全 文 ：第 2 7卷 第 4 期
200 5年 8 月
北 京 科 技 大 学 学 报
J O ur n al of Un i ver s i y tof s cie
n ce an d c Teh n o勿 gyB eJ i恤 g
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2 7N 0
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4
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小球藻的筛选和异养培养
闰 海 ` , 周 洁 ” 何宏胜 ” 魏玉 霞 ” 孙建新 ”
1)北京科技大学应用学院 ,北京 10 0 0 83 2) 广东绿百多生物科技有限公司 ,湛江 5 2 4 01 7
摘 要 从北京清河筛选出了具有异养能力的一株藻类 , 经初步鉴定为小球藻 . 在异养批量
培养条件下 ,研究了不同氮源和碳氮 比对筛选小球藻生长的效应 . 当葡萄糖作为惟一碳源时 ,
硝酸钾和尿素都可 以分别作为惟一氮源支持小球藻快速持续生长 , 而氯化钱作为惟一氮源
时因使培养物中的 p H 快速降低而抑制 了小球藻的进一步生长 . 当葡萄糖和硝酸钾分别作为
小球藻生长的惟一碳源和氮源时 , 在碳氮质量 比从 5 到 20 范围内 , 小球藻的生长随碳氮质量
比的升高而明显增加 , 最大 O D . 二达到了 73 . 8 .
关键词 小球藻 ; 筛选 ; 异养培养 ; 碳源 ; 氮源
分类号 Q 9 4 9 . 2 1
微细藻类作为最简单的光合作用有机体 , 是
地球生命起源的先锋物种之一 , 已有 20 多亿年
的历史 . 小球藻是绿藻小球藻科 的一个重要属 ,
包括大约 10 个种 , 细胞形态 圆形或椭圆形 , 细胞
直径 2一 12 脚 . 小球藻富含蛋白质 、 不饱和脂肪
酸 、 类胡萝 卜素 、 虾青素和多种维生素 `l,2] , 具有极
高的营养价值和提高免疫力 的功能 , 被 FA O 列为
21 世纪人类 的健康食品 . 另外更重要的是小球藻
还含有一种非常重要 的成分叫做小球藻促进生
长因子 , 它既具有诱发干扰素 , 激发人体防御和
免疫组织中的巨噬细胞 、 T细胞和 B 细胞 的功能 ,
又具有促进对可能污染环境的有害物质解毒和
排泄的作用 . 近两年来 , 日本生产的小球藻片 已
经开始出 口 中国 , 经有关部 门的功能实验证 明 ,
该产 品具有很强的免疫调节保健功能 . 在环境科
学领域 , 研究结果表明小球藻具有降解邻苯二甲
酸酷类 。 ,和吸附重金属铜 “ ,的能力 , 在去除水中
有机污染物和重金属方面具有重要作用 . 目前 ,
单胞藻类在健康 食品 、 细胞色素生产 、 环境污染
治理和水产养殖等领域得到了广泛应用 .
一般认为微细藻类属于低等植物 , 主要吸收
二氧化碳通过光合作用合成有机物 “ , , 但采用此
收稿 日期 : 2 0 0今1 1一1 7 修回 日期 : 2 0 0 5一 2一 2 2
基金项 目: 国家自然科学基金困 0 . 3 0 2 70 2 7 7 ; N o . 2 0 3 77 0 4 7 )和
北京科技大学 4 2 高级引进人才及校重点基金 困。 . 2 0 0 5 0 6 04
19 0) 资助项 目
作者简介 : 闰海 ( 19 62 一 ) , 男 , 教授
种方法 , 一般培养出的藻细胞浓度较低 . 加 世纪
70 年代以来 , 国外学者发现 , 有些小球藻可 以在
无光照条件下生长于有机物环,v] , 不仅大幅度提高
了小球藻的生长速度 , 而且获得了很大 的藻生物
量 , 从而引起 了单胞藻类培养的一次重要革命 .
虽然国外和我 国香港学者在利用异养培养的小
球 藻生产人类健康食品和叶黄素方面进行了大
量的研究 `8,9] , 但因为真正能够异养快速生长的小
球藻种类 比较稀少 ` l0] , 我国 目前研究使用 的小球
藻种大多由香港学者陈峰赠送 ` , ” . 因此有必要在
大陆依据现有的实验条件和研究能力 , 筛选出具
有我 国自主知识产权能够异养生长的小球藻种 .
通过培养条件的研究 , 获得超高细胞浓度的小球
藻 , 为我国藻类生物科技的发展做 出贡献 .
