全 文 ：鱼藤 、枫桦和石上柏的细胞毒及抗氧化活性初步研究
方玉春1 , 朱伟明1 , 管永光2 , 顾谦群1 , 王长云1
(1.中国海洋大学海洋药物研究所;海洋药物教育部重点实验室 , 山东 青岛 266003;2.福建农业大学食品科学学院 , 福建 福州 350002)
摘　要:　对中草药鱼藤 、枫桦和石上柏的细胞毒及抗氧化活性进行了初步研究。 用人乳腺癌细胞 MCF-7 、人肺癌细胞
A549 和大鼠嗜铬瘤细胞 PC12 检测了鱼藤 、枫桦和石上柏提取物的抗细胞毒作用;并用 1 , 1-dipheny l-2-picrylhydrazyl
(DPPH)检测了提取物的抗氧化活性。结果发现 ,鱼藤 、枫桦和石上柏的甲醇提取物均有细胞毒活性 ,其中鱼藤甲醇提取
物具有很强的细胞毒活性;枫桦甲醇提取物有较强的清除自由基和抗氧化活性。鱼藤植物值得进行抗肿瘤药物应用研
究。
关键词:　鱼藤;枫桦;石上柏;细胞毒活性;抗氧化活性
中图法分类号:　R282.71;R282.51　　　　　文献标识码:　A　　　　　文章编号:　1672-5174(2008)03-401-03
　　从中草药中寻找活性成分或先导化合物是发现抗
癌药物有效途径。文献报道很多天然植物的酚类 、黄
酮及三萜类物质具有一定抗氧化活性及细胞毒活性 ,
我们在寻找天然抗肿瘤药用资源工作中 ,发现鱼藤 、枫
桦和石上柏等植物在民间曾被用于抗癌临床使用 ,具
有一定疗效。结合抗肿瘤药学生物活性筛选 ,本文报
道这 3种植物甲醇提取物的抗肿瘤及抗氧化活性 。
1　仪器与试剂
1.1 药材
鱼藤采自福建武夷山 ,枫桦和石上柏购于河北安
国药材批发市场 ,由中国海洋大学海洋生命学院罗艳
老师鉴定 ,其提取物(代号依次为 DTL , BC ,SDH)由中
国海洋大学天然药物研究二室提供 。
1.2 试剂
二苯代苦味酰基自由基(DPPH),四甲基偶氮唑盐
(MTT )和 福 林-酚 试 剂 (Folin-Ciocalteus phenol
reagent)购于美国 Sigma-Aldrich 公司;DMEM 培养基
购于美国 Gibco公司;胎牛血清和马血清购于美国 Hy-
clone公司;其余试剂购自上海医药试剂公司 ,为国产分
析纯 。
1.3 细胞株
人乳腺癌细胞 MCF-7 ,人肺腺癌细胞 A549 和大
鼠嗜铬瘤细胞 PC12均购于美国 ATCC公司。
1.4 仪器
紫外-可见光分光光度仪(PerllinElmer instru-
ments-Lambda 35 UV/V IS spect rometer , USA);减压旋
转蒸发仪(LABOROTA 4001 , Heidolph , Germany);酶
标仪(Fluostar Galaxy BMG ,德国)。
2　实验方法
2.1 提取方法
将枫桦 、鱼藤和石上柏分别粉碎 ,过 10目筛 ,取 30
g药材粉末置于 1 000 mL 具塞三角瓶中 ,依次加入
70%乙醇 ,丙酮 ,丙酮 300 mL ,室温超生提取 3 次 ,每
次提取 20 min ,合并各提取液并减压浓缩 ,冷冻真空干
燥得粉末状提取物 。
2.1.2 总酚含量测定　　在碱性溶液中 ,酚类化合物
可以将福林-酚试剂中的钨钼酸还原成蓝绿色化合物 ,
在 760 nm处有最大吸收 ,颜色的深浅与酚浓度呈正相
关。以没食子酸作为参照标准 ,提取物中总酚含量以
等同于没食子酸(gallic acid equivalent)的量表示。分
别称取各提取物适量 , 配成 20 mg/mL 的原试液 ,备
用。将 Singleton等人的方法[ 1]稍加改进:150 μL 适当
浓度的提取物溶液与 750 μL 福林-酚试剂反应 7 ～ 8
min ,加入 600 μL 浓度为 75.0 g/L 的 Na2CO3 ,室温反
应 2 h ,检测 760 nm 波长下吸光值。以蒸馏水加相应
比例提取物溶液及 Na2CO3 溶液做空白对照 。吸光值
代入标准曲线的线性回归方程 ,计算出样品的总酚含
量。每个提取物做 3次平行对照 ,取平均值 。
2.1.3 DPPH 自由基清除活性测定[ 2] 　　DPPH 是 1
种稳定的自由基 ,其甲醇溶液呈紫红色 ,在 515 nm 处

通讯作者:E-mail:changyun@ouc.edu.cn
基金项目:国家自然科学基金项目(30572314);山东省优秀中青年科学家科研奖励基金项目(03BS109);国家教育部新世纪优秀人才支持计划
(NCET-05-0600)资助
收稿日期:2007-08-12;修订日期:2007-11-23
作者简介:方玉春(1965-),男 ,硕士 ,副教授。
　 第 38卷　第 3期 　
2008年 5月　
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSIT Y OF CHINA
38(3):401～ 403
May , 2008
