.999 , 其中
以 680 nm 波长处最为灵敏 , 其次为 540 nm;(2)小球藻吸光值与细胞干重之间同样存在良好的线性关系:Y
(g/ L)=0.25 X(OD680)-0.001 5 , 线性系数 r>0.999。表明光密度法能快速且准确地测定小球藻生物量。
与传统的细胞计数法和叶绿素 a测定法相比 , 光密度法更方便 、快捷 ,能极大地提高实验效率和准确度。
关键词:小球藻;生物量细;胞计数;光密度
小球藻(Chlorella sp p.)为绿藻门 、绿藻纲 、
绿球藻目 、卵孢藻科 、小球藻属的单细胞藻类 ,直
径为 2 ～ 12 μm[ 1] 。在活性物质提取[ 2] 、水产养
殖 、环境治理等诸多方面具有很高的应用和研究
价值 。在科学研究与生产中 ,对小球藻生物量的
掌握必不可少 ,但由于小球藻个体微小 ,需借助高
倍显微镜才能分辨出个体[ 3] ,因而对小球藻生物
量的测定存在一定困难。传统的生物量测定方法
有:细胞计数法 、叶绿素 a测定法[ 4] 和干重法 。但
都步骤繁琐 ,工作量大 。光密度法是利用小球藻
在某一波长下的光吸收值来测定细胞密度的方
法。以往利用光密度法对小球藻生物量进行测定
的有少量报道 ,但测定时选取的波长具有随意
性[ 4] 。为了确定光密度法测定所需的最适波长 ,
本文选取 540 ～ 700 nm 中11个波长进行测定 ,旨
在寻找利用光密度法测定小球藻的最佳波长 。同
时 ,为了解决生产上大规模培养小球藻对其干重
准确掌握难的问题 ,本文对干重和吸光值进行线
性回归分析 ,以期寻找一条根据光吸收值便可推
算小球藻的干重的便捷方法。
1 材料与方法
1.1 材料
藻种:小球藻。
培养基:采用 BBM(bold′s basal media)培养
液 , 配方:NaNO3 0.25g/L、CaCl2 ·2H2O 0.025 g/L、
MgSO4·7H2O 0.075 g/L 、K2HPO4·3H2O 0.075 g/L 、
KH2PO4 0.175 g/L、NaCl 0.025 g/L、生物素 2.5×10-7
g/L、维生素 B1 0.001 g/ L、维生素B12 1.5×10-7 g/L。
每 1 L 水中加 6 mL PIV金属溶液 。PIV 金属溶
液:1 L 水中加入 0.75 g EDTA -2Na ,充分溶解
后加入下列物质:FeCl3 ·6H 2O 97 mg 、MnCl2 ·
4H 2O 41 mg 、ZnCl2 5 mg 、CoCl2 · 6H 2O 2 mg 、
Na2MoO 4 ·2H 2O 4 mg 。
实验仪器:721型分光光度计 、血球计数板 、
显微镜 、烘箱 、高速离心机 、电子天平。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞计数法 采用血球计数板对 6个不
同梯度的小球藻液进行细胞计数[ 5] ,重复三次 ,取
平均值。
1.2.2 光密度法 利用分光光度计在 540 、550 、
560 、600 、620 、635 、650 、660 、665 、680 、700 nm 波
长处测定各个梯度小球藻液的吸光值 ,当吸光值
大于 0.5时 ,稀释一定倍数后测定 ,以 BBM 培养
液做参比 。
1.2.3 干重法 将 15 mL 小球藻液加入烘干至
恒重的离心管中 , 3 000 r/min 离心 30 min ,倒去
上清 ,敞口放置于 80 ℃烘箱 , 约烘 30 h , 至恒
—1—
《河北渔业》2010年第 4期(总第 196期) ★研究与探讨
重[ 5] ,每个梯度三个重复 ,称重后取平均值 。
2 实验结果
2.1 细胞密度与不同波长条件下吸光值之间的
线性关系
表 1所示为不同梯度的小球藻经计数后测得
的细胞密度和不同波长下的吸光值 。结果表明 ,
在不同波长条件下 ,小球藻吸光值各不相同 ,其中
以 680 nm 下的吸光值最高 ,其次为 540 nm 和
700 nm ,说明在 680 nm 测定时最为灵敏。
表 1 不同浓度梯度的小球藻密度与吸光值
1 2 3 4 5 6
细胞密度
/ 107 · L-1 76 203 320 469 726 928
吸光值
540 nm 0.04 0.084 0.14 0.211 0.318 0.411
550 nm 0.038 0.082 0.139 0.205 0.314 0.406
560 nm 0.038 0.082 0.138 0.202 0.311 0.402