1 实验材料与研究方法
L l 实验藻种
实验所用 的小球藻是 2 0 4 年 5 月从北京清
河水中筛选 出的纯藻种 , 在无光照条件下此小球
藻可以快速生长于有机物 , 具有非常强的异养培
养潜力 .
L Z 培养基
光照静置实验用水生 4号培养基 周 , 在筛选异
养小球藻过程中加入 10 9 · L 一 `的葡萄糖作为有机
碳源 . 在无光照批量异养培养实验时 , 将水生 4
号培养基 【5] 中的硫酸钱分别用氯化钱 、 尿素和硝
DOI : 10. 13374 /j . i ssn1001 -053x. 2005. 04. 006
V匕 l一 27 No . 4闰海等 :小球藻的筛选和异养培养 一 4 09 .
酸钾取代 , 同时去除了水生 4 号培养基 〔5 ,中的无
机碳源碳酸氢钠 , 添加葡萄糖作为支持小球藻生
长的惟一有机碳源 . 培养基初始 p H 都调至 .7 0 左
右 , 按每 10 0 m L 溶液中加入 1 9 琼脂粉的比例加
入琼脂后 , 可制备出对应的固体培养基 .
L 3 实验条件
光照静置培养主要用 于异养 小球 藻种 的筛
选 , 所用实验器皿为 10 0 m L 玻璃三角瓶 , 培养量
20 m L
. 培养温度 30 ℃ , 12 h 光照黑暗循环 , 光照
强度 3 0 0 xI . 异养批量培养在摇床 内进行 , 无光
照 , 摇床转速为 2 0 r · m in 一 , , 温度 30 ℃ , 所用 实验
器皿和培养量与光照培养条件相同 . 实验用器皿
和配制的培养基均经 20 m in , 124 ℃ 的高温高压和
2 0 r D刃n 紫外灯照射的灭菌后使用 .
1
.
4 小球藻种的筛选
20 04 年 5月取北京清河含绿藻的河水 50 m L ,
先用滤纸过滤去除大型颗粒物后将滤液放入离
心管内 , 在 IO O0 r · m in 一 ,下离心 10 m in . 倒净上清
液 , 加入 10 m L 经高温高压灭菌的水生 4 号培养
基 , 经振荡使藻细胞悬浮 , 再经离心后倒去上清
液 . 按照上述清洗藻细胞步骤重复三次后 , 取 1
m L 藻悬浮液于培养基中先进行光照培养 , 培养
s d后取样 l m L 再重新接种于新鲜培养基 中进行
光照培养 , 重复光照培养三次后 , 取 l m L 培养物
接种于含有 l O g’ L 一 ,葡萄糖的培养基中进行光照
培养 , s d 后再取 l ln L 培养物重新接种于相同的
培养基中 , 重复培养 3 次后 , 将培养物用含葡萄
糖 的培养基稀释不 同倍数后涂抹于 固体培养基
上 , 光照培养 7 d 后挑取深绿色 单克隆藻菌落接
种于液体培养基 中进行黑暗条件下 的异养批量
培养 , 以在批量培养条件下藻类是否能够 生长来
识别筛选藻种是否具有异养 能力 . 采用此种 方
法 , 成功筛选 出一株能够在黑暗条件下生长于葡
萄糖的小球藻种 .
1 .5 研 究方法
在葡萄糖作为藻类 生长惟一碳源的情况下 ,
分别研究了不同含氮化合物对筛选 小球藻生长
的效应 . 在研究确定出能够支持小球藻生长氮源
的基础上 , 更进一步研究了不同碳氮 比对 小球藻
生长的效应 . 实验前分别测定了藻液在 6 80 nm 下
的吸光度 (O D ` : 。动和藻细胞的干重浓度 , 并在显
微镜下用血球计数板计数换算出了藻细胞浓度 ,
建立 了 O D 6吕。 。 分别与藻细胞浓度和藻细胞干重
浓度的线性关系 . 实验 中直接测定 O D 6。二 以示藻
类的生长 , 当藻类浓度大时 , 需稀释后测定 , 使测
定值在 0 . 1一 .0 4 的线性关系 , 再根据稀释倍数计算
出藻细胞浓度 . 同时测定藻类培养物 的 pH , 以确
定藻类批量培养的优化控制条件 .
2 结果与讨论
2
.
1 小球藻 的筛选和识别
图 1是在固体培养基上长出的筛选小球藻单
克隆菌落 , 其特点是藻菌落较大 , 颜色深绿 . 图 2
是在显微镜下观察小球藻细胞形态的显微照片 ,
图中显示筛选小球藻细胞 圆形 , 单独存在 , 细胞
中间有一个明显的载色体 , 因此初步确定筛选的
藻种为小球藻 . 图 3 是此筛选小球藻分别在光照
自养和批量异养培养条件下培养 4 d 后的照片 ,
虽然此小球藻在 自养和异养条件下都能够生长 ,
但异养批量培养 出的小球藻颜色深绿 , 细胞浓度
明显高于光照 自养培养下 的小球藻细胞浓度 .