有最大的吸光值。测定原理是基于抗氧化剂能清除
DPPH ,使甲醇溶液紫红色消退来定量检测其抗氧化能
力的 。
精密称取提取物 20 mg , 溶于 1 mL 二甲基亚砜
(DMSO),配成 20 mg/mL 的原始液 ,稀释到适当浓度
备用。精密称取 5.00 mg BHT ,溶于 5 mL DMSO ,配
成 1 mg/mL 原始液 ,再稀释成 500 , 450 ,400 ,350 ,300 ,
250 , 200 , 150 ,100和 50 μg/mL 的样品溶液 ,备用。精
密称取 24 mg DPPH 溶于 1 L 甲醇 ,配成 24 mg/L 的
溶液。取上述配好的样品溶液 0.10 mL 和 3.90 mL
DPPH 溶液于具塞试管中 ,充分摇匀 ,静置 30 min使之
反应完全。实验发现抗氧化剂与 DPPH 甲醇溶液反应
30 min后颜色变化已不明显 ,在 515 nm 处每分钟吸光
值变化<0.01(ΔA515<0.01),即 30 min后反应已基本
完全。再以 0.10 mL 原样品溶液与 3.90 mL 甲醇混
合物做为空白消零 ,测定样品液反应 30 min 后在 515
nm 处吸光值(As),并同时对比测定 0.10 mL DMSO
与 3.90 mL 的 DPPH 溶液混合物的吸光值(Ac)。根
据公式计算清除率(SR%):
SR%=(1-As/Ac)×100%。
适当浓度的样品经梯度稀释 ,每个稀释度做 6 个
重复 ,求平均值 。以平均清除率对样品浓度作曲线 ,求
出 DPPH 清除率为 50%时对应的样品浓度(SC50)。
2.2 细胞毒活性检测
2.2.1 细胞培养　　A549和 MCF-7细胞用含 10%胎
牛血清的 DMEM 培养液在饱和湿度 , 37 ℃, 5%CO2
条件下培养 , 每隔 2 d 换液 , 细胞长至亚融合时用
0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 消化传代。PC12 细
胞用含 10%马血清和 5%胎牛血清培养 ,其余条件同
A549细胞。
2.2.2 细胞毒活性检测　　亚融合细胞消化后接种于
96孔板 ,A549 , MCF-7和 PC12 细胞的接种密度分别
为 3.5 , 5 ,5(×104 个/mL),每孔加 100 μL ,过夜贴壁 ,
吸出培养基 ,加入样品。
实验分组:提取物溶于 DMSO ,用培养基稀释 ,终浓
度分别为 100 ,50 , 25 , 12.5 , 6.25和 3.125 μg/mL ,每个
剂量设 3个复孔;另设阳性对照(甲氨蝶呤 ,MTX)和空
白对照各 1组。各组 DMSO浓度均低于 0.1%。培养
48 h ,加入 10μL 浓度为 10 mg/mL 的MTT 孵育 3 h ,加
入SDS-DMF 裂解液再孵育 8 h ,检测 570 nm 处吸光值。
计算药物对细胞的半抑制浓度(IC50 ,μg/mL),不能计算
的则以最高浓度的抑制率表示(%)。
3　结果与讨论
(1)抗氧化活性
多酚类化合物是多数植物抗氧化活性的主要成
分 ,其含量与提取物的抗氧化活性呈显著的相关性 ,总
酚含量越高 ,其抗氧化活性越强[ 3-4] 。本实验前期中草
药筛选实验表明:约 15%的中药甲醇或氯仿溶剂提取
物总酚含量>50 mg/mL ,约 2.5%的中药甲醇溶剂提
取物总酚含量>150 mg/mL。如表 1所示 ,3种中药提
取物中 ,BC的总酚含量最高 , DTL 的含量最低 ,但都远
低于 150 mg/mL ,说明这 3种提取物的抗氧化活性可
能不强。
表 1　中药提取物总酚含量
Table 1　Total phenolic contents of the herbs
样品名
Herb
总酚含量 Total phenolic
content(Mean±SD , n=3 ,mg/ g)
BC 140.32±4.86
DT L 10.49±2.75
SDH 14.75±0.70
DPPH 是 1种稳定的自由基 ,在甲醇溶剂中呈紫
色 ,并于 5l5 nm 处有最强吸收。当有自由基清除剂存
在时 ,DPPH 的单电子被配对而使其颜色消退。利用
比色法可以检测自由基清除情况 ,从而评价样品的抗
氧化能力[ 5] 。该能力用半清除浓度表示 ,浓度越低 ,抗
氧化能力越强。如表 2所示 ,石上柏和鱼藤提取物对
DPPH 的半清除浓度均介于 149.66±6.50和 235.68
±5.33μg/mL 之间 ,而常用的抗氧化剂 BHT 对DPPH
的半清除浓度仅为 8.18±0.29 μg/mL。本文前期实
验研究表明在选取的近百种中草药中约有 10%的中药
甲醇和氯仿提取物对 DPPH 的半清除浓度 <10
μg/mL 。实验结果表明这 3种中草药中 ,只有枫桦提
取物清除 DPPH自由基的能力较强。
表 2　中药提取物清除 DPPH 活性
Table 2　Free radical scavenging activity on DPPH of