600 nm 0.039 0.081 0.134 0.202 0.308 0.4
620 nm 0.038 0.082 0.134 0.201 0.306 0.398
635 nm 0.038 0.082 0.134 0.199 0.303 0.394
650 nm 0.039 0.082 0.135 0.202 0.309 0.4
660 nm 0.039 0.082 0.136 0.204 0.309 0.405
665 nm 0.039 0.083 0.139 0.206 0.314 0.41
680 nm 0.041 0.088 0.147 0.221 0.335 0.434
700 nm 0.04 0.085 0.141 0.211 0.312 0.41
680 nm 波长下 ,小球藻细胞密度与吸光值之
间的关系如图 1所示:
图 1 小球藻在 680 nm下的标准曲线
由图 1可看出 ,在 680 nm 条件下 ,小球藻细
胞密度与吸光值之间具有良好的线性关系 ,表明
680 nm处测定小球藻细胞密度是完全可行的。
表 2所示为不同波长下小球藻细胞密度与吸
光值之间的关系 , y 为细胞密度 L-1(107 cells/
L), x 为吸光值 。结果表明:即使在不同的波长条
件 ,小球藻细胞密度与吸光值之间也存在良好的
线性关系 ,相关系数均在 0.999以上。
表 2 细胞密度与吸光值在不同波长下的线性关系
回归方程 判定系数
540 nm y=2 268.7x-1.363 4 R2 =0.999 3
550 nm y=2 294.9x+0.697 8 R2 =0.999 4
560 nm y=2 320.4x+0.019 6 R2 =0.999 5
600 nm y=2 334.8x+0.613 3 R2 =0.999 2
620 nm y=2 348.6x-0.011 5 R2 =0.999 4
635 nm y=2 375.4x-1.382 3 R2 =0.999 5
650 nm y=2 334.5x-0.342 8 R2 =0.999 4
660 nm y=2 312.4x+0.701 6 R2 =0.999 1
665 nm y=2 281.4x+0.685 5 R2 =0.999 3
680 nm y=2 147.6x+0.453 R2 =0.999 4
700 nm y=2 289x-3.220 9 R2 =0.999 0
2.2 680 nm条件下的吸光值与藻细胞干重之间
的关系
图2所示 ,在 680 nm 波长条件下小球藻的光
吸收与细胞干重也存在良好的线性关系 。
图 2 小球藻 680 nm光吸收与干重的标准曲线
3 讨论
光密度法是利用小球藻在分光光度计某一波
长照射下进行光吸收 ,光吸收值与小球藻的密度
存在对应关系 。由于血球计数板可对小球藻进行
准确计数 ,不同密度的小球藻经准确计数和吸光
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《河北渔业》2010年第 4期(总第 196期) ★研究与探讨
值测定后可得到标准曲线 ,小球藻生物量即可通
过测定光吸收值后换算得来。
细胞计数法是利用血球计数板在高倍镜下对
小球藻直接计数 ,受人为因素影响较大 ,在样品较
多的情况下 ,直接计数工作量大 ,耗时长 ,对一个
样品进行准确计数至少需要 5 min ,测定大批量
样品生物量时 ,细胞计数法要耗费研究者大量的
时间 ,并且在细胞密度过低和过高时误差大[ 6] ;叶
绿素 a含量测定法需要对藻液进行研磨 ,对叶绿
素 a 进行提取 ,经分光光度计比色后换算出叶绿
素 a 含量 ,再利用制作的标准曲线换算出藻的生
物量[ 4] ,过程非常繁琐 ,耗时长 ,实现一次叶绿素
a含量的测定需要 2 ～ 3 h;干重法需对小球藻进
行离心 ,再烘干至恒重 ,误差较大 ,烘干过程达 8
～ 30 h 不等 , 耗时耗能源 。与传统的细胞计数
法 、叶绿素 a 测定法和干重法相比 ,光密度法不需
要对样品进行任何前处理 ,且无损伤 ,结果精确 、
重复性强 ,测定一个样品的时间只需几秒钟 ,可以
为研究者节约大量时间和精力 ,优势显著。
以往对小球藻生物量的测定 ,国内学者多使
用细胞计数法[ 7-8] ,使用光密度法测定的较少 ,且
测定时使用的波长具有随意性 ,如马宇翔[ 9] 、刘学
铭[ 10] 、刘世名[ 11] 、李兴武[ 12] 在测定小球藻生物量
时采用的波长为 540 nm ,沈萍萍[ 13] 、陈春云[ 14] 采
用 680 nm 波长 ,董正臻[ 4] 等采用 672 nm 波长 ,
