全 文 ：　以小球藻为载体生产兔防御素的研究①
王义琴② 　陈　颖　白琴华　赵世民　李文彬　孙勇如③
(中国科学院遗传研究所　北京 100101)
摘　要　本研究以单细胞的真核藻类小球藻(Chlorel la ellipsoidea)作为受体 ,将兔防御
素(NP-1)的基因转入后 ,经抗生素筛选和分子及活性检测 ,获得了稳定表达 NP-1的转基
因藻株 。进行了转基因小球藻扩繁的研究 ,并从扩繁的转基因小球藻中提取纯化了具有
正常的生物活性 NP-1。本文是通过基因工程的途径生产防御素的首例报道 ,为新型抗生
素———兔防御素的产业化奠定了基础。
关键词　兔防御素 , 小球藻 , 分子检测 , 抑菌活性 , 提纯
0　引言
防御素是广泛分布于动植物及昆虫体内的一类
抗微生物的阳离子短肽 ,含量极少 ,却执行着机体重
要的防御功能。与传统抗生素相比 ,防御素有着特
殊的毒性机理 ,它依靠静电作用附着在靶细胞表面 ,
形成跨膜离子通道 ,导致靶细胞内外离子交换失衡
而死亡 。由于目的微生物难以产生抗性突变 ,作为
一种新型抗生素 ,防御素在医药上具有很好的应用
前景 。
目前 ,从生物界分离到的防御素已达 30多种 ,
其中以兔防御素(NP-1)的抗性谱最广 ,它对梅毒螺
旋体 、很多革兰氏阳性菌 、革兰氏阴性菌 、真菌和病
毒有显著的抑制或毒杀效应。由于防御素一般存在
于特殊的细胞内 ,如巨噬细胞 、嗜中性白细胞 、潘氏
细胞等 ,自然提取兔防御素成本极高 ,且产量极低 ,
所以作为产品 ,通过基因工程的途径是必然的选择 。
近年来 ,国外对这类抗性肽的研究呈几何级数增长 ,
但至今通过基因工程生产防御素的研究尚未取得成
功。美国曾用融合蛋白的途径生产人防御素 ,但得
到的人防御素没有生物活性[ 1] 。
本研究以单细胞的真核藻
类小球藻(Chlorella ellipsoidea)
作为受体 , 在其抗生素筛选标
记[ 2] 、外源基因的转化方法和高
效表达 5 调控元件[ 3] 研究的基
础上 ,将兔防御素(NP-1)基因转
入后获得了稳定表达的转基因藻株 ,并从中提取纯
化了具有正常生物活性的 NP-1 ,为基因工程生产新
型抗生素———兔防御素奠定了基础。
1　材料和方法
1.1　材料
(1)植物材料
椭圆小球藻 Chlorella el lipsoidea 由北京大学的
张昀教授提供
(2)培养基
小球藻液体培养基为克氏培养液:Ca(NO3)2 1.
0g/L ;K2HPO4 0.2g/L;MgSO4.7H2O 0.2g/L;KCl
0.12g/ L;FeCl3 0.01g/ L;酵母提取物 0.1%;葡萄
糖 0.4%。
固体培养基为:液体培养基+1.8%琼脂
(3)菌种与质粒
表达载体 pUΨGUS 、pBin19 、pBIC35SNP-1 为
本实验室所保存;大肠杆菌(E .coli)Top10 、枯草杆
菌(Baci llus subt ilis)、镰刀菌(Fusarium oxyspo-
rum)和金黄色葡萄球菌(S taphylococcus aureus)也
均为本实验室所保存。
(4)仪器与设备
电激仪:Baekon2000 型;超声波细胞破碎仪:
DY92-III型 ,宁波新芝科器研究所生产;凝胶电转移
系统:Bio-Rad公司产品;
随机引物标记试剂盒购自 Promega 公司;NP-1
基因的引物由赛百盛公司合成。
1
王义琴等:以小球藻为载体生产兔防御素的研究
①②③ 联系人。(收稿日期:2001-06-07)
女 , 1973年生 ,博士 ,副研;研究方向:植物基因工程。国家“九五”科技攻关资助项目(96-C 02-04-05)。
(5)溶液配制
高渗溶液:0.2mol/ L 甘露醇;0.2mol/L 山梨醇
电激缓 冲液:0.08M KCl , 0.005M CaCl2 ,
0.01mol/L HEPES , 0.2mol/L 甘露醇;0.2mol/L 山
梨醇
磷酸缓冲液(PBS):pH7.4 , 0.137mol/L NaCl ,
2.7mmol/L KCl , 10mmol/ L Na2HPO4 , 1.8mmol/
LKH2PO4 , 20mmol/L EDTA , 2mmol/Lβ-巯基乙醇
1.2　方法
1.2.1　转兔防御素基因小球藻的获得
(1)兔防御素基因高效表达载体 pBinUΨNP-1
