全 文 ：527
2014 Vol.35 N
o.9
2014 年第 35 卷第 9 期 研究论文
中医药和生物治疗作为晚期胃癌的辅助疗法，
既能提高化放疗的近、远期疗效，又能减轻其不良
反应，所以在晚期胃癌的治疗中必不可少。CIK细
胞治疗是发展最为迅速的过继免疫疗法，其疗效在
国际上己得到广泛认可。藤梨根最早见于《开宝本
藤梨根乙醇提取物联合 CIK细胞对胃癌细胞 SGC-7901杀伤作用的研究
储 晶1，葛信国1*，周 俭1，蒋敬庭2
(1. 常州市中医医院肿瘤科，常州 213003；2. 常州市第一人民医院肿瘤生物诊疗中心，常州 213003)
摘要：目的 观察抗肿瘤中药藤梨根的乙醇提取物与 CIK细胞在体外联合对胃癌细胞 SGC-7901的杀伤作用。方法 运用倒
置显微镜观察体外培养的胃癌细胞 SGC-7901在分别加入不同浓度的藤梨根醇提物以及不同效靶比的 CIK细胞 24、48 h后
的形态变化；采用MTT法检测藤梨根醇提物、CIK细胞以及两者联合作用后的胃癌细胞 SGC-7901的增殖抑制率。结果
当 1 mg/ml的藤梨根醇提物与效靶比为 20:1的CIK细胞相联合 24 h，杀伤效率高于单用藤梨根醇提物及CIK细胞(P＜ 0.05)。
结论 藤梨根醇提物与 CIK细胞在一定条件下联合，具有协同杀伤胃癌细胞的作用。
关键词：藤梨根乙醇提取物；细胞因子诱导的杀伤细胞；胃癌细胞 SGC-7901
中图分类号：R735.2；R285 文献标志码：A 文章编号：1672-9188(2014)09-0527-06
收稿日期：2014-02-25；修回日期：2014-04-23
作者简介：储 晶，研究方向：中西医结合肿瘤学。
通信作者：葛信国，主任中医师，从事中西医结合肿瘤方面的研究。
Study of the anti-tumor effects of extract of radix actinidiae chinensis by
ethanol combined with CIK against gastric cancer cell lines SGC-7901
CHU Jing1, GE Xin-guo1*, ZHOU Jian1, JIANG Jing-ting2
(1. Oncology department, Changzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Changzhou 213003;
2. Center of diagnosis and treatment tumor biology, the fi rst people’s Hospital of Changzhou, Changzhou 213003, China)
Abstract: Objective Investigate the anti-tumor effects of extract of radix actinidiae chinensis by ethanol combining with
CIK against gastric cancer cell lines SGC-7901 in vitro in order to expound the meaning of combination. Methods Induce
the PBMC into CIK cells; Inverted microscope was used to observe morphological changes of SGC-7901 gastric cancer cells
after added the different amounts of CIK and different density of extract of radix actinidiae chinensis by ethanol respectively
after 24 and 48 hours. The proliferation inhibition of both against SGC-7901 cells were measured by MTT assay respectively.
Meanwhile the test was applied to SGC-7901 cells which added both of them under some conditions. Results The anti-tumor
effects of combination will be enhanced if the condition is permitted（P＜0.05）. Conclusion Under some conditions, the
extract of radix actinidiae chinensis, which combines with CIK could show stronger anti-tumor effects against SGC-7901
gastric cancer cells in vitro than those added alone.
Key words: extract of radix actinidiae chinensis by ethanol; cytokine induced killer cells; SGC-7901 gastric cancer
cells
草》，又名猕猴梨根、猕猴桃根或阳桃根，为猕猴桃
科软枣猕猴桃的根。《青岛中草药手册》言：性平，
味甘、微酸。入足少阴、阳明经。具有健胃、清热
解毒和利湿的功效，适用于湿热黄疸和消化不良等
症。并擅长祛风除湿、消痈医疡和活血利尿消肿，
治疗风湿痹痛、关节肿痛、淋浊带下、瘰疬、痢疾、
疮疖和水肿等症，有抗癌作用，主要用治胃癌和食
管癌等消化道癌肿。相关研究已证实藤梨根和 CIK
【简报】
储 晶 , 等 . 藤梨根乙醇提取物联合 CIK细胞对胃癌细胞 SGC-7901
杀伤作用的研究 .