陶永华[ 15] 等采用 665 nm 波长。因此 ,确定一个
最佳测定波长对于完善光密度法十分必要。确定
最佳测定波长 ,应以吸光值最高 、反应最为灵敏的
波长为最佳。本实验对 540 ～ 700 nm 中 11个波
长进行筛选 ,确定出 680 nm 处为小球藻测定的
最佳波长 ,这与沈萍萍等[ 13] 得出的微藻在 680
nm 处有最大光吸收的结论是一致的。同时 ,在
测定的其他波长条件下 ,细胞密度与吸光值也存
在良好的线性关系 ,说明 ,其他波长条件下测定的
生物量也是可信的 ,而 680 nm 处是测定最为灵
敏的波长 。
董正臻[ 4] 等利用分光光度计对新月菱形藻
(Nitzschia clo ste rium)生物量的测定时发现 ,在
波长为 672 nm 处测定光吸收 ,线性关系为:y =
32.554×106x -0.233 9×106 ,相关系数为 r=
0.996 5。本实验直接进行比色 ,波长在 540 ～ 700
nm 范围之间均具有良好的相关性 ,以 680 nm 时
最为灵敏 ,线性关系为 y =2 147.6x +0.453 , r=
0.999 7 。与董正臻的研究相比 ,本实验准确度不
减 ,但不需对藻细胞进行超声波破碎和离心 ,可直
接进行比色 ,因而更为简便。
光密度法测定小球藻生物量存在一个范围 ,
即吸光值在 0.05 ～ 0.5之间时测得的数据有较好
的线性关系 ,超出 0.5时应稀释至 0.05 ～ 0.5之
间才能得到较准确的结果 ,尽管如此 ,光密度法仍
不失为一种测定藻类生物量准确 、便捷的好方法。
参考文献:
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34
(下转第 14页)
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《河北渔业》2010年第 4期(总第 196期) ★研究与探讨
法同于丁鱼岁鱼种养殖。与其不同的是施肥后一
次性注水深度 1.5 m 。注水后 7 d ,以网箱试水观
察 ,丁鱼岁无异常反应即可正式放养 ,放养时间为
每年 4月初 。主养丁鱼岁投放密度 15 000 ～ 18 000
尾/hm2 ,放养规格 45 ～ 50 g/尾;放养鲢鱼鱼种
7 500尾/hm2 ,规格 50 ～ 80 g/尾;鲫鱼 7 500尾/
hm
2 ,规格 30 ～ 40 g/尾。饲料主要成份 ,粗蛋白
35%,粗脂肪 5%,粒径 2.5 ～ 3.5 mm 。日投饵率
是鱼体重 3%～ 5%,日投饵不少于 4次 。养殖期
间视水质及溶氧情况不定期注新水 ,每次注水 20
～ 25 cm ,透明度保持 30 ～ 40 cm ,适时投放 EM
或 PSB(光合细菌)。每 2 000 m2 设置 3.0 kW涡
轮增氧机一台 ,适时开机 ,防止缺氧浮头 ,巡塘过
程发现鱼情异常 ,及时捕出检测确诊 ,治疗方法参
考常规鱼类病害防治 。
3.2 养成收获
10月末 —11月上旬为丁鱼岁商品鱼养成收获
期 ,2006-2009 年试验养殖丁鱼岁共生产商品鱼
0.5 万 kg ,规格为 500 ～ 800 g/尾之间 ,回捕率
85%,平均产量 7 500 kg/hm2 。
3.3 效益分析
以目前丁鱼岁商品鱼 40 ～ 60 元/kg 的市场攀
升价格和供不应求的市场前景 ,比较几近饱和滞
销的淡水鱼市场 ,引进欧洲丁鱼岁增加名优养殖新
品种 ,调整北方淡水鱼养殖结构 ,无疑是一项增效
创收的选择。
Ding-year-old fish breeding and
culture technology introduction and temperature control
Fu Zhuo
(Jin zhou City Ocean and Fishery Sciences , Liaoning Jinzh ou 121007)
Abstract:T he European Ding t inca(Tincat inca)int roduction and breeding of the no rthern temperature
control and standardization of breeding technolog y research pro jects , f rom Jinzhou City Ocean and