the herb ex tracts
样品名
Sample
半数清除浓度 50% Scavenging concentration
(SC50 ,Mean±SD , n=6 , μg/ mL)
DT L 235.68±5.33
SDH 149.66±6.50
BC 9.68±5.33
BHT 8.18±0.29
(2)细胞毒活性
如表 3所示 ,鱼藤提取物对人肺腺癌 A549 、人乳
腺癌 MCF-7有很强的抑制作用 ,抑制活性高于常用的
抗肿瘤药物甲氨碟呤。文献[ 6]报道 ,鱼藤属植物中的
活性成分鱼藤素能抑制肿瘤细胞凋亡 ,具有潜在抑制
402 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 8 年
肺癌作用 ,这与福建闽南地区民间常用其作抗癌药用
相一致 。活性导向的鱼藤植物中的抗肿瘤活性成分研
究工作尚在进行中。
表 3　中药提取物细胞毒活性
Table 3　Cytotox ic activities of the herb extracts / %
细胞株
Cell line
在 100 μg/ mL 时的抑制率
Inhibit rate a t 100 μg/ mL
DTL BC SDH M TX
PC12 2.19 40.68 26.75 65.36
A549 99.64 35.83 29.17 89.55
MCF-7 95.08 48.46 58.71 78.32
致谢:抗肿瘤研究工作得到香港理工大学于德虎
副教授大力支持 ,在此表示感谢。
参考文献:
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殖细胞凋亡的影响及其机制 [ J] .中华肿瘤杂志 , 2007 , 29(3):
176-180.
Studies on the Cytotoxic and Antioxidant Activities of Extracts from Derris
trifoliate Lour , Betula castata and Selaginella doederleinii Hieron
FANG Yu-Chun1 , ZHU Wei-Ming 1 , GUAN Yong-Guang 2 , GU Qian-Qun1 , WANG Chang-Yun1
(1.Institute of Marine Drugs , Key Laboratory o f Marine Drugs , Ministry of Education , Ocean University of China , Qingdao
266003 , China;2.Colleg e of Food Science , Fujian Ag riculture and Forestry University , Fujian 350002 , China)
Abstract:　The cytotoxic activity on the cell lines of MCF-7 ,A549 and PC12 and the antioxidant activity on 1 ,
1-dipheny l-2-picry lhydrazyl(DPPH)of ex tracts from three tradi tional Chinese herbs Derris tri foliate Lour ,
Betula castata and Selaginel la doederleini i Hieron w ere studied.It indicated that all methanol ext racts from
these herbs show ed cy totoxic activity , of w hich the ext ract f rom Derris tri fol iate Lour had the highest activi-
ty.The ext ract f rom Betula castata still showed a moderate f ree radical scavenging and antioxidant activity.
Further research on the herb Derris tri foliate Lour as an anti tumor medicine is w orth doing.
Key words:　Derris tri foliate Lour;Betula castata ;Selaginella doederleinii Hieron;cy totoxic activity;an-
tioxidant activi ty
责任编辑　于　卫
4033期 方玉春 ,等:鱼藤 、枫桦和石上柏的细胞毒及抗氧化活性初步研究