图 1 筛选小球藻的单克隆藻菌落
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图 2 显微镜下筛选小球藻的细胞形态
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2 C o o fo m
a幼o n o f hC lo r e lo , P e e l ls u n d e r a m i c or s c o p e
目前国 内外 在异养 培养 小球藻方面进行 了
大量研究 , 一般认为在异养培养过程 中 , 由于小
球藻叶绿素含量降低 , 使细胞颜色黄化 ` 12 , , 而笔
者筛选的小球藻 即使在无光照异养批量培养条
件下 , 其颜色仍然保持墨绿 (图 3) , 说 明此小球藻
在有无光照条件下对其细胞色素合成的影响不
一
4 0 1
-北 京 科 技 大 学 学 报 00 2 5年 第 4 期
的生长基本处于停顿状态 .当以尿素作为惟一氮
源时 , 从实验第二天开始小球藻的生长一直保持
最好 , 在实验结束的第四天 O D 6: 。二 已经达到了
4 .9 5
. 当硝酸钾作为惟一氮源时 , 实验第一天后
小球藻的生长进入指数期 , 在实验第四天 OD 砌 ,
也达到了 46 3 的较高水平 . 上述结果表 明 , 尿素
是支持小球藻快速稳定生长 的最好氮源 , 这与文
献 9[ 」得到的结果一样 .
氯尿硝图
3 筛选小球藻自养和异养培养的差异
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h e t e or t r o p h i e e u l t u er s
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与吕成O大 , 其机理有待进一步研 究 .
2 .2 O D 俐 . 分别与细胞浓度和细胞干重浓度的线
I性关系
在 O D 石。。二 从 0 到 .0 45 范围内 , O D ` : 。 。 与藻细
胞浓度和细胞干重浓度之间都有非常好 的线性
关系 (图 4) ,尸均达到 .0 9 以上 . 通过对检测数据
的一元线性回归拟合 , 可以分别得到 :
藻细胞浓度 ( l o 6 l n L 一 , ) = 19 . 6 2 6 o D 。。。。 + 0 . 0 4 8 7 ,尸 =
0
.
9 9 8 8 ;
藻细胞干重浓度 (g’ L 一 ’ ) 二 .0 35 7 oD 6so 。 一 .0 0 27
, 尸
= 0
.
9 9 4 7
.
通过上述两个方程 , 可 以用测定的 O D 6: 。 mD 直
接计算 出对应的藻细胞浓度和藻细胞干重浓度 .
此结果与文献 〔11得到 的结果基本一致 .
.2 3 不同氮源对小球藻生长的效应
在葡萄糖初始浓度为 2 0 9 · L 一 ’和总氮初始浓
度都分别为 5 0 m g · L 一 ,下 , 图 5显示实验第一天
以氯化钱作为氮源 时藻生长较好 , 但此后小球藻
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时间 d/
图 5 不同氮源对小球藻生长的效应
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0
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侧
+
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14 韶
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从不同含氮化合物作 为氮源培养小球藻过
程中的 p H 变化情况看 , 当氯化按作为惟一氮源
时 , 培养物中的 pH 随时间的延长迅速下降 , 从初
始时的 .6 85 下降到实验第二天的 4 . 12 和第四天
的 3 . 5 8 (图 6) . 当硝酸钾作为氮源时 , 培养物的p H
逐渐增加 , 从初始的 .7 04 增加到实验结束时的
8
.
85 (图 6) . 如果采用尿素作为惟一氮源 , 藻类培
养物 中 p H 的变化经历了先略降低后升高的过
程 , p H 从实验初始的 7 .2 2 升高到第四天的 .7 90
(图 6 ) .
从图 5 和 6 可以看出 , 虽然氯化钱是支持小
球藻生长的较好氮源 , 但随着小球藻对钱的利用
导致培养物 p H 迅速降低 , 因此强烈抑制了小球
藻的持续生长 . 与之相反 , 当采用硝酸钾作为惟
一氮源 时 , 培养物 的 p H 逐渐增加 , 但即使 PH 增
加到接近 .9 0 时小球藻的生长也没有受到明显影
响 , 这说明筛选的小球藻能够耐受 比较高的 PH ,
而对低 p H 比较敏感 . 虽然尿素是支持小球藻持
续生长的最好氮源 , 但与硝酸盐相比其被微生物
的可利用性高 , 因此选择硝酸钾作为惟一氮源进
行进 一步研究 .