的构建
不同的 5 上游基因调控元件对小球藻外源基
因的表达影响显著不同。CaMV35S 启动子虽然已
被证明能用作藻类基因工程的启动子 ,但外源基因
的表达水平并不高 ,而禾本科植物中常用的 Ubiqui-
tin启动子对外源基因在小球藻中的表达调控有较
高的效率 , Ψ序列对外源基因的表达有显著的增强
作用 ,由于小球藻中外源基因在串联的 Ubiquit in启
动子和 Ψ增强子的调控下 ,具有较高的转化率 ,因
此以它们为上游调控元件 ,构建载体 pBinUΨNP-1 ,
具体结构见图 1。
图 1　兔防御素高效表达载体 pBinU(NP-1 的结构图
(2)小球藻的电激法转化
取培养 4天的小球藻培养液 , 1000r/min 离心
10min ,收集藻体 ,用高渗溶液处理 1 ～ 2h , 1000r/
min离心 10min 。用电激缓冲液调至密度为 1×108
个/ml。加入终浓度为 10μg/ml 的质粒 DNA 和
25μg/ml的鲑精 DNA ,充分混合均匀 ,在冰上放置 5
～ 10min后电激 。电激的条件:电场强度分别为6.0
～ 9.5KV ,脉冲距离 2mm ,脉冲持续期为 0.05秒 ,
脉冲的次数为 210 ,进行 100个循环。
转化后的小球藻经 G418筛选 ,大约 3周左右 ,在
固体培养基上即可长出抗性菌落 。通过含 G418
30μg/L 的固体培养基保存藻系 ,并挑取单藻落 ,在
含有G418 15μg/L 的液体培养基中扩大繁殖 。
(3)转基因小球藻的 PCR检测
用 CTAB法提取转基因小球藻的总 DNA ,详细
方法参见文献[ 4] ,用 NP-1基因的引物进行 PCR扩
增 ,扩增的条件为:94℃预变性 3min ,94℃变性 40s ,
55℃复性 1min , 72℃延伸 1min ,30个循环后 , 72℃
延伸 10min ,反应的总体积为 20μl ,反应结束后 ,取
10μl产物进行 2%琼脂糖凝胶电泳检测(见图 2)。
图 2　转基因小球藻的 PCR检测
1.Marker;2.阳性对照;3.阴性对照;4-7.转基因小球藻
(4)Southern检测
PCR检测阳性的藻株再以 NP-1 基因为探针 ,
做 Southern杂交 ,检测 NP-1 是否整合到小球藻的
基因组中 。阳性对照为经 EcoR I 和 HindI II 充分
酶解的质粒 pBinUΨNP-1 100ng 和转基因小球藻总
DNA约 10μg ,用内切酶 EcoR I 充分酶解 ,酶切产物
经变性后进行琼脂糖凝胶电泳 ,凝胶的变性 、中和 、
转膜及杂交的详细方法参照文献[ 5] 及 Bio-Rad电
转移说明书 。探针的标记参照 Promega 试剂盒说明
书进行 。
1.2.2　转基因小球藻的离体抑菌活性检测
(1)转基因小球藻可溶性总蛋白的提取
收集生长对数期(约 1(108 个/ml)的小球藻细
胞 ,加入 3 倍体积的磷酸缓冲液(PBS),超声破碎
60s 后 , 4℃下过夜浸提 , 室温 12000r/min 离心
20min ,收集上清即为小球藻的可溶性总蛋白。测
定 260nm 和280nm 下的吸光值 ,粗略计算出蛋白质
的浓度 。
(2)离体抑菌活性检测
取适宜条件下培养的大肠杆菌 、枯草杆菌分别
均匀涂布于 LB固体培养基上 ,待表面液体消失后 ,
用无菌打孔器在培养基上做点样孔(孔径 1cm),吸
2
高技术通讯　2001.9
取 200μl转基因小球藻可溶性总蛋白提取液加入孔
中 ,对照是 200ul相同条件下提取的野生小球藻总
蛋白提取液 ,于合适的条件下培养 ,观察菌生长受抑
制的情况(见图 4(a)和(b))。
图 3　转基因小球藻的 Southern 检测结果
1.阳性对照;2.阴性对照;3-6.转基因小球藻;7.λDNA M arker
　　在马铃薯-葡萄糖固体培养基(PGA)的两边放
置镰刀菌的培养块 ,等菌丝的半径扩至 1cm 左右
时 ,同上做点样孔并加入对照和处理小球藻的总蛋
白提取液。25℃下培养 ,观察菌生长受抑制的情况
(见图 4(c))。
1.2.3　转基因小球藻中重组防御素的提纯和
检测
(1)重组兔防御素的提纯
转基因小球藻在 15μg/mlG418筛选压力的液
体培养基中培养至对数生长期时 , 8000r/min 离心