528
2014 Vol.35 N
o.9
世界临床药物 WORLD CLINICAL DRUGS Vol.35 NO.9研究论文
细胞单独作用胃癌细胞均有直接杀伤和诱导凋亡的
作用。在相似的抗肿瘤机理前提下，如何发挥各自
的优势，最大限度地抑瘤杀瘤，值得深究。本研究
以抗肿瘤中药藤梨根为例，初步探讨其乙醇提取物
与 CIK细胞在体外联合对胃癌细胞 SGC-7901生长
的影响，为两者联合运用奠定理论基础。
1 材料
1.1 主要仪器及试剂
主要仪器：CO2细胞培养箱 ( 日本 SANYO公
司 )、倒置显微镜 XSD-1( 重庆光学仪器厂 )、酶标
仪 Skan Ascent( 美国 thermo公司 )。
试剂：注射用重组人干扰素 -γ( 上海凯茂生物医
药有限公司，批号：S10980084)、注射用重组人白介
素 -2( 山东泉港药业有限公司，批号：S20020006)、
重组人白介素 1α( 美国 Pepro Tech EC Ltd公司 )、注
射用抗人 T细胞 CD3鼠单抗(武汉生物制品研究所，
批号：S19990012)、RPMI1640(GIBCO公司，批号：
22409-015)、二甲亚砜 (DMSO)( 美同 Sigma公司，
批号：D4540-500ML)、四甲基偶氮唑盐 (MTT)( 美
国 Sigma公司，批号：CGD-17H294，以超纯水配成
5 mg/ml，避光、分装保存 )、胰蛋白酶 (Tripsin)(Difco
公司，批号：215250)、胎牛血清、冷乙醇、PI。
1.2 细胞株
本研究中使用的胃癌细胞 SGC-7901购自科学院
细胞库，长期冻存于 -196℃液氮或短期存放于 -80℃
冰箱中。用前取出溶解，常规培养于含 10％胎牛血
清的 RPMI1640完全培养液内，置于 37℃、5％ CO2
的培养箱中培养。取第 3、4代对数增长期的细胞用
于试验。
1.3 中药
将购置的藤梨根乙醇提取物粉末 1 g加 DMSO
2 ml溶解得到生药浓度 500 mg/ml，分装后置 4℃冰
箱冷藏备用。临用前用含 10%胎牛血清的完全培养
液稀释到所需的工作浓度。
1.4 CIK细胞
CIK细胞的制备参照相关文献 [1-2]，用淋巴细
胞分离液离心提取 20例健康人的外周血单个核细胞
(PBMC)1～ 2×107个，PBS洗涤后，将细胞重悬并
保存于由血清、谷氨酰胺、链霉素和青霉素所组成
的 RPMI1640培养液内，调整密度 2×106个 /ml，开
始时加入 1.5×106 U/L的 IFN-γ，孵箱中培养 24 h后，
加 入 100 μg/L 的 抗 CD3McAb、5×105 U/L 的 IL-2
和 1.0×105 U/L的 IL-1α。继续培养，以后每 2～ 3 d
换液，同时补加 IL-2，调整为 1.0×106个 /ml，分
别于培养初始第 7、14、21和 28 d收集细胞，用间
接免疫荧光染色的方法，在流式细胞仪上分析 CD3+
CD56+双阳性细胞即 CIK细胞的百分比。
2 方法
2.1 倒置显微镜下观察细胞形态
取 2×l05个 /ml的 SGC-7901细胞接种于 6孔板
内培养，设 2板。待其贴壁后，第 1板分别加入终
浓度为 1和 2 mg/ml的藤梨根醇提物，对照组换取新
鲜培养液；第 2板加入效靶比 (CIK细胞与 SGC7901
的比值 ) 为 20︰ 1和 10︰ l 的 CIK细胞，靶细胞
组只加新鲜培养液，另设效应细胞对照孔。孵箱中
培养 24和 48 h后，加入冷乙醇和 PI，固定细胞形态，
倒置显微镜下观察并照相。
2.2 MTT法测定细胞增殖抑制率
2.2.1 藤梨根乙醇提取物对 SGC-7901的抑瘤作用
取 1.0×104 个 /ml 的 SGC-7901 细胞，均匀接
种于 96孔平板中，置孵箱 24 h待贴壁后，各孔分
别加入不同浓度的含藤梨根醇提取物的完全培养液