.2 4 不同碳氮质量比小球藻生长的效应
在硝酸氮初始质量浓度都为 1 . 0 g’ L 一 ` 时 , 分
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图 4 O D二与小球藻细胞浓度和细胞干重浓度的线性关系
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4闻海等 :小球藻的筛选和异养培养
氯化按
尿素
硝酸钾
酵母粉
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图 6 不 同氮源下小球藻培养物中 pH 变化
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6 C h a n g es i n PH o f hC lo
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时间 d/
图 7 不 同碳氮 比对小球藻生长的效应
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〔滋勿理刁恤 s p
别添加了不同初始质量浓度的葡萄糖 , 使碳氮质
量 比分别为 :5 1 , 10 : l , 1:5 1和 20 : 1 . 图 7 表明 , 葡萄
糖初始质量浓度高者在实验开始第一天时 , 小球
藻的生长少 , 说明尽管葡萄糖可以作为支持筛选
小球藻异养生长的有机碳源 , 但较高的葡萄糖初
始质量浓度会抑制小球藻的生长 . 当葡萄糖初始
质量浓度分别为 13 . 8 和 27 . 5 9 · L 一 ’时 , 实验第二天
和第三天以后小球藻基本停止生长 , 其原因可能
是此时葡萄糖 己被消耗到不足 以支持小球藻继
续生长 的地步 . 在葡萄糖初始质量浓度为 61 . 9 9
·
L
一 , 时 , 实验第三天以后小球藻的生长一直保持
最大 , 在实验结束的第五天 O D 68 。 nm 己高达 73 . 8 .
图 7还显示 , 最终小球藻的生长在初始碳氮质量
比从 5到 2 0范围内随碳氮 比的升高而增加 , 说明
碳源是决定小球藻最终生长量高低的主要因素 ,
同时也说明小球藻在缺氮情况下仍然可以保持
高速的生长 .
S hi 等 ` l3] 报道当葡萄糖初始质量浓度高于 80
g
·
L
一 , 时会对小球藻的生长产生抑制 , 本研究表
明当葡萄糖初始质量浓度大于本实验 中最低质
量浓度 13 . 8 9 · L 一 , 时就会影响小球藻 的生长 , 因
此在全 自动发酵罐发酵培养小球藻过程中 , 依据
小球藻的生长状况对葡萄糖进行流加补给 , 是避
免过高葡萄糖浓度抑制小球藻生长的较好方法 .
张丽君等 『4I] 认 为在葡萄糖和硝酸钾分别作为小
球藻生长的碳源和氮源时 , 碳氮质量比维持在 4
到 5之间是一种比较优化的控制条件 , 而本实验
结果表明碳氮质量 比保持在 10 以上更好 (图 7) .
一般来说碳 占藻干重的 49 % 一 70 % , 而氮 占藻干
重的 1% 一 1 % `5] , 碳氮质量比在 5 以上 . 因为在异
养培养条件下 , 大约有 50 % 的葡萄糖会转化为二
氧化碳 , 也就是说只有 50 % 左右的葡萄糖能够被
藻类利用 , 因此在异养培养小球藻过程中的碳氮
质量 比应 该在 10 以上 , 这与本文得到的结果 (图
7) 基本一致 . 在批量培养没有进行流加和没有
p H 控制条件下 , 一般小球藻细胞干重浓度都在
10 9
·
L
一 , 以下 〔15] , 而筛选 出的小球藻在 同样条件
下 细胞干重浓 度却可 以高达 26 9 · L 一 1(O D 68 。 nm =
7 3
.
8)
, 说明筛选 的小球藻有很 强的异养生长能
力 , 具有非常重要的应用与开发前景 .
3 结论
(l ) 20 04 年 5 月从北京清河水中筛选出了一
株 能够异养高速生长的藻类 , 藻细胞 圆形 , 经初
步鉴定为小球藻 .
(2 )在无光照异养批量培养条件下 , 尿素和硝
酸钾是支持此筛选小球藻持续生长的较好氮源 .
氯化钱虽然是藻类可利用 的较好氮源 , 但其被利
用时会导致 p H 的迅速降低 , 因此明显抑制 了小
球藻的进一步持续生长 .
(3 ) 当葡萄糖和硝酸钾分别作为小球藻生长
的碳源和氮源时 , 在碳氮质量比从 5 到 20 范围
内 , 小球藻的生长随碳氮质量比的升高而明显增
加 , 最高 0 D 68 。 。 达 73 . 8 , 对应藻细胞干重浓度达
2 6 g’ L 一 , .
参 考 文 献
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