5min收获细胞 ,用 3 倍体积的 PBS 重悬细胞后 ,同
样条件下离心沉淀细胞 ,然后用 PBS 再次重悬细胞
(藻鲜重∶PBS体积=1∶2),400v超声破碎 1min , 4℃
放置 2 ～ 4h 后 , 12000r/min 离心 10min ,弃沉淀 ,上
清放入 50ml 的离心管 , 沸水浴中煮 10min , 再次
12000r/min离心 10min后的上清过 SephadexG50分
子筛柱 ,收集第二个峰(S2)。对无离子水充分透析
后 ,冻干成粉末 ,即得到较为纯净的 NP-1蛋白 。
提取的总蛋白和层析柱的各个组分均经抑菌活
性检测 ,具体的操作同 2.2(2)。以金黄色葡萄球菌
为指示菌 ,对金黄色葡萄球菌有抑制作用的组分就
含有重组的兔防御素 。
(2)重组兔防御素的电泳检测
采用的适于小分子量蛋白的电泳系统 Tris-
T ricine系统 ,凝胶的配制参照文献[ 6 ,7]及 Bio-Rad
产品使用说明书 ,电泳起始的电压为 80V ,待样品进
入分离胶后增大到 120V ,等染料接近胶的边缘时 ,
关闭电泳仪 ,取出凝胶进行常规考马斯亮兰染色 ,具
体的方法见文献[ 8] 。
2　结果分析
2.1　转兔防御素基因小球藻的获得
我们的研究表明 ,在 6.0 ～ 9.0KV 的高脉冲电
压 ,0.05 ～ 0.2s的短脉冲时间和多次脉冲(100 次)
的条件下 ,电激法是适合于小球藻的外源基因转化
方法;另外 ,渗透处理是提高转化率的有效手段 ,小
球藻细胞经渗透处理后 ,外源基因的转化效率显著
提高。
(1)转基因小球藻的 PCR和 Southern检测
整合有外源 NP-1基因的小球藻 , PCR扩增应
得到一条相应的 200bp左右的片段(见图 2)。对获
得的 81个转基因藻系进行检测 ,其中扩增出特异条
带的有 51株 ,阳性率为 62.3%。将 PCR检测为阳
性的转基因小球藻总 DNA 进行 Southern 杂交分
析 ,在被检的 8个 PCR阳性的藻系中 ,有 4个表现
为阳性 ,表明外源基因已经整合到转基因小球藻中
(见图 3)。
3
王义琴等:以小球藻为载体生产兔防御素的研究
(a) (b) (c)
图 4　转基因小球藻表达兔防御素的离体抑菌活性检测
(a):革兰氏阳性菌-大肠杆菌(E.col i)Top10;(b):革兰氏阴性菌-枯草杆菌(Bacil lus subti li s);(c):真菌-镰刀菌(F usarium oxysporum)
　　(2)离体抑菌活性检测
转基因小球藻总蛋白提取液能明显抑制革兰氏
阳性菌-枯草杆菌 、革兰氏阴性菌-大肠杆菌及真菌-
镰刀菌的生长 ,而对照的未转基因小球藻却不能(见
图 4(a)、(b)、(c)),表明 NP-1基因已经在小球藻中
正确表达从而赋予了转基因藻抵制病原菌侵染的能
力 ,在点样孔的周围形成十分明显的抑菌圈。
图 5　T ris-T ricine系统显示初步提纯的兔防御素
1.蛋白质低分子量M arker;2.兔防御素
2.2　转基因小球藻中重组防御素的提取和纯化
(1)重组兔防御素的提纯
由于防御素具有耐热的特性 ,小球藻总蛋白提
取液经热处理后 ,绝大部分的蛋白受热变性而被离
心时除去 ,这样就大大提高了重组防御素在样品中
所占的比例 。再经分子筛柱的分离就可以得到较为
纯净的 NP-1 ,这种较为简便的蛋白提取方法是由
NP-1的特性来决定的 。
(2)重组兔防御素的电泳检测
T ris-Tricine系统是适合于小分子量蛋白的电
泳系统 , 从电泳图片上可以看出(见图 5), 经
SephadexG50进一步提纯的组分电泳已经显示单条
带 ,分子量在 3.5KD左右 ,已经是较为纯净的 NP-
1。
3　讨论
自从 1929年 Fleming 发现青霉素以来 ,抗生素
的研究对人类的健康作出了重要贡献 ,抗生药已发
展成一个庞大的行业 ,据 1997年资料 ,全世界抗生
药的市场份额已达到 224亿美元 。目前抗生药遇到
的主要问题是目的微生物的抗性突变问题 。从医院
分离的细菌 ,有 90%对常用抗生素表现出抗性 。美
国病人在住院期间感染导致每年有 6万病人死亡 ,
并消耗 45亿美元的医疗费用。因此开发能够有效
抑杀微生物但微生物却不能产生抗性突变的新型抗
生素是未来抗生素的发展方向。所以有专家估计新