100 μl，使孔内终浓度分别为 0.5、1、2和 4 mg/ml，
并设完全培养液调零组和只含细胞不加药物的完全
培养液对照组，每组设 4个复孔。培养 24和 48 h
后，各孔中加入MTT 20 μl，继续培养 4 h，弃培养
液，每孔再各加入 150 μl的 DMSO溶解液，震荡
20 min，用酶标仪测定 λ＝ 492 nm波长处的吸光度(A
值 )。上述步骤再重复 2次，所测的结果代入下面
公式计算：生长抑制率＝ (对照组 A值－试验组 A
值－调零组 )/( 对照组 A值－调零组 )×100%。
2.2.2 CIK对 SGC-7901的杀伤作用
529
2014 Vol.35 N
o.9
2014 年第 35 卷第 9 期 研究论文
同一批 SGC-7901细胞，每孔 1.0×104 个均匀接
种于 96孔平板内，贴壁 24 h后，加入效靶比为 5︰ l、
10︰ l、20︰ l和 40︰ l的 CIK细胞各 100 μl，并
另设单独靶细胞及效应细胞为对照孔，每组设 4个
复孔，置孵箱中培养。24和 48 h后，每孔加 MTT
20 μl，继续培养 4 h，弃上清，每孔各加 DMSO
150 μl，同样上酶标仪检测 OD值，重复 2次，用如
下公式计算 CIK的杀伤率：杀伤率＝ [1-( 试验孔 A
值 -效应细胞孔 A值 )/靶细胞孔 A值 )]×100%。
2.2.3 藤梨根乙醇提取物 +CIK对 SGC-7901的杀伤
作用
调整 SGC-7901 细胞浓度 1.0×104 个 /ml，各
100 μl在 96孔平板中接种，待贴壁后，先加入终浓
度为 1和 2 mg/ml的藤梨根醇提物各 100 μl，过 4 h，
再加入效靶比为 10︰ l和 20︰ 1的 CIK细胞各
100 μl，同时设对照孔，每组 4个复孔，24和 48 h
后MTT法检测，计算方法：杀伤率＝ [1-( 试验孔
A值－效应细胞孔 A值 )/靶细胞孔 A值 )]×100%。
2.2.4 统计学处理
各组数据用均数±标准差 (x－ ± s) 来表示，采用
SPSS18.0统计软件处理数据。组间差异比较选用双
向方差分析 (Two-Way ANOVA)，两组联合与单独作
用之间的比较采用拉丁方试验设计资料的方差分析。
P＜ 0.05为差异有统计学意义，P＜ 0.01为差异有
显著统计学意义。
3 结果
3.1 藤梨根乙醇提取物单独作用后的胃癌细胞
SGC-7901的形态表现及MTT结果
3.1.1 藤梨根醇提物作用后的胃癌细胞 SGC-7901的
形态表现
倒置荧光显微镜下观察发现 24 h后，对照组细
胞仍呈梭形或多边形，贴壁生长，形态饱满，铺满
视野。而经藤梨根作用后的胃癌细胞在数量上有所
减少，细胞脱壁漂浮或见细胞碎片，在部分视野中
可见到凋亡小体，且药物浓度越高、时间越长，越
明显。见图 1。
3.1.2 藤梨根醇提物对胃癌细胞 SGC-7901的增殖抑
制作用
经藤梨根作用后的胃癌细胞 SGC-7901，其增殖
受到不同程度的抑制。在同一浓度作用下，当延长
作用时间，抑制作用呈上升趋势 (P＜ 0.01) ；同一
作用时间下，增殖抑制率与浓度成正比例(P＜ 0.01)。
药物作用 24、48 h后的半数抑制浓度 (IC50) 分别为
2.16和 1.49 mg/ml。见表 1和图 2。
3.2 CIK细胞单独作用胃癌细胞 SGC-7901的形态学
表现及MTT结果
3.2.1 CIK细胞作用后的胃癌细胞 SGC-7901的形态
学表现
在倒置荧光显微镜下观察发现，与 CIK细胞共
育 24 h后的胃癌细胞失去原有形态，出现皱缩，漂
浮，而且数量减少，48 h后漂浮的细胞更多，视野
图 1 藤梨根乙醇提取物作用后的胃癌细胞 SGC-7901
的形态表现
储 晶 , 等 . 藤梨根乙醇提取物联合 CIK细胞对胃癌细胞 SGC-7901
杀伤作用的研究 .