Fishery Sciences in 2006-2009 years to complete.Tempe rature breeding oxy tocin rate of 95%, 70%
hatchabili ty , f ry surviv al rate of 90%.To tal production of small fish and fry 6000-year-o ld spray Wan
Wei , species 100 ,000 kg , output v alue of 8.47 mil lion yuan , eff iciency 5.354 2 million yuan.Promo-
ting the use of radiation test si te in Liaoning Province 7 urban areas , commercial f ish cultiv ation a rea
of 135 hm2 , output v alue of 2 ,118 million yuan , profi t 8.5 million yuan to promo te the techno logy ,
develop a benefi t i s obvious.
Key words:Tincatinca;Int roduct ion;tempe rature;breeding ;Culture (收稿日期:2010-01-23)
(上接第 3页) A rapid determination of chlorella biomass
Huang Meiling ,He Qing , Huang Jianrong , Li Zufu
(Zhongshan University life sciences inst itute , Guangzhou Guangdong 510275)
Abstract:In this paper , 11 di fferent w aveleng th be tw een 540-700 nm was chosen to de termine the
light abso rpt ion of dif ferent densi ty of chlorella.A t the same time , the amount and dry w eight of dif-
ferent density o f chlorella w ere measured accurately .The resul ts indicated that:(1)there is a perfect
linear relat ionship between the cell density and its optical density (OD)in the condition of 11 different
w avelengths.Co rrelation coeff icient r >0.999.The most sensit ive resul t w as unde r the condition of
680 nm.The second w as 540 nm;(2)the relationship between OD and the dry w eight o f chlorella al-
so presented a good linear relationship:Y(g/L)=0.25X(OD680)-0.001 5.Co rrelat ion coefficient r
>0.999.Those results show ed that optical density method can determine the Chlo rella biomass rapid-
ly and accurately .Comparing w ith the t raditional methods , optical densi ty method w as ef ficiently and
accurately , and providing a convenient method fo r laboratory research and manufacture.
Key words:Chlo rel la;biomass;optical density
(收稿日期:2009-12-13)
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《河北渔业》2010年第 4期(总第 196期) ★增殖与养殖