一代抗生药物在 2005 年将占全部抗生药物市场的
42%的份额 。
作为一种新型的抗生素 ,防御素在医药上具有
很好的应用前景。由于从兔子中提取防御素的成本
极高且产量低 ,所以应用基因工程的方法是必然的
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高技术通讯　2001.9
途径。本研究对于将来低成本 、大批量地生产兔防
御素具有重要的意义 。
以小球藻为载体生产兔防御素在不久的将来实
现产业化是可行的。首先 ,作为单细胞真核藻类的
小球藻培养简单 ,适合于大规模培养 ,能够满足产业
化的要求;其次 ,我们已经建立了稳定的小球藻转化
体系 ,转 NP-1 基因的小球藻已经连续四年表达稳
定 ,兔防御素的表达量很高 ,可以达到 20mg/L ;拥
有自己独立的知识产权 ,这是实现产业化的重要基
础之一。
将转基因小球藻表达的兔防御素开发成一种新
型的抗生药尚有很长的一段路 ,需要解决一系列的
问题。如转基因小球藻的扩大培养问题 ,培养工艺
的优化和定型;兔防御素提取和纯化工艺的确定;兔
防御素的生物学效应及其药理和毒理研究等 。我们
已经建立了盒式培养体系 ,使转基因小球藻的培养
规模增大 ,由每瓶 300毫升扩大到每盒 4升 ,得到的
防御素可以供应临床前试验的需要 ,但作为产业化
生产仍需要进一步改进技术 ,建立更大规模的生产 、
纯化的工艺流程。毕竟用转基因小球藻生产基因工
程药物是一个全新的课题 ,在产业化的过程中肯定
还会有不少新问题需要我们进一步的研究 。
参考文献:
[ 1] Abiko Y , Mitamura J , Nishimura M , et al.Cancer Lett ,
1999 , 143(1):37
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1987 , 6(30):3901
Using Transgenic Chlorella ellipsoidea as Bio-reactor
to Produce Rabbit Defensin
Wang Yiqin , Chen Ying , Bai Qinhua , Zhao Shimin , Li Wenbin , Sun Yong ru
(Institute of Genetics , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100101)
Abstract
The gene of rabbit defensin(NP-1)a cat ionic antimocrobial pept ide w as t ransformed into unicellar eukary-
ot ic alga Chlorella ellipsoidea.After antibio tic screening , molecular and activi ty detection , several transgenic
alga with stable expression w as obtained.Also the expressed rabbit defensin w ith bio-act ivity w as isolated f rom
transgenic Chlorel la ellipsoidea .This paper was the fi rst repo rt that express defensin successfully in transgenic
Chlorella ell ipsoidea which established a new system for defensin production in low cost by the way of genetic
engineering .
Key words:Rabbit defensin , Chlorel la ellipsoidea , Molecular and activi ty detection , Ex traction and pu-
rification
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王义琴等:以小球藻为载体生产兔防御素的研究