530
2014 Vol.35 N
o.9
世界临床药物 WORLD CLINICAL DRUGS Vol.35 NO.9研究论文
中有较多细胞碎片。而对照组生长良好，均匀贴壁，
铺满视野。见图 3。
3.2.2 CIK细胞对 SGC-7901胃癌细胞的杀伤表现
同一时间下，CIK细胞的杀伤效应随着效靶比
的增加而增强 (P＜ 0.01) ；同一效靶比下，杀伤
率与作用时间成正比，各组的杀伤率 48 h均高于
24 h(P＜ 0.01)。见表 2和图 4。
表 2 CIK细胞对 SGC-7901的杀伤率 (x－ ± s，n=12)
效靶比
杀伤率/%
24 h 48 h
5:1 16.84±1.27 27.79±3.39△
10:1 27.60±2.35* 35.97±2.59*△
20:1 40.13±2.82* 56.27±3.92*△
40:1 54.06±3.10* 74.80±1.25*△
同一时间组，与 5:1效靶比组比较，*P＜ 0.01，同一效靶比，与 24 h组比较，
△P＜ 0.01
图 2 各浓度的藤梨根醇提物作用 24、48 h的统计学结果 图 3 CIK细胞作用于 SGC-7901胃癌细胞的形态学表现
3.4 藤梨根醇提物联合 CIK细胞对 SGC-7901的增
殖抑制作用
在藤梨根浓度相同的前提下，效靶比 20:1的
CIK细胞的杀伤率均要高于 10:1的 CIK细胞 (P＜
0.05) ；CIK细胞效靶比一定的基础上，各个浓度之
图 4 CIK细胞作用后 24、48 h的统计学分析图
表 1 藤梨根醇提物对胃癌细胞 SGC-7901的
增殖抑制率 (x－ ± s，n=12)
藤梨根乙醇提取物/mg·ml-1
抑制率/%
24 h 48 h
0.5 8.83±2.89 13.57±2.92△
1 17.84±3.12* 40.46±4.45*△
2 56.81±3.78* 65.20±3.15*△
4 69.56±3.19* 78.17±2.04*△
同一时间组，与0.5 mg·ml-1组比较，*P＜0.01；同一浓度组，与24 h比
较，△P＜0.01
531
2014 Vol.35 N
o.9
2014 年第 35 卷第 9 期 研究论文
间的增殖抑制率也有差异 (P＜ 0.05)。24 h与 48 h
结果对比，当藤梨根浓度为 2 mg/ml，效靶比为 10:1
的试验组，24 h与 48 h之间无统计学差异，其余
各组均有差异 (P＜ 0.05)。尤其当浓度为 1 mg/ml，
效靶比相同时，24 h组杀伤率均强于 48 h组 (P＜
0.01)。见表 3、4和图 5。
表 3 藤梨根醇提物 +CIK细胞对 SGC-7901作用
24 h的杀伤率 (%)(x－ ± s，n=12)
藤梨根乙醇提取物/mg·ml-1
效靶比
10:1 20:1
1 59.62±2.27 68.93±2.68*
2 35.81±2.83△ 44.60±3.05*△
同一浓度组，与效靶比 10:1比较，*P＜ 0.05，相同效靶比组，与
1 mg·ml-1比较，△P＜ 0.05
表 4 藤梨根醇提物 +CIK细胞对 SGC-7901作用
48 h的杀伤率 (%)(x－ ± s，n=12)
藤梨根乙醇提取物/mg·ml-1
效靶比
10:1 20:1
1 46.32±2.66 56.40±3.77*
2 38.02±2.04△ 49.01±2.51*△
同一浓度组，与效靶比10:1比较，*P＜0.05，相同效靶比组，与1 mg·ml-1
比较，△P＜0.05
A：2 mg/ml藤梨根醇提物 +10:1CIK细胞，
B：2 mg/ml藤梨根醇提物 +20:1CIK细胞，
C：1 mg/ml藤梨根醇提物 +10:1CIK细胞，
D：1 mg/ml藤梨根醇提物 +20:1CIK细胞
图 5 藤梨根醇提物联合 CIK作用 24、48 h结果的
统计学分析图
4 讨论
藤梨根系猕猴桃科植物猕猴桃的干燥根。性寒、
苦涩，可活血消肿、清热利湿、祛风利尿。民间主
要用于治疗跌打损伤、肝炎、风湿性关节炎、痢疾、
水肿等疾病。当代药理学研究阐明其具有抗肿瘤、
清除氧自由基、保肝降酶、提高免疫力、抗炎、抗
HIV病毒和降血脂等多种活性，药用价值很高。抗
肿瘤作用包括直接杀伤、诱导肿瘤细胞凋亡、调节
信号转导通路、协同化疗药逆转MDR和化疗药物增
敏等。
CIK细胞是过继免疫疗法的主要免疫活性细胞，
相关研究 [3-4] 认为其在体外经多种细胞因子共培养
数日后可大量扩增，免疫抑制剂 FK506和环孢素虽
然对抗 CD3单抗介导的 CIK细胞脱颗粒过程有抑制
作用，但对靶细胞诱导的脱颗粒过程却无影响，因
此不会影响 CIK的杀伤活性。在 CIK细胞被激活时，
可结合靶细胞，同时向胞质内释放含 BLT酯酶的胞
浆毒性颗粒 [3,5]，后者直接穿透靶细胞膜进行胞吐，
裂解靶细胞。经活化后的 CIK可分泌 IL-2、IL-6、
GM-CSF、TNF和 IFN-γ等多种细胞因子，参与机体
的免疫应答间接抑制肿瘤细胞。在诱导肿瘤细胞调
亡方面，Hoyle等 [6] 研究认为 CIK细胞能促使 FasL
的合成，提示其既可诱导 FasL阳性肿瘤细胞本身凋
亡。研究发现 [7-8] 其诱导胃癌细胞凋亡可能与上调
Bax或下调 Bcl-2、p53和 C-myc蛋白的表达有关。
本研究发现，藤梨根能有效杀伤胃癌细胞，对
其有较强的增殖抑制作用，且有浓度和时间依赖性，
浓度越高，时间越长，作用越突出，与文献报道一
致 [9]。CIK细胞杀伤胃癌细胞 SGC-7901的效应与
效靶比和作用时间均有关，随着效靶比的递增，作
用时间的延长，杀伤活性亦随之增强，当效靶比为
40:1，作用 48 h时，CIK细胞表现出较高的杀伤率，
可能是通过接触、胞吐和裂解靶细胞发挥杀伤作用。
采用拉丁方试验设计分析两者联合与单独作用
储 晶 , 等 . 藤梨根乙醇提取物联合 CIK细胞对胃癌细胞 SGC-7901
杀伤作用的研究 .
532
2014 Vol.35 N
o.9
世界临床药物 WORLD CLINICAL DRUGS Vol.35 NO.9研究论文
结果，藤梨根加 CIK细胞组与单独藤梨根醇提物作
用组相比，其浓度影响不大，而与培养时间和 CIK
的效靶比有关 (P＜ 0.05)。与单独 CIK细胞作用组
相比较，在作用时间上无差异，与加入的藤梨根浓
度有关。当加入 2 mg/ml的藤梨根醇提物时，杀伤
率无差异，而加入 1 mg/ml时作用最为显著，高于
两者的单独作用 (P＜ 0.01)。提示藤梨根醇提物在
浓度为 1 mg/ml，CIK细胞效靶比为 20:1，作用 24 h
时有协同杀伤作用。再提高藤梨根浓度或延长作用
时间，杀伤活性不增强，考虑可能系藤梨根本身对
CIK细胞有一定的影响，当其浓度提高到一定程度，
在抑制胃癌细胞的同时也可能影响了 CIK细胞的抗
瘤活性。
藤梨根对胃癌细胞 SGC-7901有明显增殖抑制作
用，但其成分复杂，大多停留在其提取物及可能机
制上，未提取到有效的单体，且真正起抗肿瘤作用
的成分仍然不够明确，所以联合 CIK细胞的协同杀
伤机制还需更深入的研究。
5 结论
藤梨根乙醇提取物与 CIK细胞在一定的浓度与
时间下联合作用可表现出一定的协同杀伤胃癌细胞
作用，值得研究。
参考文献：
[1] Jiang J, Xu N, Wu C, et al. Treatment of advanced gastric can-
cer by chemotherapy combined with autologous cytokine-indu-
ced killer cells[J]. Anticancer Res, 2006, 26 (3B): 2237-2242.
[2] 蒋敬庭 , 吴昌平 , 邓海峰 , 等 . 细胞因子诱导的杀伤细胞
与肿瘤浸润淋巴细胞体外细胞毒活性比较 [J]. 检验医学 ,
2005, 20(4): 34-36.
[3] Mehta BA, Schmidt-Wolf IG, Weissman IL, et al. Two
pathways of exocytosis of cytoplasmic granule contents and
target cell killing by cytokine-induced CD3+ CD56+ killer
cells[J]. Blood, 1995, 86(9): 3493-3499.
[4] Schmidt-Wolf IG, Lefterova P, Johnston V, et al. Sensitivity of
multidrug-resistant tumor cell lines to immunologic effector
cells[J]. Cell Immunol, 1996, 169(1): 85-90.
[5] Verneris MR, Kornacker M, Mailander V, et al. Resistance
of ex vivo expanded CD3+CD56+ T cells to Fas-mediated
apoptosis[J]. Cancer Immunol Immunother, 2000, 49(6):
335-345.
[6] Hoyle C, Bangs CD, Chang P, et al. Expansion of Philadelphia
chromosome-negative CD3(+)CD56(+) cytotoxic cells from
chronic myeloid leukemia patients: in vitro and in vivo effi cacy
in severe combined immunodefi ciency disease mice[J]. Blood,
1998, 92(9): 3318-3327.
[7] 李雪梅 , 孙抒 , 王建光 , 等 . CIK细胞对 MGC-803胃癌细
胞株的诱导凋亡作用 [J]. 实用肿瘤学杂志 , 2004, 18(6):
16-19.
[8] 孙抒 , 李雪梅 , 王建光 , 等 . CIK细胞对MGC-803胃癌细
胞株抗增殖及诱导凋亡作用的研究 [J]. 中国免疫学杂志 ,
2004, 20(12): 24-26.
[9] 钟振国 , 张雯艳 , 张凤芬 , 等 . 中越猕猴桃根提取物的体外
抗肿瘤活性研究 [J]. 中药材 , 2005, 28(3): 53-56.
(责任编辑：李 琨)
欢迎投稿，欢迎订阅，欢迎刊登广告，样刊备索
编辑部邮箱：wcd@pharmadl.com
在线投稿：www.jwph.com.cn